一种用于扩增沙门氏菌的camp引物组及试剂盒和应用
阅读说明：本技术 一种用于扩增沙门氏菌的camp引物组及试剂盒和应用 (CAMP primer group for amplifying salmonella, kit and application ) 是由 杜昱光 毛瑞 梁组源 刘雪连 刘滢 孙明 于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于扩增沙门氏菌(Salmonella)的CAMP引物组及试剂盒。所述CAMP引物组包括以下三组引物组中的一组或两组以上：针对Salmonella的CFSA231完整基因组扩增的引物组、针对Salmonella的CFSA664完整基因组扩增的引物组、针对Salmonella的CFSA1096完整基因组扩增的引物组。CAMP引物组由Salmonella的三个特异保守区域CFSA231基因组、CFSA664基因组、CFSA1096基因组设计获得,各保守区域基因组由6条引物组成,包括序列主引物(NF/NR)一组、外引物(F2/R2)一组、内引物(LF/LR)一组。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强,由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的沙门氏菌。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利,将其制备成为试剂盒可实现对沙门氏菌快速准确的检测。(The CAMP primer group comprises one or more than two of the following three primer groups, namely a primer group for amplifying the complete genome of CFSA231 of Salmonella, a primer group for amplifying the complete genome of CFSA664 of Salmonella and a primer group for amplifying the complete genome of CFSA1096 of Salmonella, wherein the CAMP primer group is obtained by designing the three specific conserved regions of CFSA231, CFSA664 and CFSA1096 of Salmonella, and each conserved region of the genome consists of 6 primers, namely a main sequence primer (NF/NR), an outer primer (F2/R2) and an inner primer (L F/L R).)
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于扩增沙门氏菌的 CAMP引物组及试剂盒和应用。
背景技术
沙门氏菌病(Salmonellosis)是一种由沙门氏菌(Salmonella)引起的在 全球范围内肆虐的公共卫生疾病。其主要病症表现为腹泻、发烧、头痛、腹 部绞痛和呕吐等。沙门氏菌是我国最常见的食源性致病菌。在世界范围内， 几乎所有即食食品和大部分过程标准中均将沙门氏菌列为限量指标。我国由 细菌引起的食物中毒中，70％-80％是由沙门氏菌引起的。主要通过肉类和蛋 类制品传播，在环境中例如粪便、土壤和水中可以保存5个月至2年之久。
目前沙门氏菌的治疗主要通过抗生素进行治疗。根据文献报道，已经分 离出很多能够抵抗多种抗生素的沙门氏菌菌株。这使得对于该疾病的防控显 得尤为重要，而对于该细菌的快速、特异、高灵敏的诊断则为防控中的重要 一环。我国现行检测标准(GB 4789.4-2016)主要通过鉴别培养基以及血清检 测试验进行鉴别。方法复杂，最快需要三天的时间才能得到检测结果，难以 应对海关、防疫站、生产企业等的需求。因此，面向现场的快速、灵敏、高 特异性核酸标志物检测技术研发将为Salmonella的防控提供强有力的保障。
基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Competitive annealing mediatedamplification of nucleic acids，CAMP)是2018年本公司委托中国科 学院过程工程研究所开发的替代环介导恒温扩增(LAMP)的方法(见 CN107446919A)。该方法主要利用2至6种不同的特异性引物识别靶基因的 特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相 比，CAMP反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培 养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地 方检验检疫部门的应用。并且，CAMP还可以大大缩短操作时间，减少样品 污染机会，适合应用于Salmonella的快速诊断。
目前，关于Salmonella的多保守位点的CAMP检测技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是，提供一种用于扩增沙门氏菌的CAMP引物组及试 剂盒和应用。旨在解决现有技术中检测方法复杂、成本高的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明用于扩增沙门氏菌的CAMP引物组，所述CAMP引物组包括以下三 组引物组中的一组或两组以上：针对Salmonella的CFSA231完整基因组 (GenBank:AE014613，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)扩增的引物组、 针对Salmonella的CFSA664完整基因组(GenBank:KT795353，其核苷酸序列 如SEQ ID NO.20所示)扩增的引物组、针对Salmonella的CFSA1096完整基因 组(GenBank:KT795358，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示扩增的引物组。
所述CFSA231完整基因组扩增的引物组包括三对引物，分别为：1-Sa-NF： 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1-Sa-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；1-Sa-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，1-Sa-LR：其核苷酸序列 如SEQ ID NO.4所示；以及，1-Sa-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 1-Sa-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述CFSA664完整基因组扩增的引物组包括三对引物，分别为：2-Sa-NF： 其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，2-Sa-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8 所示；2-Sa-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，2-Sa-LR：其核苷酸序列 如SEQ ID NO.10所示；以及，2-Sa-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示， 2-Sa-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述CFSA1096完整基因组扩增的引物组包括三对引物，分别为： 3-Sa-NF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，3-Sa-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；3-Sa-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，3-Sa-LR：其 核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；以及，3-Sa-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，3-Sa-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
