阅读说明：本技术 人源环状rna在制备心脏疾病相关产品中的应用 (Application of humanized circular RNA in preparation of heart disease related products ) 是由 王建勋 李萌阳 丁巍 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种人源环状RNA在制备心脏疾病相关产品中的应用,涉及生物医药技术领域。应用于制备心脏疾病相关产品的人源环状RNA为含有如SEQ ID NO.1所示序列的核酸,或如SEQ ID NO.1所示序列的核酸的生物活性功能片段、变体或衍生物。将该人源环状RNA应用于制备心脏疾病相关产品中作为诊断标志物能够兼备检测灵敏性和特异性。(The invention provides application of humanized circular RNA in preparation of heart disease related products, and relates to the technical field of biological medicines. The humanized circular RNA applied to preparing heart disease related products is nucleic acid containing a sequence shown as SEQ ID NO.1 or bioactive functional fragments, variants or derivatives of the nucleic acid of the sequence shown as SEQ ID NO. 1. The humanized circular RNA is applied to the preparation of heart disease related products and can have detection sensitivity and specificity when being used as a diagnosis marker.)

人源环状RNA在制备心脏疾病相关产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种人源环状RNA在制备 心脏疾病相关产品中的应用。

背景技术

目前冠心病的诊断主要有临床表现、心电图以及以肌钙蛋白为代表的 血液标志物三种方式，然而以上手段存在特异性、灵敏性、稳定性差等缺 陷，不利于医师及时做出诊断，在心肌发生不可逆转坏死前进行干预和治 疗。因此开发一种改进的冠心病诊断产品势在必行。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种人源环状RNA在制备心脏疾病相关 产品中的应用。

本发明的第二目的在于提供一种非诊断和治疗目的的所述人源环状 RNA的检测方法。

本发明的第三目的在于提供一种包含用于检测所述人源环状RNA的 引物和/或靶向所述人源环状RNA的核酸探针的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种人源环状RNA在制备心脏 疾病相关产品中的应用，所述人源环状RNA包括含有如SEQ ID NO.1所示 序列的核酸，或含有如SEQ IDNO.1所示序列的核酸的生物活性功能片段、 变体或衍生物。

可选地，所述心脏疾病相关产品包括用于诊断、预防或治疗心脏疾病 的产品；

可选地，所述心脏疾病相关产品包括药物或试剂盒。

可选地，所述心脏疾病包括心肌梗死、心衰或心肌损伤。

可选地，所述人源环状RNA作为心脏疾病的诊断标志物；

可选地，所述人源环状RNA作为心肌梗死血液诊断标志物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的 所述人源环状RNA的检测方法，包括使用引物和/或靶向所述人源环状RNA 的核酸探针检测所述人源环状RNA；

可选地，所述引物和所述核酸探针分别独立的包括经过修饰的衍生物。

可选地，所述检测方法包括使用引物扩增靶序列，以检测所述人源环 状RNA；

可选地，所述扩增包括采用PCR方法扩增，优选采用实时定量PCR法；

可选地，所述引物包括circHED特异性引物，所述circHED特异性引 物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

可选地，所述引物还包括内参引物；

可选地，所述内参引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

可选地，所述检测方法包括使用核酸探针与靶序列结合，以检测所述 人源环状RNA；

可选地，采用Northern blotting或ELISA法实现核酸探针与靶序列结合， 以检测所述人源环状RNA。

可选地，利用核酸探针直接对样本中的RNA进行检测，或先将待测样 本中的RNA反转录，得到cDNA，然后再使用引物和/或核酸探针进行检测。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包 含用于检测上述人源环状RNA的引物和/或靶向所述人源环状RNA的核酸 探针。

可选地，所述试剂盒包含用于检测所述人源环状RNA的引物；

可选地，所述引物包括circHED特异性引物，所述circHED特异性引 物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

可选地，所述引物还包括内参引物；

可选地，所述内参引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的人源环状RNA在制备心脏疾病相关产品中的应用中，涉 及的人源环状RNA是在心脏中表达量最高的环状RNA之一，具有较高的 保守性，其功能也与心肌损伤密切相关，在冠心病的诊断、治疗方面具有 极大的意义。同时由于环状RNA稳定、特异的性质，相较于其他类型的标 志物其在患者体液(血液、尿液、唾液等)中丰度更大、变化也更为显著， 因此具备成为新型诊断标志物的潜力。circHED在体液中的高稳定性和组织 细胞特异性，使circHED作为心脏疾病的诊断标志物能够兼备检测灵敏性 和特异性。

