一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合
阅读说明：本技术 一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合 (Screening method for breeding parent variety of high-quality wheat and primer group combination used by same ) 是由 武玉莹 夏先春 何中虎 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合。引物组组合由引物组1—引物组21组成,用于扩增21个STARP标记,每个引物组包括3条引物,63条引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1—SEQ ID NO:63所示。本发明开发的STARP标记,PCR扩增后不用酶切和电泳,可以高通量检测多个样品,大大提高了检测效率,实现了高通量、低成本快速检测的目的,便于筛选用于培育优质小麦的亲本品种,加快育种进程。本发明在辅助筛选小麦品种中具有重要的理论意义和经济价值。(The invention discloses a screening method for breeding parent varieties of high-quality wheat and a primer group combination used by the same. The primer group combination consists of a primer group 1-a primer group 21 and is used for amplifying 21 STARP markers, each primer group comprises 3 primers, and the nucleotide sequences of the 63 primers are sequentially shown as SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 63. The STARP marker developed by the invention does not need enzyme digestion and electrophoresis after PCR amplification, can detect a plurality of samples at high flux, greatly improves the detection efficiency, realizes the purpose of high-flux, low-cost and quick detection, is convenient for screening parent varieties for cultivating high-quality wheat and accelerates the breeding process. The invention has important theoretical significance and economic value in auxiliary screening of wheat varieties.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合。
背景技术
近年来，基于DNA序列多态性的分子标记受到国内外育种家的高度重视。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行选择，不受环境影响，选择结果可靠，而且在聚合有利性状时，可以在回交渗透过程中通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加速育种进程。通过现代分子生物学手段开发控制小麦重要性状的分子标记，对我国小麦育种具有重要意义。
迄今为止，小麦遗传育种中常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、STS、CAPS、DArT、SCAR和SNP。随着小麦基因的克隆，基于小麦功能基因开发的功能标记也逐渐得到应用。在小麦中，几十个重要性状的基因已经克隆，其相应的功能标记为育种家向新品种导入有利基因提供了方便，通过目标选择，并结合感兴趣性状的功能基因的有利等位变异，提高了选择效率，缩短了育种年限。Sun等(2005)和He等(2007)根据小麦PPO基因序列分别开发了多酚氧化酶基因Ppo-A1的功能标记PPO18、Ppo-D1的功能标记PPO16和PPO29，这些标记所检测的等位变异类型能有效反映品种的PPO活性值，为选育低PPO活性的小麦品种提供理论依据和方法。He等(2008，2009)和Wang等(2009)分别开发了黄色素合成途径中八氢番茄红素合成酶基因Psy-A1的功能标记YP7A，Psy-B1的功能标记YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3和Psy-D1的功能标记YP7D-1、YP7D-2，与小麦籽粒中的黄色素含量显著相关，可以通过检测该酶的等位基因型筛选黄色素含量较高(即类胡萝卜素含量较高)、营养价值较好的品种，省去了做成品的步骤，方便了育种家选择优质品种。所以，利用功能标记检测不同小麦品种功能基因的等位基因型，给育种家辅助选择品种提供了很大帮助。尽管这些功能标记在小麦功能基因检测方面已得到部分应用，但操作过程繁琐复杂，需要酶切、电泳，检测效率低。在育种过程中育种家筛选大量后代材料，需要较高成本和较长时间，此方法难以满足生产需要。因此，建立一种快速、高效、便捷检测不同小麦品种功能基因的方法非常必要。
STARP技术(Semi-thermal Asymmetric Reverse PCR，即半热不对称反向PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配和人工错配(引物3’末端第三或第四个碱基)来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物包括5条：2条加荧光修饰的通用PEA引物(Universal Priming Element-adjustablePrimers)，3条等位基因特异性引物。2条通用PEA引物中，除了荧光基团(FAM和HEX)和猝灭基团(Dabsyl)的修饰外，两者在长度上还有4bp的差异，即PEA引物1序列为：5’-FAM-AGCTGGTT(SEQ ID NO:64)-Sp9-GCAACAGGAACCAGCTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCR blocker)；PEA引物2序列为：5’-HEX-ACTGCTCAAGAG(SEQ IDNO:65)-Sp9-GACGCAAGTGAGCAGTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCR blocker)。PEA引物1和PEA引物2的结构示意图见图1。因此STARP技术既可以利用荧光检测，也可以使用聚丙烯凝胶进行检测。在3条特异性引物中，2条上游引物的3′端为等位变异碱基(末端第一个碱基)和错配碱基(末端第3或者第4个碱基)，5′端添加通用接头序列A和B，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。该技术准确率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针和PCR Master Mix，最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增，快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。
发明内容
本发明的目的为检测待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度。
本发明首先保护引物组组合，可由用于扩增GluA1-Indel的引物组1、用于扩增GluA1-SNP的引物组2、用于扩增GluD1-SNP的引物组3、用于扩增Glu-A3e-490SNP的引物组4、用于扩增Glu-A3g-SNP的引物组5、用于扩增Glu-B3b-SNP的引物组6、用于扩增Glu-B3c-SNP的引物组7、用于扩增PpoA1-SNP的引物组8、用于扩增PpoD1-Indel的引物组9、用于扩增PsyA1-Indel的引物组10、用于扩增PsyB1-SNP的引物组11、用于扩增PsyD1-SNP的引物组12、用于扩增ZdsA1-Indel的引物组13、用于扩增LoxB1-SNP的引物组14、用于扩增LcyA1-SNP的引物组15、用于扩增LcyB1-SNP的引物组16、用于扩增PdsB1-SNP的引物组17、用于扩增PodA1-SNP的引物组18、用于扩增PinaD1-Indel的引物组19、用于扩增PinbD1-SNP的引物组20和用于扩增PinbB2-Indel的引物组21中的至少一个组成。
GluA1-Indel和GluA1-SNP可为基于小麦Glu-A1基因开发的STARP标记。
GluD1-SNP可为基于小麦Glu-D1基因开发的STARP标记。
Glu-A3e-490SNP和Glu-A3g-SNP可为基于小麦Glu-A3基因开发的STARP标记。
Glu-B3b-SNP和Glu-B3c-SNP可为基于小麦Glu-B3基因开发的STARP标记。
PpoA1-SNP可为基于小麦Ppo-A1基因开发的STARP标记。
PpoD1-Indel可为基于小麦Ppo-D1基因开发的STARP标记。
PsyA1-Indel可为基于小麦Psy-A1基因开发的STARP标记。
PsyB1-SNP可为基于小麦Psy-B1基因开发的STARP标记。
PsyD1-SNP可为基于小麦Psy-D1基因开发的STARP标记。
ZdsA1-Indel可为基于小麦TaZds-A1基因开发的STARP标记。
LoxB1-SNP可为基于小麦TaLox-B1基因开发的STARP标记。
LcyA1-SNP可为基于小麦TaLcy-A1基因开发的STARP标记。
LcyB1-SNP可为基于小麦TaLcy-B1基因开发的STARP标记。
PdsB1-SNP可为基于小麦TaPds-B1基因开发的STARP标记。
PodA1-SNP可为基于小麦TaPod-A1基因开发的STARP标记。
PinaD1-Indel可为基于小麦Pina-D1基因开发的STARP标记。
PinbD1-SNP可为基于小麦Pinb-D1基因开发的STARP标记。
PinbB2-Indel可为基于小麦Pinb-B2基因开发的STARP标记。
所述引物组组合中，引物组1可包括引物1、引物2和引物3；引物组2可包括引物4、引物5和引物6；引物组3可包括引物7、引物8和引物9；引物组4可包括引物10、引物11和引物12；引物组5可包括引物13、引物14和引物15；引物组6可包括引物16、引物17和引物18；引物组7可包括引物19、引物20和引物21；引物组8可包括引物22、引物23和引物24；引物组9可包括引物25、引物26和引物27；引物组10可包括引物28、引物29和引物30；引物组11可包括引物31、引物32和引物33；引物组12可包括引物34、引物35和引物36；引物组13可包括引物37、引物38和引物39；引物组14可包括引物40、引物41和引物42；引物组15可包括引物43、引物44和引物45；引物组16可包括引物46、引物47和引物48；引物组17可包括引物49、引物50和引物51；引物组18可包括引物52、引物53和引物54；引物组19可包括引物55、引物56和引物57；引物组20可包括引物58、引物59和引物60；引物组21可包括引物61、引物62和引物63；
引物1的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：1自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物2的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：2自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物4的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：4自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物5的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：5自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