作为优选实施方案，所述CAMP引物组包括三组引物组：CFSA231完整基 因组扩增的引物组，CFSA664完整基因组扩增的引物组，CFSA1096完整基因 组扩增的引物组。
本发明提供的CAMP引物组由Salmonella的三个特异保守区域CFSA231基 因组、CFSA664基因组、CFSA1096基因组(也称靶基因)设计获得，各保 守区域基因组由6条引物组成，包括序列主引物(NF/NR)一组、外引物(F2/R2) 一组、内引物(LF/LR)一组。其中，NF/NR为CAMP的主要引物，NF由靶基 因中段的N区的互补片段Nc与5’端的F1区连接而成，NR由靶基因中段的N区 和3’端的R1c区的互补片段R1连接而成。F2/R2分别为上下游外部引物，F2与靶基因F2区域相同，R2与靶基因的R2c区域互补(所述的靶基因区域在公开 专利CN107446919A中有详细描述)。LF/LR分别为上下游内部引物。具体核苷 酸序列如表1所示：
表1引物序列
序列号
引物名称
核苷酸序列
SEQ ID NO.1
1-Sa-NF
cgtttgcacagctctttggcgcaccgtttgaatcc
SEQ ID NO.2
1-Sa-NR
ccaaagagctgtgcaaacgtcagtgatggacagcgag
SEQ ID NO.3
1-Sa-LF
cggctttgatatcgatctgg
SEQ ID NO.4
1-Sa-LR
gatggcatcaattttcttcgc
SEQ ID NO.5
1-Sa-F2
gattcgtatcggtaccgatcc
SEQ ID NO:6
1-Sa-R2
cgcgatttcctgctggcgc
SEQ ID NO.7
2-Sa-NF
gcttgtcggtaaacgcgatttccatgtcctcgctgtccatcac
SEQ ID NO.8
2-Sa-NR
ggaaatcgcgtttaccgacaagctcagagttcttcgccaccac
SEQ ID NO.9
2-Sa-LF
gtccatcactgaaaagcgc
SEQ ID NO.10
2-Sa-LR
ccaccagacgggaatcagcggcg
SEQ ID NO.11
2-Sa-F2
gcgaagaaaattgatgccatc
SEQ ID NO.12
2-Sa-R2
cagcgacgcgacggtcggctg
SEQ ID NO.13
3-Sa-NF
cgtaaagcttgtcggtaaacgcgtgtcctcgctgtccatcac
SEQ ID NO.14
3-Sa-NR
cgcgtttaccgacaagctttacgagagttcttcgccaccacc
SEQ ID NO.15
3-Sa-LF
ctgaaaagcgccagcagg
SEQ ID NO.16
3-Sa-LR
ccagacgggaatcagcgg
SEQ ID NO.17
3-Sa-F2
gcgaagaaaattgatgcc
SEQ ID NO.18
3-Sa-R2
cggtcggctgaatatc
本发明还提供用于检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述CAMP 引物组。优选地，可以将CAMP引物组放入超纯水中制成工作液。所述引物组 的工作液含1～2μM的F2、R2、LF、LR引物及0.2～0.4μM的NF、NR引物的 混合液。
根据本发明所述的试剂盒，其中，还包括CAMP反应液和CAMP显色液。 进一步地，所述CAMP反应液包括：Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和超纯水。 其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100、 甜菜碱和dNTP。
具体地，所述CAMP反应液体系中各组分如下：
CAMP反应液(25μL体系，溶剂为超纯水)
1～100mM Tris-HCl pH8.8
1～100mM KCl
1～100mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％Triton X-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)。
CAMP显色液可优选Sybr green I，Eva green，羟基萘酚蓝(HNB)和铬 黑T(EBT)等中的一种。
在进行检测时，例如可以使用10～15μL的引物组工作液与CAMP反应液 组成25μL的检测混合液。CAMP显色液加入量可以是100～150μmol/L检测混 合液。
本发明还提供了非疾病诊断目的的沙门氏菌检测方法，包括以下步骤：
1)取核酸样本、CAMP引物组工作液与CAMP反应液混合，制得扩增反 应液；优选采用10～15μL的CAMP引物组工作液与CAMP反应液组成25μL的 扩增反应液；
2)取制得的扩增反应液，60～65℃反应20～80min，优选63℃反应60min， 根据显色结果判断样品是否含有沙门氏菌。
根据本发明所述的检测方法，其中，所述CAMP引物组的工作液中，引物 1-Sa-NF与1-Sa-NR的浓度均为1～2μM，引物1-Sa-LF与1-Sa-LR的浓度均为 1～2μM，引物1-Sa-F2与1-Sa-R2的引物浓度均为0.2～0.4μM；
所述引物2-Sa-NF与2-Sa-NR的浓度均为1～2μM，引物2-Sa-LF与2-Sa-LR 的浓度均为1～2μM，引物2-Sa-F2与2-Sa-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
所述引物3-Sa-NF与3-Sa-NR的浓度均为1～2μM，引物3-Sa-LF与3-Sa-LR 的浓度均为1～2μM，引物3-Sa-F2与3-Sa-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
本发明还提供了上述CAMP引物组以及试剂盒在非疾病诊断目的的沙门 氏菌检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明基于CAMP技术，针对沙门氏菌的三个保守序列分别设 计6条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试 剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的沙门氏菌。并且，由于 本发明提供的引物组具有极高的特异性，在CAMP扩增所需时间短，进 一步缩短了检测的时间，简化了操作。
2，由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的 操作就可完成对沙门氏菌的快速准确检测，因此，适用于沙门氏菌爆发 时，专业程度不高的海关、口岸、养殖场、屠宰场等地的现场快速检测。