本发明提供的试剂盒包含用于检测所述人源环状RNA的引物和/或靶 向所述人源环状RNA的核酸探针，可以检测作为心脏疾病诊断标志物 circHED，具有良好的检测灵敏性和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。

图1为实施例1中分别采用正向引物和反向引物对cDNA和gDNA的 扩增结果；

图2为实施例1中反向产物的测序结果；

图3为实施例2中正常人血液和心梗患者血液中circHED的表达水平；

图4为实施例2中对血液circHED水平的ROC分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种人源环状RNA在制备心脏 疾病相关产品中的应用，所述人源环状RNA包括含有如SEQ ID NO.1所示 序列的核酸，或含有如SEQ IDNO.1所示序列的核酸的生物活性功能片段、 变体或衍生物。

环状RNA是一种具有共价闭合结构的新型RNA，来源于前体mRNA 反向剪切(back-splicing)，其结构稳定，具有较长半衰期，经由细胞死亡释 放或外泌体运输至体液仍可长期存在。环状RNA的表达具有在组织和细胞 水平上特异性，大部份可通过结合蛋白或miRNA调节器官的发育过程、维 持组织细胞的正常生理功能。研究表明多种疾病的发展与组织特异性环状 RNA的表达失调有关，例如各类肿瘤、神经疾病等。

RNA测序数据显示在心脏中存在大量特异性表达的环状RNA，心脏环 状RNA的表达失调与心脏疾病密切相关，如过量的circ-Foxo3能够通过与 ID-1、E2F1、FAK和HIF1α结合将它们限制在细胞质内来促进心肌细胞的 衰老；HRCR能够抑制miR-223的功能，当HRCR表达过低可引起心肌肥 大；在心梗过程中CDR1as的表达升高可抑制miR-7促进心肌细胞的凋亡。

本发明提供的应用中，涉及的人源环状RNA：RNA-Heart-eriched(简 称circHED)，是在心脏中表达量最高的环状RNA之一，circHED包括含有 如SEQ ID NO.1所示序列的核酸，或如SEQ ID NO.1所示序列的核酸的生 物活性功能片段、变体或衍生物。生物活性功能片段指的是人源环状RNA (circHED)的片段，其生物或生理活性基本类似于circHED，在心脏疾病 的样本中相比于正常样本也具有过量表达的特征。circHED的变体指的是 circHED的核酸序列中由于缺失或突变造成的与circHED出现差异的环状 RNA，但保持有circHED的生物和生理活性的核酸分子，即也具有在心脏 疾病的样本中相比于正常样本也具有过量表达的特征。circHED的衍生物包 括含有化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的核酸，所述核酸包 括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA 杂合体。

本发明应用于制备心脏疾病相关产品的circHED是在心脏中表达量最 高的环状RNA之一，具有较高的保守性，其功能也与心肌损伤密切相关， 本发明通过实验证明circHED在心梗患者血液中的表达水平显著高于正常 人血液，可作为新型的心脏疾病血液诊断标志物，在冠心病的诊断、治疗 方面具有极大的意义。此外由于环状RNA稳定、特异的性质，相较于其他 类型的标志物其在患者体液(血液、尿液、唾液等)中丰度更大、变化也更为显著，因此具备成为新型诊断标志物的潜力。circHED在体液中的高稳 定性和组织细胞特异性，使circHED作为心脏疾病的诊断标志物能够兼备 检测灵敏性和特异性。

本发明所述的心脏疾病相关产品中，所述心脏疾病包括但不限于心肌 梗死、心衰或其他类型的心肌损伤等疾病。产品的功能包括但不限于用于 诊断、预防或治疗心脏疾病；产品的类型包括但不限于药物或试剂盒。

一些可选的应用实例如下：circHED可以作为心脏疾病的诊断标志物， 优选作为心肌梗死血液诊断标志物。因此circHED可应用于制备用于诊断 心脏疾病的试剂盒，所述circHED作为诊断试剂盒的诊断标志物，所述诊 断试剂盒通过判断待测样品中的circHED的表达水平来判断患者是否患有 心脏疾病；同时，所述circHED也可以作为诊断试剂盒中的对照样品和/或 质控样品；circHED应用于制备用于预防或治疗心脏疾病的药物，circHED 可以用于作为评价药物效果的标志物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的 检测所述人源环状RNA(circHED)的检测方法，该检测方法包括使用引 物和/或靶向circHED的核酸探针检测circHED。核酸探针指的是能够与 circHED杂交或部分杂交的任何长度的核苷酸的聚合物，核苷酸包括核糖核 苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。引物和核酸探针分别独立的含有天然的嘌呤碱 基和/或嘧啶碱基、经化学或生化修饰的嘌呤碱基和/或嘧啶碱基中的一种多 种；引物和核酸探针还可以分别独立的包括标记物，包括但不限于发光基 团和/或发光基团的猝灭基团、同位素、受体和其配体其中之一，抗原和其 抗体其中之一，或者，酶和其底物其中之一。

非诊断和治疗目的的检测所述人源环状RNA(circHED)的检测方法 的一些实例包括但不限于用于评价或判断待测样品中circHED的存在或含 量对其他生物活性成分的存在或含量的影响；或者以circHED作为研究生 理生化过程的标志物，以研究一些信号通路或其他生理过程的机理等。

在一些可选的实施方式中，使用引物检测circHED的实例包括但不限 于采用PCR方法，使用引物对待测样品中的核酸进行扩增，以检测待测样 品中是否含有circHED。在一些可选的实施方式中，所述引物包括circHED 特异性引物，所述circHED特异性引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。PCR优选采用检测高效，可以定量分析的实时定量PCR法， 采用实时定量PCR法时所述引物优选还包括内参引物，可选地，所述内参 引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。可以理解的是所述内参 引物不局限于实时荧光定量PCR中，当采用其他类型检测方法也需要使用 到内参引物时，也可采用上述内参引物，或具有其他序列的内参引物。

在一些可选的实施方式中，使用核酸探针与靶序列结合以检测 circHED，该检测方法的实例包括但不限于采用Northern blotting或ELISA 法。

在一些可选的实施方式中，利用核酸探针直接对样本中的RNA进行检 测，或先将待测样本中的RNA反转录，得到cDNA，然后再使用引物和/ 或核酸探针进行检测。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒以 所述人源环状RNA的引物和/或靶向所述人源环状RNA的核酸探针，可以 检测作为心脏疾病诊断标志物circHED，具有良好的检测灵敏性和特异性。 引物和核酸探针分别独立的包括天然的嘌呤碱基和/或嘧啶碱基、经化学或 生化修饰的嘌呤碱基和/或嘧啶碱基中的一种多种；引物和核酸探针还可以 分别独立的包括标记物，包括但不限于发光基团和/或发光基团的猝灭基团、 同位素、受体和其配体其中之一，抗原和其抗体其中之一，或者，酶和其 底物其中之一。

可以理解的是，所述试剂盒中除去含有引物和/或核酸探针，还可以包 含本领域可接受的常规试剂和/或耗材。常规试剂的实例包括但不限于用于 PCR扩增的dNTP、盐、酶、荧光染料和缓冲液等，用于反转录的酶和引物 等，用于Northern blotting或ELISA实验的试剂，用于检测探针上标记物的 受体、配体、酶、酶的底物、抗体或抗原等。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含用于扩增所述人源环状 RNA的引物，所述引物包括circHED特异性引物，所述circHED特异性引 物的序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。所述试剂盒中还可以包括 内参引物，内参引物的序列可选地如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

人血液中circHED的鉴定：

采用反向PCR的方法对血液中的circHED进行鉴定。取人血液500μl， 加入500μlTrizol(Takara RNAiso Plus 9108)，上下颠倒离心管数次，室 温静置15min，参照说明书提取总RNA，进一步利用Takara RR0037A反 转录试剂盒、以随机引物Random 6-mer对RNA进行反转录合成cDNA； 另取300μl血液通过TIANGEN血液基因组DNA提取系统(DP349)提取 基因组DNA(gDNA)。利用以血液cDNA或gDNA为模板，利用反向引物 PCR扩增的circHED末端连接部位的序列，正向引物作为对照。将扩增产 物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以cDNA为模板的扩增产物进行sanger测序。

引物序列如下：

circHED正向引物：

F:5’-TGACAGCAGCCTGGAGCATCTT-3’(SEQ ID NO.2)；

R:5’-TGCTTGCCAGCTCGATACCTCT-3’(SEQ ID NO.3)。

circHED反向引物(circHED特异性引物)：

F:5’-TGTGAGTGAGAGCATTGGCA-3’(SEQ ID NO.4)；

R:5’-ATCCCATTGAAAAGGTGGGTGA-3’(SEQ ID NO.5)。

实验结果：

对血液中circHED的表达进行鉴定：由于环状RNA序列的末端共价相 连，因此需要设计反向引物才能够扩增其末端相连部分。PCR结果显示正 向引物能够从cDNA和gDNA中扩增出预计大小的片段；利用反向引物能 从cDNA中扩增出预计大小的片段，而由于形成环状RNA的反向剪切是转 录后进行的，因此无法从gDNA中扩增出产物(图1)。反向产物的测序结果显示circHED序列末端是相连的(图2)，这些鉴定结果证明了circHED 确实存在于血液当中，而且具有较高的表达水平。