引物7的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：7自5′末端起第22至45位所示的核苷酸序列组成；引物8的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：8自5′末端起第22至45位所示的核苷酸序列组成；引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
引物10的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：10自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物11的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：11自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
引物13的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：13自5′末端起第22至44位所示的核苷酸序列组成；引物14的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：14自5′末端起第22至44位所示的核苷酸序列组成；引物15的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
引物16的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：16自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物17的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：17自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物18的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
引物19的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：19自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物20的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：20自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物21的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
引物22的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：22自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物23的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：23自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物24的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
引物25的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：25自5′末端起第22至47位所示的核苷酸序列组成；引物26的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：26自5′末端起第22至48位所示的核苷酸序列组成；引物27的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
引物28的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：28自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物29的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：29自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物30的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；
引物31的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：31自5′末端起第22至43位所示的核苷酸序列组成；引物32的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：32自5′末端起第22至43位所示的核苷酸序列组成；引物33的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示；
引物34的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：34自5′末端起第22至41位所示的核苷酸序列组成；引物35的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：35自5′末端起第22至41位所示的核苷酸序列组成；引物36的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示；
引物37的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：37自5′末端起第22至47位所示的核苷酸序列组成；引物38的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：38自5′末端起第22至47位所示的核苷酸序列组成；引物39的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示；
引物40的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：40自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物41的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：41自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物42的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示；
引物43的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：43自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物44的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：44自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物45的核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示；
引物46的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：46自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物47的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：47自5′末端起第22至39位所示的核苷酸序列组成；引物48的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示；
引物49的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：49自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物50的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：50自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物51的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示；
引物52的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：52自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物53的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：53自5′末端起第22至40位所示的核苷酸序列组成；引物54的核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示；
引物55的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：55自5′末端起第22至41位所示的核苷酸序列组成；引物56的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：56自5′末端起第22至41位所示的核苷酸序列组成；引物57的核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示；
引物58的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：58自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物59的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：59自5′末端起第22至41位所示的核苷酸序列组成；引物60的核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示；
引物61的核苷酸序列由标签序列B和SEQ ID NO：61自5′末端起第22至46位所示的核苷酸序列组成；引物62的核苷酸序列由标签序列A和SEQ ID NO：62自5′末端起第22至48位所示的核苷酸序列组成；引物63的核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示。
引物组1具体可由引物1、引物2和引物3组成。引物组2具体可由引物4、引物5和引物6组成。引物组3具体可由引物7、引物8和引物9组成。引物组4具体可由引物10、引物11和引物12组成。引物组5具体可由引物13、引物14和引物15组成。引物组6具体可由引物16、引物17和引物18组成。引物组7具体可由引物19、引物20和引物21组成。引物组8具体可由引物22、引物23和引物24组成。引物组9具体可由引物25、引物26和引物27组成。引物组10具体可由引物28、引物29和引物30组成。引物组11具体可由引物31、引物32和引物33组成。引物组12具体可由引物34、引物35和引物36组成。引物组13具体可由引物37、引物38和引物39组成。引物组14具体可由引物40、引物41和引物42组成。引物组15具体可由引物43、引物44和引物45组成。引物组16具体可由引物46、引物47和引物48组成。引物组17具体可由引物49、引物50和引物51组成。引物组18具体可由引物52、引物53和引物54组成。引物组19具体可由引物55、引物56和引物57组成。引物组20具体可由引物58、引物59和引物60组成。引物组21具体可由引物61、引物62和引物63组成。
所述引物组组合可以检测待测小麦基于21个STARP标记的基因型，根据基因型进而判断待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度，从而根据育种目的筛选小麦目标亲本。具体的，可根据引物组组合的组成来判断待测小麦的相应性状。
所述引物组1—引物组21均还可包括引物甲和/或引物乙。
所述引物甲从5’至3’依次可包括DNA片段甲、PCR blocker和DNA片段乙；DNA片段甲的核苷酸序列如SEQ ID NO:64所示；DNA片段乙的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5′末端起第1至21位所示。
所述引物甲从5’至3’具体可由DNA片段甲、PCR blocker和DNA片段乙组成。
所述DNA片段甲的5’末端可具有荧光标记甲。所述DNA片段乙可进行猝灭基团修饰。
所述荧光标记甲为FAM荧光标记。所述标签序列A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5′末端起第1至21位所示。
所述引物乙从5’至3’依次可包括DNA片段丙、PCR blocker和DNA片段丁；DNA片段丙的核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示；DNA片段丁的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5′末端起第1至21位所示。
所述引物乙从5’至3’具体可由DNA片段丙、PCR blocker和DNA片段丁组成。
所述DNA片段丙的5’末端可具有荧光标记乙。所述DNA片段丁可进行猝灭基团修饰。
所述荧光标记乙为HEX荧光标记。所述标签序列B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5′末端起第1至21位所示。
所述猝灭基团可为Dabsyl。
引物甲和引物乙中，除了荧光基团(FAM和HEX)和猝灭基团(Dabsyl)的修饰外，两者在长度上还有4bp的差异。
进一步的，引物甲的序列可为：5’-FAM-AGCTGGTT(SEQ ID NO:64)-Sp9-GCAACAGGAACCAGCTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCRblocker)。引物乙的序列为：5’-HEX-ACTGCTCAAGAG(SEQ ID NO:65)-Sp9-GACGCAAGTGAGCAGTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCRblocker)。
进一步的，引物组1具体可由引物1、引物2、引物3、引物甲和引物乙组成。引物组2具体可由引物4、引物5、引物6、引物甲和引物乙组成。引物组3具体可由引物7、引物8、引物9、引物甲和引物乙组成。引物组4具体可由引物10、引物11、引物12、引物甲和引物乙组成。引物组5具体可由引物13、引物14、引物15、引物甲和引物乙组成。引物组6具体可由引物16、引物17、引物18、引物甲和引物乙组成。引物组7具体可由引物19、引物20、引物21、引物甲和引物乙组成。引物组8具体可由引物22、引物23、引物24、引物甲和引物乙组成。引物组9具体可由引物25、引物26、引物27、引物甲和引物乙组成。引物组10具体可由引物28、引物29、引物30、引物甲和引物乙组成。引物组11具体可由引物31、引物32、引物33、引物甲和引物乙组成。引物组12具体可由引物34、引物35、引物36、引物甲和引物乙组成。引物组13具体可由引物37、引物38、引物39、引物甲和引物乙组成。引物组14具体可由引物40、引物41、引物42、引物甲和引物乙组成。引物组15具体可由引物43、引物44、引物45、引物甲和引物乙组成。引物组16具体可由引物46、引物47、引物48、引物甲和引物乙组成。引物组17具体可由引物49、引物50、引物51、引物甲和引物乙组成。引物组18具体可由引物52、引物53、引物54、引物甲和引物乙组成。引物组19具体可由引物55、引物56、引物57、引物甲和引物乙组成。引物组20具体可由引物58、引物59、引物60、引物甲和引物乙组成。引物组21具体可由引物61、引物62、引物63、引物甲和引物乙组成。
上述任一所述引物组组合中，各个引物组的引物单独包装或各个引物组单独包装。
本发明还保护上述任一所述引物组组合的应用，可为x1)至x6)中的任一种：x1)检测待测小麦基于所述21个STARP标记的基因型；x2)制备用于检测待测小麦基于所述21个STARP标记的基因型的试剂盒；x3)检测待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度中的至少一种；x4)制备用于检测待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度中的至少一种的试剂盒；x5)小麦育种；x6)制备用于小麦育种的试剂盒。
本发明还保护一种试剂盒，含有上述任一所述引物组组合；所述试剂盒的用途可为x1)、x3)和x5)中的任一种：x1)检测待测小麦基于所述21个STARP标记的基因型；x3)检测待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度中的至少一种；x5)小麦育种。
上述试剂盒中，各个引物组的引物单独包装。
所述试剂盒具体可由上述任一所述引物组组合组成或各个引物组单独包装。
本发明还保护一种检测待测小麦的面筋强度、多酚氧化酶活性、小麦制品褐变程度、黄色素含量、是否适宜制作面条、过氧化物酶活性、面粉白度、面粉粘性和籽粒硬度中的至少一种的方法，可包括如下步骤：分别检测待测小麦基于所述21个STARP标记的基因型，然后进行如下判断：
“GluA1-Indel的基因型为Del和/或GluA1-SNP的基因型为TT和/或GluD1-SNP的基因型为TT”的待测小麦的面筋强度强于“GluA1-Indel的基因型为Ins和/或GluA1-SNP的基因型为CC和/或GluD1-SNP的基因型为CC”的待测小麦；
“PpoA1-SNP的基因型为TT和/或PpoD1-Indel的基因型为Del”的待测小麦的多酚氧化酶活性低于“PpoA1-SNP的基因型为CC和/或PpoD1-Indel的基因型为Ins”的待测小麦；
“PpoA1-SNP的基因型为TT和/或PpoD1-Indel的基因型为Del”的待测小麦的制品褐变程度小于“PpoA1-SNP的基因型为CC和/或PpoD1-Indel的基因型为Ins”的待测小麦；
“PsyA1-Indel的基因型为Del和/或PsyB1-SNP的基因型为GG和/或PsyD1-SNP的基因型为GG和/或ZdsA1-Indel的基因型为Del和/或LoxB1-SNP的基因型为CC和/或LcyA1-SNP的基因型为AA和/或LcyB1-SNP的基因型为GG和/或PdsB1-SNP的基因型为GG”的待测小麦的黄色素含量高于“PsyA1-Indel的基因型为Ins和/或PsyB1-SNP的基因型为TT和/或PsyD1-SNP的基因型为AA和/或ZdsA1-Indel的基因型为Ins和/或LoxB1-SNP的基因型为GG和/或LcyA1-SNP的基因型为GG和/或LcyB1-SNP的基因型为CC和/或PdsB1-SNP的基因型为CC”的待测小麦；
“PsyA1-Indel的基因型为Del和/或PsyB1-SNP的基因型为GG和/或PsyD1-SNP的基因型为GG和/或ZdsA1-Indel的基因型为Del和/或LoxB1-SNP的基因型为CC和/或LcyA1-SNP的基因型为AA和/或LcyB1-SNP的基因型为GG和/或PdsB1-SNP的基因型为GG”的待测小麦比“PsyA1-Indel的基因型为Ins和/或PsyB1-SNP的基因型为TT和/或PsyD1-SNP的基因型为AA和/或ZdsA1-Indel的基因型为Ins和/或LoxB1-SNP的基因型为GG和/或LcyA1-SNP的基因型为GG和/或LcyB1-SNP的基因型为CC和/或PdsB1-SNP的基因型为CC”的待测小麦适宜制作面条；
“PodA1-SNP的基因型为AA”的待测小麦的过氧化物酶活性高于“PodA1-SNP的基因型为GG”的待测小麦；
“PodA1-SNP的基因型为AA”的待测小麦的面粉白度高于“PodA1-SNP的基因型为GG”的待测小麦；
“PodA1-SNP的基因型为AA”的待测小麦的面粉粘性低于“PodA1-SNP的基因型为GG”的待测小麦；
“PinaD1-Indel的基因型为Del和/或PinbD1-SNP的基因型为AA和/或PinbB2-Indel的基因型为Del”的待测小麦的籽粒硬度高于“PinaD1-Indel的基因型为Ins和/或PinbD1-SNP的基因型为GG和/或PinbB2-Indel的基因型为Ins”的待测小麦。
本发明还保护(A)-(E)中的任一种方法。
本发明保护(A)一种用于培育面筋强度增强小麦的亲本品种的筛选方法，可包括如下步骤：检测小麦基于GluA1-Indel、GluA1-SNP和/或GluD1-SNP的基因型，“GluA1-Indel的基因型为Del和/或GluA1-SNP的基因型为TT和/或GluD1-SNP的基因型为TT”的小麦即为用于培育面筋强度增强小麦的亲本品种。
本发明保护(B)一种用于培育多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品褐变程度减小小麦的亲本品种的筛选方法，可包括如下步骤：检测小麦基于PpoA1-SNP和/或PpoD1-Indel的基因型，将“PpoA1-SNP的基因型为TT和/或PpoD1-Indel的基因型为Del”的小麦即为用于培育多酚氧化酶活性降低和/或小麦制品褐变程度减小小麦的亲本品种。
本发明保护(C)一种用于培育黄色素含量提高和/或更适宜制作面条小麦的亲本品种的筛选方法，包括如下步骤：检测小麦基于PsyA1-Indel、PsyB1-SNP、PsyD1-SNP、ZdsA1-Indel、LoxB1-SNP、LcyA1-SNP、LcyB1-SNP和/或PdsB1-SNP的基因型，将“PsyA1-Indel的基因型为Del和/或PsyB1-SNP的基因型为GG和/或PsyD1-SNP的基因型为GG和/或ZdsA1-Indel的基因型为Del和/或LoxB1-SNP的基因型为CC和/或LcyA1-SNP的基因型为AA和/或LcyB1-SNP的基因型为GG和/或PdsB1-SNP的基因型为GG”的小麦即为用于培育黄色素含量提高和/或更适宜制作面条小麦的亲本品种。
本发明保护(D)一种用于培育过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面粉粘性降低小麦的亲本品种的筛选方法，包括如下步骤：检测小麦基于PodA1-SNP的基因型，将“PodA1-SNP的基因型为AA”的小麦作为亲本进行育种即为用于培育过氧化物酶活性提高和/或面粉白度提高和/或面粉粘性降低小麦的亲本品种。
本发明保护(E)一种用于培育籽粒硬度增加小麦的亲本品种的筛选方法，包括如下步骤：检测小麦基于PinaD1-Indel和/或PinbD1-SNP和/或PinbB2-Indel的基因型，将“PinaD1-Indel的基因型为Del和/或PinbD1-SNP的基因型为AA和/或PinbB2-Indel的基因型为Del”的小麦即为用于培育籽粒硬度增加小麦的亲本品种。
上述任一所述的方法中，检测待测小麦每个STARP标记的基因型的方法可如下：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组组合中的引物组进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，采用仪器分别检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测小麦每个STARP标记的基因型；
(a1)采用引物对1进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦GluA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦GluA1-Indel的基因型为Del；
(a2)采用引物对2进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为CT；
(a3)采用引物对3进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为CT；
(a4)采用引物对4进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为GT；
(a5)采用引物对5进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为TA；
(a6)采用引物对6进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为GA；
(a7)采用引物对7进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为CA；
(a8)采用引物对8进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为CT；
(a9)采用引物对9进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PpoD1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PpoD1-Indel的基因型为Ins；
(a10)采用引物对10进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PsyA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PsyA1-Indel的基因型为Del；
(a11)采用引物对11进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为GT；
(a12)采用引物对12进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为GA；
(a13)采用引物对13进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦ZdsA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦ZdsA1-Indel的基因型为Del；
(a14)采用引物对14进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为CG；
(a15)采用引物对15进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为GA；
(a16)采用引物对16进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为CG；
(a17)采用引物对17进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为CG；
(a18)采用引物对18进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为GA；
(a19)采用引物对19进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PinaD1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PinaD1-Indel的基因型为Ins；
(a20)采用引物对20进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为GA；
(a21)采用引物对21进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测小麦PinbB2-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测小麦PinbB2-Indel的基因型为Ins。
上述任一所述的方法中，检测待测小麦每个STARP标记的基因型的方法可如下：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组组合中的引物组进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物；
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；
(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测小麦基于所述21个STARP标记的基因型。
上述任一所述检测待测小麦每个STARP标记的基因型的方法也属于本发明的保护范围。
上文中，Ins表示插入突变，Del表示缺失突变。
上文中，根据Glu-A1基因、Glu-D1基因、Glu-A3基因、Glu-B3基因、Ppo-A1基因、Ppo-D1基因、Psy-A1基因、Psy-B1基因、Psy-D1基因、TaZds-A1基因、TaLox-B1基因、TaLcy-A1基因、TaLcy-B1基因、TaPds-B1基因、TaPod-A1基因、Pina-D1基因、Pinb-D1基因和Pinb-B2基因的等位变异间的差异设计STARP标记。Glu-A1基因、Glu-D1基因、Glu-A3基因、Glu-B3基因、Ppo-A1基因、Ppo-D1基因、Psy-A1基因、Psy-B1基因、Psy-D1基因、TaZds-A1基因、TaLox-B1基因、TaLcy-A1基因、TaLcy-B1基因、TaPds-B1基因、TaPod-A1基因、Pina-D1基因、Pinb-D1基因和Pinb-B2基因的等位变异序列如实施例中的表1所示。表1中，中括号内加粗斜体碱基为非同义突变位点(SNP或Indel)，STARP标记均在此设计。基于上述18种功能基因开发的21个STARP标记及其扩增的引物对具体见实施例中的表3和表4。
本发明开发的STARP标记，PCR扩增后不用酶切和电泳，可以高通量检测多个样品，大大提高了检测效率，实现了高通量、低成本快速检测的目的，便于筛选用于培育优质小麦的亲本品种，加快育种进程。本发明在辅助筛选小麦品种中具有重要的理论意义和经济价值。
附图说明
图1为PEA引物1和PEA引物2的结构示意图。
图2为采用GluA1-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图3为采用GluA1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图4为采用GluD1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图5为采用Glu-A3e-490SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图6为采用Glu-A3g-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图7为采用Glu-B3b-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图8为采用Glu-B3c-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图9为采用PpoA1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图10为采用PpoD1-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图11为采用PsyA1-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图12为采用PsyB1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图13为采用PsyD1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图14为采用ZdsA1-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图15为采用LoxB1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图16为采用LcyA1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图17为采用LcyB1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图18为采用PdsB1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图19为采用PodA1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图20为采用PinaD1-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图21为采用PinbD1-SNP标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
图22为采用PinbB2-Indel标记检测部分305份小麦材料的基因分型图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的引物均由华大基因(北京)科技有限公司合成。
下述实施例中小麦品种均由国家小麦改良中心提供，公众可从国家小麦改良中心获取。
实施例1、小麦重要品质性状的功能基因的STARP标记及其使用的引物序列的开发
本发明涉及的小麦重要品质功能基因分别为Glu-A1基因、Glu-D1基因、Glu-A3基因、Glu-B3基因、Ppo-A1基因、Ppo-D1基因、Psy-A1基因、Psy-B1基因、Psy-D1基因、TaZds-A1基因、TaLox-B1基因、TaLcy-A1基因、TaLcy-B1基因、TaPds-B1基因、TaPod-A1基因、Pina-D1基因、Pinb-D1基因和Pinb-B2基因。
1、小麦功能基因的等位变异序列的获得
从文献中获得Glu-A1基因、Glu-D1基因、Glu-A3基因、Glu-B3基因、Ppo-A1基因、Ppo-D1基因、Psy-A1基因、Psy-B1基因、Psy-D1基因、TaZds-A1基因、TaLox-B1基因、TaLcy-A1基因、TaLcy-B1基因、TaPds-B1基因、TaPod-A1基因、Pina-D1基因、Pinb-D1基因和Pinb-B2基因的变异序列。
Glu-A1基因和Glu-D1基因的序列及功能标记在文献“New DNA markers for highmolecular weight glutenin subunits in wheat.Liu SX，Chao S，AndersonJA.Theoretical and Applied Genetics(2008)118:177-183”中公开过。
Glu-A3基因的序列及功能标记在文献“Development of STS markers andestablishment of multiplex PCR for Glu-A3 alleles in common wheat(Triticumaestivum L.).Wang LH，Li JY，RJ，Xia XC，He ZH.Journal of Cereal Science(2010)51:305-312”中公开过。
Glu-B3基因的序列及功能标记在文献“Characterization of low-molecular-weight glutenin subunit Glu-B3 genes and development of STS markers in commonwheat(Triticum aestivum L.).Wang LH，Zhao XL，He ZH，Ma W，Appels R，RJ，XiaXC.Theoretical and Applied Genetics(2009)118:525-539”中公开过。
Ppo-A1基因和Ppo-D1基因的序列及功能标记在文献“Allelic variation ofpolyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosome 2A and 2D and developmentof functional markers for the PPO genes in common wheat.He XY，He ZH，Zhang LP，Sun DJ，Morris CF，Fuerst EP，Xia XC.Theoretical and Applied Genetics(2007)115:47-58”中公开过。