3，本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其 制备成为试剂盒可实现对沙门氏菌快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图2为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图3为本发明实施例3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图4为本发明实施例4中的凝胶电泳图。
图5为本发明实施例5中Salmonella基因的可视化检测结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案。下述实施例中所使 用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实 验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照 试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特 殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1应用Eva Green验证对Salmonella 1-Sa的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋 小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制 远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链 DNA数量。
反应溶液组合(25μL)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM 1-Sa-NF/SEQ ID NO.l
1600nM 1-Sa-NR/SEQ ID NO.2
800nM 1-Sa-LF/SEQ ID NO.3
800nM 1-Sa-LR/SEQ ID NO.4
200nM 1-Sa-F2/SEQ ID NO.5
200nM 1-Sa-R2/SEQ ID NO.6
靶基因:Salmonella-1-Sa dsDNA/SEQ ID NO.19
同时设置无靶基因的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为 60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用 于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例2应用Eva Green验证对Salmonella 2-Sa的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋 小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制 远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM 2-Sa-NF/SEQ ID NO.7
1600nM 2-Sa-NR/SEQ ID NO.8
800nM 2-Sa-LF/SEQ ID NO.9
800nM 2-Sa-LR/SEQ ID NO.10
200nM 2-Sa-F2/SEQ ID NO.11
200nM 2-Sa-R2/SEQ ID NO.12
靶基因:Salmonella-2-Sa dsDNA/SEQ ID NO.20
同时设置无靶基因的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为 60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。将荧光检测应用 于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例3应用Eva Green验证对Salmonella 3-Sa的扩增反应
EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋 小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制 远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM 3-Sa-NF/SEQ ID NO.13
1600nM 3-Sa-NR/SEQ ID NO.14
800nM 3-Sa-LF/SEQ ID NO.15
800nM 3-Sa-LR/SEQ ID NO.16
200nM 3-Sa-F2/SEQ ID NO.17
200nM 3-Sa-R2/SEQ ID NO.18
靶基因:Salmonella-3-Sa dsDNA/SEQ ID NO.21
同时设置无靶基因的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为 60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示。将荧光检测应用 于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例4Salmonella基因目标片段扩增产物的凝胶电泳检测
将实施例1～3中获得的扩增产物经过回收之后进行凝胶电游检测 进一步确定。样品于90mV在GelRed预染的(Biotum)1％琼脂糖凝胶 (TAE溶解)电泳1小时。结果在图4中显示，各泳道的标记数字分别 对应样品如下：
1：Salmonella 1-Sa的CAMP扩增产物。
2：Salmonella 2-Sa的CAMP扩增产物。
3：Salmonella 3-Sa的CAMP扩增产物。
实施例5 Salmonella基因目标片段人造DNA片段的可视化检测
羟基萘酚蓝(HNB)是应用于CAMP技术中可视化检测的指示剂。 其原理为：当发生核酸体外扩增反应时会产生大量不溶副产物焦磷酸镁， 从而导致镁离子减少，而HNB为镁离子指示剂故可监测有无扩增反应发 生。当CAMP未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫色； 当CAMP发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。
通过这些引物和可视化试剂进行Salmonella细菌DNA检测的反应溶 液的组合在下面所示。
反应溶液组合(25μL)
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
120μM HNB
以上为可视化检测的所共用的试剂，下述为针对各DNA片段所使用 的引物及靶序列：
1)Salmonella 1-Sa DNA检测引物：
1600nM 1-Sa-NF/SEQ ID NO.l
1600nM 1-Sa-NR/SEQ ID NO.2
800nM 1-Sa-LF/SEQ ID NO.3
800nM 1-Sa-LR/SEQ ID NO.4
200nM 1-Sa-F2/SEQ ID NO.5
200nM 1-Sa-R2/SEQ ID NO.6
靶:Salmonella-1-Sa dsDNA/SEQ ID NO.19
同时设置无靶的对照组。
2)Salmonella 2-Sa DNA检测引物：
1600nM 2-Sa-NF/SEQ ID NO.7
1600nM 2-Sa-NR/SEQ ID NO.8
800nM 2-Sa-LF/SEQ ID NO.9
800nM 2-Sa-LR/SEQ ID NO.10
200nM 2-Sa-F2/SEQ ID NO.11
200nM 2-Sa-R2/SEQ ID NO.12
靶:Salmonella-2-Sa dsDNA/SEQ ID NO.20
同时设置无靶的对照组。
3)Salmonella 3-Sa DNA检测引物：
1600nM 3-Sa-NF/SEQ ID NO.13
1600nM 3-Sa-NR/SEQ ID NO.14
800nM 3-Sa-LF/SEQ ID NO.15
