阅读说明：本技术 一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法及其应用 (Method for identifying tea geometrid by utilizing mitochondrial molecular marker and application thereof ) 是由 蒲德强 刘虹伶 刘超 伍兴隆 肖科军 陈宇 罗曦 毛建辉 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法及其应用,属于分子生物学技术领域,该分子标记包括以下引物：F：5’-TGCTCACGGTGGAAGATCAG-3’；R：5’-AGCTGATGTAAAATAGGCCCGA-3’；该线粒体分子标记具有稳定性好、多态性高、重复性好,并且经过扩增后的条带清晰易读,可有效应用于茶尺蠖鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等领域,为茶尺蠖分子标记辅助选择提供了新的工具,具有良好的应用前景。(The invention discloses a method for identifying tea geometrid by utilizing a mitochondrial molecular marker and application thereof, belonging to the technical field of molecular biology, wherein the molecular marker comprises the following primers: f: 5'-TGCTCACGGTGGAAGATCAG-3', respectively; r: 5'-AGCTGATGTAAAATAGGCCCGA-3', respectively; the mitochondrial molecular marker has the advantages of good stability, high polymorphism and good repeatability, and the amplified band is clear and easy to read, so that the mitochondrial molecular marker can be effectively applied to the fields of ectropis obliqua identification, DNA fingerprint map construction, genetic diversity evaluation, phylogenetic research and the like, provides a new tool for the auxiliary selection of the ectropis obliqua molecular marker, and has good application prospect.)

一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法及其应用。

背景技术

茶尺蠖(Ectropis obliqua hypulina Wehrli)是属于鳞翅目尺蠖蛾科的一种昆虫。是茶园尺螃类中发生最普遍、为害最严重的种类之一。茶尺蠖，幼虫体表较光滑，腹部只有第6腹节和臀节上具足，爬行时体躯一屈一伸，俗称拱背虫、量尺虫、造桥虫等。喜栖在叶片边缘，咬食嫩叶边缘呈网状半透膜斑；后期幼虫常将叶片咬食成较大而光滑的“C”形缺刻。

茶尺蠖常见于长江流域以南各产茶省，尤以江、浙、皖、湘、四川等省发生严重。虽然茶尺蠖危害严重，但是目前采用的预防和防治方式主要是通过化学药剂进行处理，化学药剂的使用可以达到一定的效果，但是长期使用容易造成化学药物残留，并且茶尺蠖还可能产生抗药性，目前为止没有很好的预防方式。

生物预防病虫害是一种有效且环保的方式，但是一直以来对于茶尺蠖自身的遗传信息的研究却少有研究和报道，使得如何利用生物信息防治茶尺蠖的危害受到极大限制。

基于茶尺蠖严重危害，严重影响茶叶种植业的发展，开展茶尺蠖的品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性评价及系统发育关系研究均有重要意义，然而上述工作都依赖于多态性高，重复性好、标记稳定、带型清晰易判读的分子标记的开发。基于此，发明人首次对茶尺蠖线粒体全基因组进行了测序，并对其生物学特性进行了分析，并进行了系统发育分析，以确定其在尺蠖蛾科家族中的地位。这为后期茶尺蠖的鉴定，以及生物防治茶尺蠖危害茶树提供了理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记挑选的引物具有扩增稳定、电泳条带清晰易判读，并且多态性高，重复性好，可有效用于柑橘潜叶蛾鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价及系统发育研究领域。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于鉴定茶尺蠖的线粒体分子标记，包括以下引物：

F：5’-TGCTCACGGTGGAAGATCAG-3’；

R：5’-AGCTGATGTAAAATAGGCCCGA-3’。

本发明还提供一种利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法，包括以下步骤：

(1)提取供试样品中的DNA；

(2)采用上述的线粒体分子标记对供试样品的模板DNA进行PCR，获取PCR扩增产物；

(3)对所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，对电泳检测结果通过分析基本核心SSR结果，确定供试样品的品种。

进一步地，所述供试样品为来自于江苏、浙江、江西、四川不同地区的茶尺蠖。

进一步地，步骤(2)中，扩增体系20μL，包括：5×FastPfuBuffer4μL、2.5mM dNTPs2μL、5μM引物各0.8μL、DNA聚合酶0.4μL、DNA模板10ng，加水补充至20μL；

扩增程序：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min，10℃保存。

进一步地，步骤(3)中，采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

本发明还提供一种上述的线粒体分子标记在辅助茶尺蠖鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究中的应用。

本发明还提供一种上述的方法在辅助茶尺蠖鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用通过严格的筛选过程得到了可以用于鉴定鉴定不同地区茶尺蠖的线粒体分子标记。主要针对分布于长江流域以南各茶省的茶尺蠖为供试样本，基于线粒体基因组对茶尺蠖总科物种进行系统发育关系分析；以线粒体COI基因片段作为分子标记，明确茶尺蠖的种群遗传多样性和种群遗传结构，并进行系统发育分析，为茶尺蠖的防控提供科学依据。

本发明公开利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法，该线粒体分子标记具有稳定性好、多态性高、重复性好，并且经过扩增后的条带清晰易读，可有效应用于茶尺蠖鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等领域，为茶尺蠖分子标记辅助选择提供了新的工具，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为PCR Marker扩增结果鉴定胶图；

图2为2％琼脂糖凝胶电泳检测纯化后PCR产物电泳图；

图3为测序图谱；

图4为茶尺蠖的系统发育树。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种对茶尺蠖进行群体遗传分析、亲缘鉴定或品种鉴定的简便方法。本发明通过大量筛选，采用了两个线粒体基因作为茶尺蠖的遗传分化聚类的分子标记物。通过这两个线粒体基因的核苷酸序列进行流行病学分析可以展示茶尺蠖种间或种内的遗传关系、群体结构和进化时间等；本发明方法实验操作简单，简单结果准确，对于鉴定新发茶尺蠖进化来源以及茶尺蠖的原始感染均有很大帮助。在此基础上，完成了本发明。

茶尺蠖的地域分型

目前，受到广泛认可的流行区域包括浙江、江苏、安徽、湖南、湖北、江西和福建等省，以浙江、江苏、安徽等茶区发生最为严重。

线粒体基因

自上世纪80年代以来，线粒体DNA(mtDNA)分析方法在遗传学、系统分类学、分子生态学、群体遗传及人类学等方面得到了广泛的应用。线粒体DNA具有分子结构简单、无内含子、突变率高、进化速度快、稳定母系遗传、无重组等特点，非常有利于进行遗传进化及亲缘学分析，已经成为相关领域中应用最广泛的分子标记。

近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体遗传研究中，如等位酶、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、微卫星(STR)等。然而线粒体基因作为一种中性的分子标记，因其具有突变率高、进化速度快(是核基因的四倍)、遗传稳定的特点，在日本血吸虫遗传分类鉴定方面，具有更大的优势。

引物组合

本发明的引物组合包括一对引物，所述的引物可以分别扩增出F、R基因，可用于本发明的引物组合中的引物没有特殊限制，可以为任何能够扩增出F、R基因序列的引物，而从这些引物中也可以任意挑选合适的引物进行组合，从而构成本发明的引物组合。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1SSR引物设计

发明人前期对柑橘潜叶蛾的全基因组序列进行了测试，并构建了发育树，如图4所示，确定了其种属地位。针对前期测定的全基因组测序获得的SSR位点，在线粒体每个染色体上随机选择5对，利用重复序列两端的侧翼序列，开展引物设计，设计原则为：

·PCR产物长度范围为100-350bp；

·退火温度Tm为50-70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；

·GC％含量为40-65％；

·引物长度在18-28bp；

·为确保引物的特异性，用于引物设计的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20-23个碱基。

基于上述原则，进行SSR引物设计。

实施例2引物筛选

实施例1过程设计的SSR引物，通过样本的基因组进行PCR扩增。为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。随机选取代表性的样品进行预实验，确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。其获得高质量PCR产物的实验共计1组，截止目前的PCR扩增结果统计如下：

上述筛选出的引物序列如下：

F：5’-TGCTCACGGTGGAAGATCAG-3’；

R：5’-AGCTGATGTAAAATAGGCCCGA-3’。

实施例3利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法

1、线粒体DNA提取

分别提取供试样品线粒体中的基因组DNA：

DNA提取试剂盒：品牌：天根货号：DP304-03；

离心吸附柱法DNA提取操作流程：

·新鲜组织样本加入200μL GA缓冲液，经提取前样本处理，再加入20μl蛋白酶k进行裂解，裂解时间1-3h；

·完成组织裂解后，加入200μL GB缓冲液，进行充分颠倒混匀，于70℃静置10分钟，简短离心去管内壁水珠；

·加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀后，可见絮状沉淀，简短离心以去除管内壁水珠；

·上一步操作后所有溶液及沉淀加入到吸附柱中，12000rpm离心

30秒，弃滤液；

·吸附柱放回收集管中，加入500μL GD缓冲液，12000rpm离心30秒，弃滤液；

·吸附柱放回收集管中，加入600μL PW缓冲液，12000rpm离心30秒，弃滤液；此步骤重复一次；

·将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，弃滤液；吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

·将吸附柱转入干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加

50-200μL洗脱缓冲液，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

2、PCR扩增

利用实施例1合成的引物进行线粒体分子标记的PCR扩增，扩增在PCR仪(ABI9700型)上进行。

具体地，PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μL反应体系：

PCR反应参数：

a.1×(5minutes at 95℃)；

b.35×(30seconds at 95℃；30seconds at 55℃；45seconds at 72℃)；

c.10minutes at 72℃，10℃until halted by user。

3、PCR产物纯化

PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像仪器中将PCR产物切胶回收，用PCR纯化试剂盒3(购自上海生工生物工程有限公司)进行纯化，具体参照说明书进行操作。测序结果如图1和图2所示，图1为PCR扩增结果鉴定胶图，图2为2％琼脂糖凝胶电泳检测纯化后PCR产物，结果显示：753bp处显示清晰的条带，和预期结果相一致，说明所检测的供试样品为茶尺蠖。

4、PCR产物测序

将获得目的条带的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行双向测序。测序结果和预期结果相同，其具体序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还对其进行了一代测序：

将PCR产物进行一代测序。

测序仪：3730测序列分析仪(美国ABI公司)；

测序结果文件：测序图谱(.abl)；

使用说明：峰图文件(.abl)可用Chromas软件或SeqMan软件打开。序列比对可用SeqMan软件。展现结果如图3所示(此处仅做chromas软件打开后的局部序列展示)，测序结果和预期结果相同，其具体序列如SEQ ID No.1所示。

上述利用线粒体分子标记鉴定茶尺蠖的方法中，所筛选的引物测序区域具体为cox1_茶尺蠖，具体的引物相关信息如下表所示。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。