Psy-A1基因的序列及功能标记在文献“Characterization of phytoenesynthase 1gene(Psy1)located on common wheat chromosome 7A and development ofa functional marker.He XY，Zhang YL，He ZH，Wu YP，Xiao YG，Ma CX，XiaXC.Theoretical and Applied Genetics(2008)116:213-221”中公开过。
Psy-B1基因的序列及功能标记在文献“Allelic variants of phytoenesynthase 1(Psy1)genes in Chinese and CIMMYT wheat cultivars and developmentof functional markers for flour colour.He XY，He ZH，Ma W，Appels W，XiaXC.Molecular Breeding(2009)23:553-563”中公开过。
Psy-D1基因的序列及功能标记在文献“Cloning and phylogenetic analysis ofphytoene synthase 1(Psy1)genes in common wheat and related species.Wang JW，HeXY，He ZH，Wang H，Xia XC.Hereditas(2009)146:208-256”中公开过。
TaZds-A1基因的序列及功能标记在文献“Allelic variation at the TaZds-A1locus on wheat chromosome 2A and development of a functional marker in commonwheat.Dong CH，Ma ZY，Xia XC，Zhang LP，He ZH.Journal of Integrative Agriculture(2012)11(7):1067-1074”中公开过。
TaLox-B1基因的序列及功能标记在文献“Development of functional markersfor a lipoxygenase gene TaLox-B1 on chromosome 4BS in common wheat.Geng HW，Xia XC，Zhang LP，Qu YY，He ZH.Crop Science(2012)52:568-576”中公开过。
TaLcy-A1基因的序列及功能标记在文献“Lycopene-ε-cyclase(e-LCY3A)isfunctionally associated with quantitative trait loci for flour b*colour onchromosome 3A in wheat(Triticum aestivumL.).Dong CH，Ma ZY，Xia XC，Zhang LP，HeZH.Journal of Integrative Agriculture(2012)11(7):1067-1074”中公开过。
TaLcy-B1基因和TaPds-B1基因的序列及功能标记在硕士毕业论文“普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发，董长海，2011”中公开过。
TaPod-A1基因的序列及功能标记在文献“Mapping quantitative trait locifor peroxidase activity and developing gene-specific markers for TaPod-A1 onwheat chromosome 3AL.Wei J，Geng H，Zhang Y，Liu J，Wen W，Zhang Y，Xia X，Chen X，HeZ.Theoretical and Applied Genetics(2015)128:2067-2076”中公开过。
Pina-D1基因的序列及功能标记在文献“Identification of novelsecaloindoline-a and secaloindoline-b alleles in CIMMYT hexaploid triticalelines.Li GY，He ZH，RJ，Xia XC，Lillemo M，Sun QX.Journal of Cereal Science(2006)43:378-386”中公开过。
Pinb-D1基因的序列及功能标记在文献“Development of simple and co-dominant PCR markers to genotype puroindoline a and b alleles for grainhardness in bread wheat(Triticum aestivum L.).Huang XQ，-Babel A.Journalof Cereal Science(2011)53:277-284”中公开过。
Pinb-B2基因的序列及功能标记在文献“Physical mapping and a new variantof Puroindoline b-2genes in wheat.Chen F，Beecher BS，Morris CF.Theoretical andApplied Genetics(2010)120(4)：745-51.”中公开过。
2、使用Geneious Pro v 11.1.3.软件比对步骤1中的序列，查找非同义突变的SNP或Indel。其中，SNP为单核苷酸多态性位点；Indel为插入或缺失序列。
3、根据等位变异间的差异设计STARP标记。
功能基因的等位变异序列如表1所示。表1中，中括号内加粗斜体碱基为非同义突变位点(SNP或Indel)，可以在此处设计STARP标记。为保证扩增效率和特异性，引物长度为20-30bp，PCR扩增产物长度小于450bp。
表1. 18个功能基因的等位变异序列
4、STARP标记专用引物的开发
STARP标记的开发需要5条引物，其中3条为等位基因特异性引物，包括上游引物2条即引物1和引物2，下游引物1条即引物3；另外PEA1和PEA2为2条通用引物，分别为引物4和引物5。针对SNP位点，上游引物的3’端为等位变异碱基，根据目标中括号内的序列及其前面或后面的序列进行设计；下游引物1条，根据目标中括号后面或前面的序列进行设计。针对Indel位点，上游引物在Indel位点附近设计，引物1在Indel前设计，引物2在Ins序列的末端设计；下游引物在Indel的后面设计。
引物4(PEA1)：5’-FAM-AGCTGGTT(SEQ ID NO:64)-Sp9-GCAACAGGAACCAGCTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCR blocker)。
引物5(PEA2)：5’-HEX-ACTGCTCAAGAG(SEQ ID NO:65)-Sp9-GACGCAAGTGAGCAGTATGAC-3’(下划线为Dabsyl的修饰位置，即猝灭基团修饰；SP9为PCRblocker)。
上游引物由两部分组成：等位基因特异性序列和特异的标签序列(A和B)。等位基因特异性序列的3’末端第3或第4碱基要进行替换，其5’端连接特定的标签序列，一条等位基因特异性序列连接FAM标签序列A：5’-GCAACAGGAACCAGCTATGAC-3’，另一条等位基因特异性序列连接HEX标签序列B：5’-GACGCAAGTGAGCAGTATGAC-3’。下游引物的选择要保证扩增片段的特异性并保证长度为60-450bp。
引物1和引物2的3’端碱基替换原则及5’端特定标签序列的位置见表2。
表2. 6种不同SNP的等位基因特异引物的设计
基于小麦重要的品质性状的功能基因(上述18种功能基因)开发的21个STARP标记及其扩增的引物对具体见表3和表4。
表3.基于小麦重要品质性状的功能基因开发的STARP标记
性状
功能基因
等位基因或单倍型
STARP标记名称
高分子量谷蛋白亚基
Glu-A1
18bp InDel
GluA1-Indel
高分子量谷蛋白亚基
Glu-A1
T/C
GluA1-SNP
高分子量谷蛋白亚基
Glu-D1
T/C
GluD1-SNP
低分子量谷蛋白亚基
Glu-A3
T/G
Glu-A3e-490SNP
低分子量谷蛋白亚基
Glu-A3
A/T
Glu-A3g-SNP
低分子量谷蛋白亚基
Glu-B3
A/G
Glu-B3b-SNP
低分子量谷蛋白亚基
Glu-B3
A/C
Glu-B3c-SNP
多酚氧化酶
Ppo-A1
T/C
PpoA1-SNP
多酚氧化酶
Ppo-D1
31bp InDel
PpoD1-Indel
八氢番茄红素合成酶
Psy-A1
37bp InDel
PsyA1-Indel
八氢番茄红素合成酶
Psy-B1
T/G
PsyB1-SNP
八氢番茄红素合成酶
Psy-D1
A/G
PsyD1-SNP
β-胡萝卜素
TaZds-A1
4bp InDel
ZdsA1-Indel
脂肪氧化酶
TaLox-B1
C/G
LoxB1-SNP
番茄红素
TaLcy-A1
A/G
LcyA1-SNP
番茄红素
TaLcy-B1
C/G
LcyB1-SNP
八氢番茄红素脱氢酶
TaPds-B1
C/G
PdsB1-SNP
过氧化物酶
TaPod-A1
A/G
PodA1-SNP
籽粒硬度
Pina-D1
15380bp InDel
PinaD1-Indel
籽粒硬度
Pinb-D1
A/G
PinbD1-SNP
籽粒硬度
Pinb-B2
12bp InDel
PinbB2-Indel
表4.开发的STARP标记的引物序列(每个STARP标记3条特异引物序列)
注：5’端斜体碱基为上游引物中引入的标签序列A或B，3’端第3或第4个斜体碱基为替换的碱基，3’末端斜体碱基为等位变异碱基。
实施例2、采用实施例1开发的STARP标记检测小麦18个功能基因的基因型(即基于21个STARP标记的基因型)
1、取待测小麦品种的叶片组织，采用高盐低pH法提取叶片全基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别用实施例1开发的用于检测21个STARP标记的引物进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
反应体系为5μL，包括0.45μL 10×NH4+buffer(Bio Basic Inc.，Cat#B600066)、0.8μL浓度为5M的甜菜碱(Real-Times，Cat#RTE3103-02)、0.2μL 1％(w/v)牛血清蛋白(BioDee，China，Cat#DE0800)、0.15μL浓度为50mM的MgCl2(LGC，Cat#10364672)、0.1μL浓度为2.5mM的dNTP(TaKaRa，Cat#4030)、0.05μL浓度为10μM反向引物水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物4水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物5水溶液、0.01μL浓度为10μM AMAS1引物、0.01μL浓度为10μM AMAS2引物、0.05μL浓度为5U/μLTaq DNA聚合酶(TaKaRa，Cat#R001WZ)、1.8μL模板(浓度为30-50ng/μL)和水。其中反向引物为表4中引物名称倒数第2位为“C”的引物，AMAS 1引物为表4中引物名称倒数第2位为“A”的引物，AMAS 2引物为表4中引物名称倒数第2位为“B”的引物。
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性20s，复性2min(第一次的复性温度为56℃，每个循环降温1℃)，共6个循环；94℃变性20s，62℃复性60s，62℃延伸2min，共39个循环；10℃保存。
实验同时设置反应体系中不添加模板的空白对照，每个PCR板一般设置1-2个空白对照。
3、PCR扩增产物的荧光扫描
采用PHERAstarplusSNP分型仪器(LGC公司)分别对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm、发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm、发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575、发射波长为610nm。
4、等位基因分型