800nM 3-Sa-LR/SEQ ID NO.16
200nM 3-Sa-F2/SEQ ID NO.17
200nM 3-Sa-R2/SEQ ID NO.18
靶:Salmonella-3-Sa dsDNA/SEQ ID NO.21
同时设置无靶的对照组。
结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图5中显示，各反应 管的标记数字分别对应样品如下：
1：Salmonella 1-Sa DNA检测的阳性结果。
2：Salmonella 1-Sa DNA检测的无靶对照组。
3：Salmonella 2-Sa DNA检测的阳性结果。
4：Salmonella 2-Sa DNA检测的无靶对照组。
5：Salmonella 3-Sa DNA检测的阳性结果。
6：Salmonella 3-Sa DNA检测的无靶对照组。
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都 能实现本法，在此不一一列举实施例。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内 容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可 以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之 内。
序列表
<110> 中科芯瑞（苏州）生物科技有限公司
北京大北农科技集团股份有限公司
<120> 一种用于扩增沙门氏菌的CAMP引物组及试剂盒和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
cgtttgcaca gctctttggc gcaccgtttg aatcc 35
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
ccaaagagct gtgcaaacgt cagtgatgga cagcgag 37
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
cggctttgat atcgatctgg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
gatggcatca attttcttcg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
gattcgtatc ggtaccgatc c 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 6
cgcgatttcc tgctggcgc 19
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
gcttgtcggt aaacgcgatt tccatgtcct cgctgtccat cac 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
ggaaatcgcg tttaccgaca agctcagagt tcttcgccac cac 43
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 9
gtccatcact gaaaagcgc 19
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 10
ccaccagacg ggaatcagcg gcg 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 11
gcgaagaaaa ttgatgccat c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 12
cagcgacgcg acggtcggct g 21
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 13
cgtaaagctt gtcggtaaac gcgtgtcctc gctgtccatc ac 42
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 14
cgcgtttacc gacaagcttt acgagagttc ttcgccacca cc 42
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 15
ctgaaaagcg ccagcagg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 16
ccagacggga atcagcgg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 17
gcgaagaaaa ttgatgcc 18
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 18
cggtcggctg aatatc 16
<210> 19
<211> 362
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 19
caaaagattc gtatcggtac cgatcctaca tacgcaccgt ttgaatccaa aaatgcacaa 60
ggtgaattgg tcggctttga tatcgatctg gccaaagagc tgtgcaaacg tatcaacaca 120
cagtgtacgt tcgtggaaaa cccgctggat gcgctgattc cgtctttaaa agcgaagaaa 180
attgatgcca tcatgtcctc gctgtccatc actgaaaagc gccagcagga aatcgcgttt 240
accgacaagc tttacgccgc tgattcccgt ctggtggtgg cgaagaactc tgatattcag 300
ccgaccgtcg cgtcgctgaa aggcaagcgc gtcggcgtgc tacaggggac gacgcaggag 360
ac 362
<210> 20
<211> 450
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 20
ctcgagtaat acgactcact ataggtgacc gtgactcact cagtgaattt gctcgaagac 60
agccataatg ggaaactctg cagcctaaac gggatacctc ccctacaact gggaaagtgc 120
aatgtggcgg gatggctcct gggcaatcca gagtgtgatc ttctactcac tgcaaactca 180
tggtcctaca taatagaaac ttcaaactca gaaaacggaa catgctaccc cggtgaattc 240
atagattatg aagaattaag agagcagcta agttcagttt cttcatttga aaaatttgaa 300
attttcccga aggcaagctc atggccaaat catgagacaa ctaaaggtgt tacagctgca 360
tgctcttact ctggagccag cagtttttac cggaatttgc tgtggataac aaagaaaggg 420
acttcatatc caaaactcag caaatcatac 450
<210> 21
<211> 473
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 21
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