实施例2

circHED在心梗患者血液中的水平检测：

该实验分别采集无心血管疾病史的正常人、急性心梗患者血样各50例， 心梗患者需符合以下临床表现：(1)心绞痛持续30min以上；(2)心电图 显示典型的心梗特征；(3)血液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶和肌钙蛋白T或I 等分子标记物含量上升。按实施例1所述方法提取血液RNA并合成cDNA， 以18SrRNA为内参，利用qPCR检测、以2^-ΔΔCT法计算circHED在血液中 的相对表达水平。qPCR试剂盒采用诺唯赞ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，按说明书进行实验操作。引物序列如下：

circHED qPCR引物(circHED特异性引物)：

F:5’-TGTGAGTGAGAGCATTGGCA-3’(SEQ ID NO.4)；

R:5’-ATCCCATTGAAAAGGTGGGTGA-3’(SEQ ID NO.5)。

18SrRNA qPCR引物(内参引物)：

F：5’-TTCGATGGTAGTCGCCGTGCCTA-3’(SEQ ID NO.6)；

R：5’-CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTA-3’(SEQ ID NO.7)。

并利用受试者工作特征(ROC)曲线检测血液circHED水平用以区分 正常人和心梗患者的效果，通过ROC曲线下面积(AUC)评估circHED诊 断心肌梗死的准确性。

实验结果：

检测正常人血液和心梗患者血液中circHED的表达水平：检测结果显 示心梗患者血液circHED水平平均值显著高于正常人，是正常人2倍以上 (图3)。进一步对该结果进行ROC分析，分析显示以血液circHED水平区 分正常人和心梗患者所得到的AUC值为0.8004(图4)，这表明circHED 是理想的心梗诊断标志物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的 普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进 行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或 者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 人源环状RNA在制备心脏疾病相关产品中的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1832

<212> RNA

<213> 人（Home）

<400> 1

uagguuguga caguuggaag ugucauguac aacaugcggc gauuaagucu uucacccacc 60

uuuucaaugg gauuucaucu guuaguuacu gugagucucu uauuuuccca uguggaccau 120

guaauugcug agacagaaau ggaaggagaa ggaaaugaaa cuggugaaug uacuggauca 180

uauuacugua agaaaggggu gauuuugccc auuugggaac cccaagaccc uucuuuuggg 240

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auaaccauaa agaaacccaa uggagagacc accaagacaa cugugaggau cuggaaugaa 420

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cuuaagcaga agcauccaga uaaagaaaua gagcaauuaa uagaauuagc uaacuaccaa 1080

guccuaaguc agcagcaaaa aaguagagca uuuuaucgca uucaagcuac ucgccucaug 1140

acuggagcug gcaacauuuu aaagaggcau gcagcugacc aagcaaggaa ggcugucagc 1200

augcacgagg ucaacacuga agugacugaa aaugacccug uuaguaagau cuucuuugaa 1260

caagggacau aucagugucu ggagaacugu gguacugugg cccuuaccau uauccgcaga 1320

gguggugauu ugacuaacac uguguuuguu gacuucagaa cagaggaugg cacagcaaau 1380

gcugggucug auuaugaauu uacugaagga acuguggugu uuaagccugg ugauacccag 1440

aaggaaauca gaguggguau cauagaugau gauaucuuug aggaggauga aaauuuccuu 1500

gugcaucuca gcaaugucaa aguaucuucu gaagcuucag aagauggcau acuggaagcc 1560

aaucauguuu cuacacuugc uugccucgga ucucccucca cugccacugu aacuauuuuu 1620

gaugaugacc acgcaggcau uuuuacuuuu gaggaaccug ugacucaugu gagugagagc 1680

auuggcauca uggaggugaa aguauugaga acaucuggag cucgaggaaa uguuaucguu 1740

ccauauaaaa ccaucgaagg gacugccaga gguggagggg aggauuuuga ggacacuugu 1800

ggagagcucg aauuccagaa ugaugaaauu gu 1832

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacagcagc ctggagcatc tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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