采用KlusterCallerTM软件对PHERAstarplusSNP扫描数据分析(具体操作方法参考KlusterCallerTM软件说明书，公众可以直接从LGC公司购买，见网址http://www.lgcgroup.com/products/genotyping-software/klustercaller/#.VfoMoNKl-0F)，根据分析结果确定待测小麦18个功能基因的基因型(即基于21个STARP标记的基因型)：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型；聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型；中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型；显示粉色的样本可能由于DNA质量不好，扩增产物没有被明确分型；左下角显示黑色的样本为空白对照。具体而言，如下：
(a1)采用引物对1进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦GluA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦GluA1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦GluA1-Indel的基因型未知；
(a2)采用引物对2进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型为CT；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦GluA1-SNP的基因型未知；
(a3)采用引物对3进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型为CT；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦GluD1-SNP的基因型未知；
(a4)采用引物对4进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型为GT；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦Glu-A3e-490SNP的基因型未知；
(a5)采用引物对5进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型为TA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦Glu-A3g-SNP的基因型未知；
(a6)采用引物对6进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型为GA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦Glu-B3b-SNP的基因型未知；
(a7)采用引物对7进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型为CA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦Glu-B3c-SNP的基因型未知；
(a8)采用引物对8进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型为CT；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PpoA1-SNP的基因型未知；
(a9)采用引物对9进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PpoD1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PpoD1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PpoD1-Indel的基因型未知；
(a10)采用引物对10进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PsyA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PsyA1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PsyA1-Indel的基因型未知；
(a11)采用引物对11进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为TT；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型为GT；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PsyB1-SNP的基因型未知；
(a12)采用引物对12进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型为GA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PsyD1-SNP的基因型未知；
(a13)采用引物对13进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦ZdsA1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦ZdsA1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦ZdsA1-Indel的基因型未知；
(a14)采用引物对14进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型为CG；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦LoxB1-SNP的基因型未知；
(a15)采用引物对15进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型为GA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦LcyA1-SNP的基因型未知；
(a16)采用引物对16进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型为CG；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦LcyB1-SNP的基因型未知；
(a17)采用引物对17进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为CC；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型为CG；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PdsB1-SNP的基因型未知；
(a18)采用引物对18进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型为GA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PodA1-SNP的基因型未知；
(a19)采用引物对19进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PinaD1-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PinaD1-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PinaD1-Indel的基因型未知；
(a20)采用引物对20进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为GG；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为AA；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现绿色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型为GA；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PinbD1-SNP的基因型未知；
(a21)采用引物对21进行PCR扩增，若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现蓝色，则待测小麦PinbB2-Indel的基因型为Del；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现红色，则待测小麦PinbB2-Indel的基因型为Ins；若待测小麦的PCR扩增产物的荧光信号数据经KlusterCallerTM软件分析呈现粉色，则待测小麦PinbB2-Indel的基因型未知。
实施例3、采用实施例1开发的STARP标记检测小麦18个功能基因的基因型的方法在育种中的应用
40份小麦推广品种和育种材料(简称40份小麦材料)的名称见表5中第2列。
表5-1
表5-2
表5-3
表5-4
表5-5
表5-6
表5-7
注：“-”表示未检出，√表示一致，X表示不一致，h表示杂合体。
305份小麦推广品种和育种材料(简称305份小麦材料)的名称见表6中第2列。
表6-1
表6-2
表6-3
注：“-”表示未检出，h表示杂合体。
1、采用实施例1开发STARP标记检测40份小麦材料和305份小麦材料的18个功能基因的基因型，具体检测方法见实施例2，获得各个品种18个功能基因的基因型。
部分小麦材料的基因分型结果见图2至图22。
40份小麦材料的检测结果见表5中STARP标记检测。
305份小麦材料的检测结果见表6。统计结果见表7中第3列。
2、采用功能标记检测40份小麦材料和305份小麦材料，获得各个品种18个功能基因的基因型。
功能标记检测方法如下：
(1)Glu-A1和Glu-D1基因的基因型检测参照文献“New DNA markers for highmolecular weight glutenin subunits in wheat.Liu SX，Chao S，AndersonJA.Theoretical and Applied Genetics(2008)118:177-183”中记载方法进行；
(2)Glu-A3(Glu-A3e和Glu-A3g)基因的基因型检测参照文献“Development ofSTS markers and establishment of multiplex PCR for Glu-A3 alleles in commonwheat(Triticum aestivum L.).Wang LH，Li JY，RJ，Xia XC，He ZH.Journal ofCereal Science(2010)51:305-312”中记载方法进行；
(3)Glu-B3(Glu-B3b和Glu-B3c)基因的基因型检测参照文献“Characterizationof low-molecular-weight glutenin subunit Glu-B3 genes and development of STSmarkers in common wheat(Triticum aestivum L.).Wang LH，Zhao XL，He ZH，Ma W，Appels R，RJ，Xia XC.Theoretical and Applied Genetics(2009)118:525-539”中记载方法进行；
(4)Ppo-A1基因和Ppo-D1基因的基因型检测参照文献“Allelic variation ofpolyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosome 2A and 2D and developmentof functional markers for the PPO genes in common wheat.He XY，He ZH，Zhang LP，Sun DJ，Morris CF，Fuerst EP，Xia XC.Theoretical and Applied Genetics(2007)115:47-58”中记载方法进行；
