用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用

文档序号：1320949 发布日期：2020-07-14 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用 (Nucleic acid sequence, kit and method for detecting measles virus by isothermal amplification and application ) 是由苏秀兰温永俊韩汶延段蓉郑利英于 2019-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及病毒检测领域,具体讲,涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用。本发明的核酸序列包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。本发明试剂盒及检测方法具有特异性好、灵敏度高、步骤简单、可重复性高的技术优势。(The invention relates to the field of virus detection, in particular to a nucleic acid sequence for detecting measles virus by isothermal amplification, a kit, a detection method and application. The nucleic acid sequence of the invention comprises a strand displacement primer sequence shown by SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2, a probe shown by SEQ ID No.3 and SEQ ID No.4 and a cross amplification primer sequence shown by SEQ ID No. 5. The kit and the detection method have the technical advantages of good specificity, high sensitivity, simple steps and high repeatability.)

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用。

背景技术

继全球消除脊髓灰质炎后，世界卫生组织(WHO)把消除麻疹作为下一目标。随着各国的不懈努力,近年全球麻疹发病数和发病率呈下降态势，但仍未达到消除水平。麻疹是一种由麻疹病毒引发的急性呼吸道传染病。麻疹病毒(measles virus，MV)属于副粘病毒科麻疹病毒属，具有高度的传染性，常伴有发热、皮疹、咳嗽、结膜炎等表现。发病率较高，感染人体后可引起麻疹及严重的并发症，包括巨细胞肺炎、包涵体脑炎等。虽然近年来随着麻疹疫苗大规模使用，麻疹发病率和死亡率大幅度降低，但麻疹在各地的局部爆发仍时有发生。早期进行诊断并采取预防措施可有效降低发病率。由于麻疹与幼儿急疹、药疹、风疹等疾病的相关症状极为相似，使鉴别难度加大。

目前，临床上常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、实时荧光定量PCR等。其中ELISA是传统的应用于麻疹早期诊断的方法，患者在麻疹发作早期，体内尚未产生IgM或所产生的IgM水平较低，通常在10～15d才可上升至高峰,因此在出疹后3d内利用ELISA法检测血清标本，可能出现假阴性结果，若此时对结果作出判定，可能出现误诊现象，延误治疗。而实时荧光定量RT-PCR是较为新型的利用分子生物学进行诊断的方法。PCR技术具有检测敏感性高，操作简单、快速等优点，然而其前期投入费用较大(对实验室功能分区以及PCR仪的依赖)，而且易受实验室污染而导致假阳性。所以，亟待建立一种快速、可靠的，适合基层单位和现场应用的MV核酸检测技术。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列。

本发明的第二发明目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒。

本发明的第三发明目的在于提出一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的方法。

本发明的第四发明目的在于提出该核酸序列在检测麻疹病毒中的应用。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，所述核酸序列包含SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。

优选的，SEQ ID No.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQ ID No.4所示探针序列的5’端连接有生物素。

本发明还涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包含恒温扩增试剂，所述恒温扩增试剂中含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。

优选的，SEQ ID No.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQ ID No.4所示探针序列的5’端连接有生物素。

优选的，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示链置换引物的浓度均为0.1μM、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的探针的浓度为0.3～0.5μM、SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.6μM。

优选的，所述恒温扩增试剂中还含有1×Bst Buffer、甜菜碱、MgSO4、dNTPs、RNase保护剂、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶；

优选的，所述恒温扩增试剂中含有20mM Tris-HCl(pH＝8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1M MgSO₄、10×Thermo pol buffer、5M甜菜碱、8U/μl Bst DNA聚合酶、10U AMV逆转录酶、10mM dNTPs、25×RNA secure。

优选的，所述试剂盒中还含有RNA提取试剂。

优选的，所述试剂盒中还含有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为麻疹病毒N基因片段的体外转录产物；所述阴性对照为灭菌去离子水。

优选的，所述试剂盒还包括检测试纸条；优选的，所述检测试纸条选自垂直流动核酸试纸条防污染检测装置，所述垂直流动核酸试纸条防污染检测装置包括一衬垫，所述衬垫由下向上依次设置有样品垫、有色颗粒结合物垫、纤维膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠；所述纤维膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有抗荧光素抗体，所述质控线上包被有生物素，所述有色颗粒结合物垫上的有色颗粒包被有亲和素。