(5)Psy-A1基因的基因型检测参照文献“Characterization of phytoenesynthase 1gene(Psy1)located on common wheat chromosome 7A and development ofa functional marker.He XY，Zhang YL，He ZH，Wu YP，Xiao YG，Ma CX，XiaXC.Theoretical and Applied Genetics(2008)116:213-221”中记载方法进行；
(6)Psy-B1基因的基因型检测参照文献“Allelic variants of phytoenesynthase 1(Psy1)genes in Chinese and CIMMYT wheat cultivars and developmentof functional markers for flour colour.He XY，He ZH，Ma W，Appels W，XiaXC.Molecular Breeding(2009)23:553-563”中记载方法进行；
(7)Psy-D1基因的基因型检测参照文献“Cloning and phylogenetic analysisof phytoene synthase 1(Psy1)genes in common wheat and related species.WangJW，He XY，He ZH，Wang H，Xia XC.Hereditas(2009)146:208-256”中记载方法进行；
(8)TaZds-A1基因的基因型检测参照文献“Allelic variation at the TaZds-A1locus on wheat chromosome 2A and development of a functional marker in commonwheat.Dong CH，Ma ZY，Xia XC，Zhang LP，He ZH.Journal of Integrative Agriculture(2012)11(7):1067-1074”中记载方法进行；
(9)TaLox-B1基因的基因型检测参照文献“Development of functional markersfor a lipoxygenase gene TaLox-B1 on chromosome 4BS in common wheat.Geng HW，Xia XC，Zhang LP，Qu YY，He ZH.Crop Science(2012)52:568-576”中记载方法进行；
(10)TaLcy-A1基因的基因型检测参照文献“Lycopene-ε-cyclase(e-LCY3A)isfunctionally associated with quantitative trait loci for flour b*colour onchromosome 3A in wheat(Triticum aestivumL.).Dong CH，Ma ZY，Xia XC，Zhang LP，HeZH.Journal of Integrative Agriculture(2012)11(7)：1067-1074”中记载方法进行；
(11)TaLcy-B1基因和TaPds-B1基因的基因型检测参照硕士毕业论文“普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发，董长海，2011”中记载方法进行；
(12)TaPod-A1基因的基因型检测参照文献“Mapping quantitative trait locifor peroxidase activity and developing gene-specific markers for TaPod-A1 onwheat chromosome 3AL.Wei J，Geng H，Zhang Y，Liu J，Wen W，Zhang Y，Xia X，Chen X，HeZ.Theoretical and Applied Genetics(2015)128:2067-2076”中记载方法进行；
(13)Pina-D1基因的基因型检测参照文献“Identification of novelsecaloindoline-a and secaloindoline-b alleles in CIMMYT hexaploid triticalelines.Li GY，He ZH，RJ，Xia XC，Lillemo M，Sun QX.Journal of Cereal Science(2006)43:378-386”中记载方法进行；
(14)Pinb-D1基因的基因型检测参照文献“Development of simple and co-dominant PCR markers to genotype puroindoline a and b alleles for grainhardness in bread wheat(Triticum aestivum L.).Huang XQ，-Babel A.Journalof Cereal Science(2011)53:277-284”中记载方法进行；
(15)Pinb2-B2基因的基因型检测参照文献“Physical mapping and a newvariant of Puroindoline b-2genes in wheat.Chen F，Beecher BS，MorrisCF.Theoretical and Applied Genetics(2010)120(4):745-51”中记载方法进行。
40份小麦材料的检测结果见表5中功能标记检测。
305份小麦材料的检测统计结果见表7中第4列。
结果表明，40份小麦材料中，使用STARP标记检测为一类基因型的品种，用功能标记检测也只有一种等位基因；使用STARP标记检测为另一类基因型的品种，用功能标记检测也得出另一种等位基因。通过比较，一类基因型携带一种等位基因，另一类基因型携带另一种等位基因，STARP标记检测与功能标记检测的一致性大于95％，说明两种标记具有高度相等的检测效果(见表5中的一致性)。
305份小麦材料中，STARP标记检测和功能标记检测的基因型频率完全相同(见表7中第5列)。
3、按常规的表型调查方法检测305份小麦材料的表型性状，进行三次重复试验，结果取平均值。
八分钟峰值带宽的测定方法参考美国谷物化学师协会标准AACC 54-40方法。
黄色素含量的测定方法参考美国谷物化学师协会标准AACC p14-15。
过氧化物酶活性的测定方法参考如下文献：Mapping quantitative trait locifor peroxidase activity and developing gene-specific markers for TaPod-A1 onwheat chromosome 3AL.Wei J，Geng H，Zhang Y，Liu J，Wen W，Zhang Y，Xia X，Chen X，HeZ.Theor Appl Genet.2015July。
多酚氧化酶活性的测定方法参考如下文献：An improved whole-seed assay forscreening wheat germplasm for polyphenol oxidase activity.Anderson,J.V.，andMorris，C.F.2001.Crop Science.41:1697-1705。
籽粒硬度指数采用瑞典PERTEN公司生产的4100型单籽粒硬度仪测定，每个品种的结果为该品种300个籽粒的平均值。
4、从基因型角度将305份小麦材料分类，结合小麦的表型数据，分别计算各类品种的表型平均值。
检测结果见表7中第6列。经T测验及方差分析可知，不同基因型的品种间表型性状具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。
表7
注：八分钟峰值带宽的单位为％，多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性的单位为U·g-1·min-1，黄色素含量的单位为μg·g-1。*表型数据后面的字母不同，表明两种基因型品种的表型值之间差异显著(P<0.01或P<0.05)。
结果表明，培育强筋小麦，可选用GluA1-Indel、GluA1-SNP、GluD1-SNP检测基因型分别为Del、TT、TT的品种作为亲本进行育种；培育多酚氧化酶活性较低且小麦制品馒头和面条褐变减少的品种，可选用PpoA1-SNP、PpoD1-Indel检测基因型为TT、Del的品种作为亲本进行育种；培育黄色素含量高且适宜做面条的品种，可选用PsyA1-Indel、PsyB1-SNP、PsyD1-SNP、ZdsA1-Indel、LoxB1-SNP、TaLcy-A1-SNP、TaLcy-B1-SNP、PdsB1-SNP检测基因型为Del、GG、GG、Del、CC、AA、GG、GG的品种作为亲本进行育种；培育过氧化物酶活性较高、面粉白度提高且面粉粘性降低的品种，可选用TaPod-A1-SNP检测基因型为AA的品种作为亲本进行育种；培育适宜做面包或馒头的硬质麦，可选用Pina-D1-Indel、Pinb-D1-SNP、Pinb-B2-Indel检测基因型为Del、AA、Del的品种作为亲本进行育种。
上述结果表明，采用实施例1开发的STARP标记检测小麦18个功能基因的基因型，可以辅助筛选含有利等位变异的小麦品种。该方法准确可靠、方便快捷，而且提高了选择效率，可以加快育种进程。
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合
<160>65
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
gacgcaagtg agcagtatga ccaacggcca ggacacgga 39
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>2
gcaacaggaa ccagctatga ccaacggcca ggacaaagt 39
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>3
ctgttgcgga gaagttaggt agtatt 26
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>4
gacgcaagtg agcagtatga cggcctggat agtatgaaat ct 42
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>5
gcaacaggaa ccagctatga cggcctggat agtatgaacc cc 42
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>6
caccacagca actccaacaa agtatac 27
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>7
gacgcaagtg agcagtatga cgcagaagtg tggatgtttg tacat 45
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>8
gcaacaggaa ccagctatga cgcagaagtg tggatgtttg tctac 45
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>9
cttagaagct ttgagtggcc gt 22
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>10
gcaacaggaa ccagctatga caatgaaaac cttcctcgcc tg 42
<210>11
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>11
gacgcaagtg agcagtatga caatgaagac cttcctcgtt tt 42
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>12
gttgctgtga aatttgcgca ac 22
<210>13
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>13
gacgcaagtg agcagtatga cctaaacaac ggtgatccaa ttaa 44
<210>14
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>14
gcaacaggaa ccagctatga cctaaacaac ggtgatccaa ccat 44
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>15
gtgtcaatgt gccgttgtac ga 22
<210>16
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>16
gcaacaggaa ccagctatga cccaaaatca ggtgtaaaag tgacag 46
<210>17
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>17
gacgcaagtg agcagtatga cccaaaatcg ggtgtaaaag tgctaa 46
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>18
tgccttattc gctttacatg tcatg 25
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>19
gacgcaagtg agcagtatga cgcaaatgtt gcagcaaaga 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>20
gcaacaggaa ccagctatga cgcaaatgtt gcagcagcgc 40
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>21
ctgttggggt tgggaaacg 19
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>22
gcaacaggaa ccagctatga cgagcaacac tgactttacc 40
<210>23
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>23
gacgcaagtg agcagtatga cgagcaacac tgacttccct 40
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>24
cctcctcctc ctcgtccttt 20
<210>25
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>25
gcaacaggaa ccagctatga ccaagaatcc ctaaacaaaa tgagtag 47
<210>26
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>26
gacgcaagtg agcagtatga caaaatattg gggtttgttt tgcgaaaa 48
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>27
atgaccagtg gttctgtggt tac 23
<210>28
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>28
gacgcaagtg agcagtatga cccatctacg gtaatctgaa aactca 46
<210>29
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>29
gcaacaggaa ccagctatga cccatctacg gtaatctgaa aatccg 46
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>30
gagcaacaat ggagggtcca aa 22
<210>31
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>31
gacgcaagtg agcagtatga ccacgatgtt tctatttgcc att 43
<210>32
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>32
gcaacaggaa ccagctatga cagcaatgtt tctatttgcc atg 43
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>33
atggagctag tttcattttc acttcagat 29
<210>34
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>34
gacgcaagtg agcagtatga ctcttgtacc tcgccttttt a 41
<210>35
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>35
gcaacaggaa ccagctatga ctcttgtacc tcgccttcct g 41
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>36
ccagcccttc aaggacatga t 21
<210>37
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>37
gacgcaagtg agcagtatga ccctcacacg agtttatata atcctat 47
<210>38
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>38
gcaacaggaa ccagctatga ccctcacacg agtttatata atcctcc 47
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>39
cacaagctgc acccaacaaa aga 23
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>40
gcaacaggaa ccagctatga cctcggcggc agcgctgac 39
<210>41
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>41
gacgcaagtg agcagtatga cctcggcggc agcgccaag 39
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>42
cgacagccgg ctctccaa 18
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>43
gcaacaggaa ccagctatga cttggctgtg gtccagtcg 39
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>44
gacgcaagtg agcagtatga cttggctgtg gtccaacca 39
<210>45
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>45
ccaatgagac caacagtgag tccttta 27
<210>46
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>46
gacgcaagtg agcagtatga caaccaagga atcctcacg 39
<210>47
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>47
gcaacaggaa ccagctatga caaccaagga atccttgcc 39
<210>48
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>48
gccctggact aagtatttcc tttttcaa 28
<210>49
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>49
gacgcaagtg agcagtatga ccatattgca atctctatga ggccag 46
<210>50
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>50
gcaacaggaa ccagctatga ccatattgca atctctatga ggttac 46
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>51
ggcagaaatg tattagcaaa caaaacc 27
<210>52
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>52
gcaacaggaa ccagctatga cagtggcgca gggcctgccg 40
<210>53
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>53
gacgcaagtg agcagtatga cagtggcgca gggcctatca 40
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>54
ggactccgcc ctggggcaga g 21
<210>55
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>55
gacgcaagtg agcagtatga caactgccaa caacttcgct a 41
<210>56
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>56
gcaacaggaa ccagctatga cttgtctagt accccgctct g 41
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>57
atgaaggccc tcttcctcat agg 23
<210>58
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>58
gacgcaagtg agcagtatga cgcccacaaa atggtggcca ga 42
<210>59
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>59
gcaacaggaa ccagctatga cgcccacaaa atggtggacg g 41
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>60
cttggatcac tcgccggata gaa 23
<210>61
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>61
gacgcaagtg agcagtatga cgcacctagc aataaataaa cggaag 46
<210>62
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>62
gcaacaggaa ccagctatga cagaaaaaag ccattaaata aacgagac 48
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>63
tgttttggtg gtggtgaaga tga 23
<210>64
<211>8
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>64
agctggtt 8
<210>65
<211>12
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>65
actgctcaag ag 12