本发明还涉及一种恒温扩增检测麻疹病毒的方法，至少包括以下步骤：

(1)提取待检标本中提取病毒RNA；

(2)将步骤(1)提取得到的病毒RNA作为模板加入到装有恒温扩增试剂的PCR管中；所述恒温扩增试剂中含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列；

优选的，58～62℃扩增反应80～100min，78～82℃酶灭活2～3min；

更优选的，恒温扩增条件为：60℃扩增反应90min，80℃酶灭活2min。

(3)采用检测试纸条进行检测，优选采用垂直流动核酸试纸条防污染检测装置进行检测。

本发明还涉及上述核酸序列在麻疹病毒检测中的应用。

本发明的技术方案至少具有以下有益的效果：

本发明的用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列的特异性好，由于本发明的核酸序列在检测过程中加入了两根特异性探针，从而确保了结果的准确性。

本发明检测方法的灵敏度高。与琼脂糖凝胶电泳比较，检测灵敏度提高近100～200倍。

本发明检测方法的步骤简单，可重复性高：只需要按照试剂盒的说明书经过简单的操作处理即可，且整个反应过程不需要复杂的仪器。

本发明检测方法还具有快速、全封闭检测的技术优势。单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时。整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会。

本发明检测方法的适用性好，可同时满足高通量和低通量的样品检测。

附图说明：

图1为垂直流动核酸试纸条防污染检测装置的结构示意图；

图2为垂直流动核酸试纸条防污染检测装置的阳性结果的原理示意图；

图3为实施例3的对比结果图；

图4为实施例4的对比结果图；

图5为实施例5的对比结果图；

图6为实施例6的检测结果图；

图7为实施例7的检测结果图。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

具体实施方式

本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种适合基层单位和现场应用的，能够快速、灵敏、准确地检测麻疹病毒核酸的恒温扩增检测核酸序列、试剂盒及方法。

本发明实施例涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列，包含SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQID No.5所示的交叉扩增引物序列。

其中，SEQ ID No.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQ ID No.4所示探针序列的5’端连接有生物素。

引物序列的具体核苷酸序列如表1所示：

表1：

可选的，SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接的荧光素选自FITC，并不限于此。

在本发明实施例的核酸序列中，包含两条链置换引物序列、一条交叉引物和两条检测探针。本发明实施例中的5条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。

本发明实施例还涉及一种用于恒温扩增检测麻疹病毒的试剂盒，试剂盒包含恒温扩增试剂，恒温扩增试剂中含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的链置换引物序列、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示的探针和SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物序列。

优选的，SEQ ID No.3所示探针序列的5’端连接有荧光素，SEQ ID No.4所示探针序列的5’端连接有生物素。可选的，SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接的荧光素选自FITC，并不限于此。

可选的，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示链置换引物的浓度均为0.1μM、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的探针的浓度为0.3～0.5μM、SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.6μM。进一步优选的，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探针的浓度均为0.3μM。本发明实施例通过对引物探针浓度的优化，使试剂盒的检测灵敏度可达到100拷贝分子/反应，从而满足快速检测麻疹病毒的需要。

可选的，恒温扩增试剂中还含有1×Bst Buffer、甜菜碱、MgSO₄、dNTPs、RNase保护剂、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶；

优选的，每20μl的恒温扩增试剂中含有1×Bst Buffer 2μl、甜菜碱4μl、MgSO₄0.6μl、dNTPs 0.8μl、RNase保护剂0.8μl、Bst DNA聚合酶1μl、AMV逆转录酶0.1μl。

其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μl，AMV逆转录酶的活性单位为10U/μl。

其中，1×Bst Buffer中含有20mM Tris-HCl(pH＝8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10×Thermo pol buffer。

优选的，MgSO₄的浓度为1M，dNTPs的浓度为10mM，甜菜碱的浓度为5M，RNase保护剂选用25×RNA secure。

优选的，恒温扩增试剂中含有20mM Tris-HCl(pH＝8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1M MgSO₄、10×Thermo pol buffer、5M甜菜碱、8U/μl Bst DNA聚合酶、10U AMV逆转录酶、10mM dNTPs、25×RNAsecure。

可选的，试剂盒中还含有RNA提取试剂。优选采用德国Qiagen病毒RNA提取试剂盒(Qia-52904)。

可选的，试剂盒中还含有阳性对照和阴性对照，从而可进一步保证扩增的准确性。阳性对照为麻疹病毒N基因片段的体外转录产物，序列号为MG181208.1；所述阴性对照为灭菌去离子水。

可选的，试剂盒还包括检测试纸条；优选的，检测试纸条选自垂直流动核酸试纸条防污染检测装置，其结构示意图如图1所示。如图1所示，垂直流动核酸试纸条防污染检测装置包括一衬垫1，衬垫由下向上依次设置有样品垫4、有色颗粒结合物垫3、纤维膜2和吸水滤纸垫5，上述各部分在相邻处部分重叠；纤维膜2上依次设置有检测线7和质控线6，检测线7上包被有抗荧光素抗体，质控线6上包被有生物素，有色颗粒结合物垫3上的有色颗粒包被有亲和素。

其中，垂直流动核酸试纸条防污染检测装置的阳性结果的原理示意图如图2所示。如图2所示，滴加在样品垫上的阳性扩增产物上由于同时带有生物素标记和FITC标记，从而可与有色颗粒结合物垫上的有色颗粒结合，在吸水滤纸垫的虹吸作用下，结合有有色颗粒的阳性扩增产物向上运动，在检测线上被FITC抗体捕获，停留显色呈现阳性反应。

进一步可选的，本发明实施例的试剂盒的具体组成如表2所示：

表2

本发明实施例还涉及一种恒温扩增检测麻疹病毒的方法，至少包括以下步骤：

(1)用RNA提取试剂从待检标本中提取病毒RNA；具体参照试剂盒说明书进行操作；

(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增试剂的PCR管中；

具体扩增体系为：模板2μl加恒温扩增试剂18μl共计20μl进行恒温扩增；

优选的，恒温扩增条件为：58～62℃扩增反应80～100min，78～82℃酶灭活2～3min；

更优选的，恒温扩增条件为：60℃扩增反应90min，80℃酶灭活2min；

(3)采用检测试纸条进行检测，优选采用垂直流动核酸试纸条防污染检测装置进行检测。

5min后判读实验结果：当试纸条的质控线(C线)和检测线(T线)均呈红色时，为阳性，说明样品中含有麻疹病毒核酸；当试纸条的质控线(C线)呈红色，而检测线(T线)为无色时，为阴性，说明样品中不含有麻疹病毒核酸；当试纸条的质控线(C线)呈无色时，无论检测线(T线)是否为红色，均表明实验失败，需要对样品进行重复检测。

本发明实施例试剂盒中的5条寡核苷酸引物在Bst DNA聚合酶高活性的链置换特性下，对AMV逆转录酶逆转录产生的cDNA进行不断的DNA链置换扩增循环，并将垂直流动核酸试纸条检测系统应用到恒温扩增产物的检测中，建立了麻疹病毒核酸的恒温扩增检定性检测方法。本发明所提供的麻疹病毒恒温扩增检测试剂盒及其检测方法具有非常好的信号-噪声比，所设计的引物和探针具有非常好的特异性，能准确区分麻疹病毒和其它在遗传学上或临床上相关的病毒。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

麻疹病毒恒温扩增检测试剂盒的组成如下：

①RNA提取试剂：德国Qiagen病毒RNA提取试剂盒(Qia-52904)；

②恒温扩增反应液：20mM Tris-HCl(pH＝8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1MMgSO₄、10×Thermo pol buffer、5M甜菜碱、8U/μl Bst DNA聚合酶、10U AMV逆转录酶、10mMdNTPs、25×RNA secure、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各0.1μM、SEQ ID No.3 0.3μM、SEQ IDNo.4 0.3μM、SEQ ID No.5 0.6μM；其中涉及的引物和探针均在上海生工生物工程有限公司合成，序列如表1所示。

③阳性对照模板：为含有麻疹病毒N基因片段的体外转录产物。阳性对照模板的制备方法为：以下游链置换引物和上游链置换引物对麻疹病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增；用罗氏PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化；以宝生物公司RNA聚合酶体外转录目的RNA片段；紫外分光光度计测A₂₆₀定量并稀释至10⁷拷贝/μl，分装后-20℃保存。

④阴性对照：灭菌去离子水。

实施例2

试剂盒检测麻疹病毒的具体方法：

第一步、用RNA提取试剂从待检标本中提取病毒RNA；

第二步、将步骤一提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照，其中标本RNA和对照RNA均取2μl，反应液取18μl，总反应体积为20μl；在60℃进行扩增反应90min，而后80℃酶灭活2min；

第三步、将反应后的PCR管置入核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，5min后判读实验结果：当试纸条的质控线(C线)和检测线(T线)均呈红色时为阳性，说明样品中含有麻疹病毒核酸；当试纸条的质控线(C线)呈红色，而检测线(T线)为无色时为阴性，说明样品中不含有麻疹病毒核酸；当试纸条的质控线(C线)呈无色时表明实验失败，需要对样品进行重复试验。

实施例3外围引物的优化

按照实施例1的组成制备试剂盒，区别在于：

对比例1中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示链置换引物的浓度均为0.3μM；

对比例2中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示链置换引物的浓度均为0.2μM；

对比例3中不加SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，用水代替；

对比例4为不加模板的阴性对照。

采用实施例1和上述对比例对10²copies/μl的麻疹病毒样品进行检测，其中，实施例1、对比例1和对比例2重复两次，得到的实验结果如图3所示。

由图3可知，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示链置换引物的浓度为0.1μM时，不再有阳性条带，说明此浓度是最佳浓度。

实施例4交叉引物的优化

按照实施例1的组成制备试剂盒，区别在于：

对比例5中SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.8μM；

对比例6中SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.7μM；

对比例7中不加SEQ ID No.5，用水代替；

对比例8为不加模板的阴性对照。

采用实施例1和上述对比例对10²copies/μl的麻疹病毒样品进行检测，其中，实施例1、对比例5和对比例6重复两次，得到的实验结果如图4所示。

由图4可知，SEQ ID No.5所示的交叉扩增引物的浓度为0.6μM时，不再有阳性条带，说明此浓度是最佳浓度。

实施例5探针的优化

按照实施例1的组成制备试剂盒，区别在于：

对比例9中SEQ ID No.3所示的探针的浓度为0.5μM；

对比例10中SEQ ID No.3所示的探针的浓度为0.4μM；

对比例11中不加SEQ ID No.3，用水代替；

对比例12为不加模板的阴性对照。

采用实施例1和上述对比例对10²copies/μl的麻疹病毒样品进行检测，其中，实施例1、对比例9和对比例10重复两次，得到的实验结果如图5所示。

由图5可知，SEQ ID No.3所示的探针的浓度为0.3μM时，不再有阳性条带，说明此浓度是最佳浓度。

实施例6灵敏度评价

将含有麻疹病毒N基因片段的体外转录RNA标准品10倍梯度稀释后用本发明的试剂盒及检测方法进行检测。

含有麻疹病毒N基因片段的体外转录RNA标准品的制备方法为：

采取确诊患者的咽拭子标本于含有病毒保存液的病毒保存管中，吸取部分液体提取RNA进行反转录为模板，利用引物SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2，扩增出456bp的特异性片断，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁷copy/mL。-20℃保存，作为工作标准品。

结果见图6，其中1～8分别为10⁷～10⁰拷贝RNA标准品，9为阴性对照。

实验结果表明，本发明试剂盒对麻疹病毒核酸的检测敏感性为100拷贝病毒RNA分子/反应。可以满足快速检测麻疹病毒的要求。

实施例7特异性试验

采用本发明的试剂盒及检测方法对遗传学上或临床上与麻疹病毒相关的病毒核酸进行检测，结果如图7所示，1～7依次为人副流感病毒、仙台病毒、刁曼病毒、梅南高病毒、腮腺炎病毒、亨尼病毒、麻疹病毒，8为阴性对照。

实验结果表明，非麻疹病毒全部呈现阴性结果。说明本发明试剂盒检测麻疹病毒具有很高的特异性。

本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。

序列表

<110> 内蒙古医科大学

内蒙古华星康为生物科技有限公司

<120> 用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA