阅读说明：本技术 一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法 (Primer group, kit and method for detecting virus mixed infection ) 是由 周祖涛 杨荣坤 肖运才 胡思顺 李自力 刘梅 许青荣 崔卫涛 毕丁仁 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本公开公开了一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法,属于生物技术领域。所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对,所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物,所述第一正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原,有利于提高对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性。(The invention discloses a primer group, a kit and a method for detecting virus mixed infection, and belongs to the technical field of biology. The primer group comprises: the primer set comprises a first primer pair, a second primer pair, a third primer pair, a fourth primer pair, a fifth primer pair, a sixth primer pair and a universal primer pair, wherein the first primer pair comprises: the primer comprises a first forward primer and a first reverse primer, wherein the sequence of the first forward primer is shown as SEQ ID NO. 1 in a sequence table, and the sequence of the first reverse primer is shown as SEQ ID NO. 2 in the sequence table. The primer group provided by the disclosure can detect avian leukemia virus and H5/H9AIV, NDV or IBV 4 pathogen triggered by the avian leukemia virus as a primary pathogen, and is beneficial to improving the accuracy of diagnosis results and the effectiveness of a prevention and control scheme of the avian leukemia virus and H5/H9AIV, NDV or IBV 4 pathogen triggered by the avian leukemia virus as a primary pathogen.)

一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法

技术领域

本公开涉及生物技术领域，特别涉及一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法。

背景技术

禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Viruses，ALV)引起家禽的一种垂直传播性疾病，可导致禽的生产性能下降、免疫受到抑制和多器官组织肿瘤等，对养禽业危害巨大。禽白血病潜伏期长，无特异症状，亚临床感染不易发现，因此在诊断中常常被忽视。目前我国鸡群中普遍存在禽白血病病毒感染的情况。禽白血病病毒感染鸡群后，会造成鸡群的免疫受到抑制，从而导致鸡群的抵抗力下降，进而使鸡群对新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以及H5亚型和H9亚型禽流感病毒(H5/H9 AIV)的易感性增强，最终引起混合感染，且具有较高的发病率和死亡率。

在临床诊断中，常规的检测方法主要针对H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，而忽略了以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的情况，从而影响了诊断结果的准确性及防控方案的有效性。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本公开实施例提供了一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法。所述技术方案如下：

一方面，本公开提供了一种检测病毒混合感染的引物组，所述引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，

所述第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，

所述第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，

所述第三引物对包括：第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述第三反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，

所述第四引物对包括：第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述第四反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，

所述第五引物对包括：第五正向引物和第五反向引物，所述第五正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，所述第五反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；

所述第六引物对包括：第六正向引物和第六反向引物，所述第六正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述第六反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；

所述通用引物对包括：通用正向引物和通用反向引物。

具体地，所述通用正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，所述通用反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。

另一方面，本公开提供了一种测病毒混合感染的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

具体地，所述第一正向引物、所述第一反向引物的终浓度、所述第五正向引物和所述第五反向引物均为1μM/L；所述第二正向引物和所述第二反向引物、所述第三正向引物和所述第三反向引物的终浓度均为1.25μM/L，所述第四正向引物和所述第四反向引物的终浓度均为0.75μM/L；所述第六正向引物和所述第六反向引物的终浓度均为1.5μM/L；；所述正向通用引物和所述反向通用引物的终浓度均为20μM/L。

具体地，所述试剂盒还包括：阳性对照样品、阴性对照样品、EX Taq聚合酶和RNaseFree dH₂O。

进一步地，所述EX Taq聚合酶的终浓度为5U/μL。

进一步地，所述阳性对照样品包括：模板为含有H5亚型禽流感病毒HA基因的阳性标准质粒、含有H9亚型禽流感HA基因的阳性标准质粒、含有新城疫病毒F基因的阳性标准质粒、含有鸡传染性支气管炎病毒N基因的阳性标准质粒、含有B亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒和含有J亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒。

进一步地，所述阴性对照样品为pMD18-T空载质粒。

再一方面，本公开实施例提供了一种采用上述的引物组检测病毒混合感染的方法，其特征在于，所述方法包括：

提取待测样本的RNA，

将所述RNA反转录成cDNA，将所述cDNA作为模板；

将所述模板与所述引物组进行扩增反应，得到扩增产物；

将所述扩增产物采用毛细管电泳分析病毒。

具体地，所述扩增反应包括第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共10个循环；

所述第二阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共20个循环；终延伸：72℃延伸10min。

本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，有利于对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性。该试剂盒能够全面检测禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，从而得到准确的检测结果。该检测方法运用多重PCR扩增与毛细管电泳相结合，利用双引物的特性，采用两步法扩增，有效避免了常规多重PCR扩增中的偏好性问题，提高了扩增效率；与毛细管电泳相结合，不仅比普通凝胶电泳更环保、安全，避免有毒有害核酸染料的使用，而且提高了分辨率，在目的片段相差7bp以上即可分辨，提高了检测的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本公开实施例三提供的毛细管电泳分析图；

图2是本公开实施例三提供的模拟ND与AIV-H5混合感染的毛细管电泳分析图；

图3是本公开实施例三提供的模拟AIV-H9、ND和IB混合感染的毛细管电泳分析图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。

本公开的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规实验方法。

本公开的实施例中所使用的试剂和仪器等如无特殊说明均可从一般商业途径获得。

实施例一

本公开实施例提供了一种检测病毒混合感染的引物组，该引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和通用引物对，第一引物对包括：第一正向引物和第一反向引物，第一正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，第一反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，第二引物对包括：第二正向引物和第二反向引物，第二正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，第二反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，第三引物对包括：第三正向引物和第三反向引物，第三正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，第三反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，第四引物对包括：第四正向引物和第四反向引物，第四正向引物的序列如序列表中SEQID NO:7所示，第四反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，第五引物对包括：第五正向引物和第五反向引物，第五正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，第五反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；第六引物对包括：第六正向引物和第六反向引物，第六正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，第六反向引物的序列如序列表中SEQ IDNO:12所示；通用引物对包括：通用正向引物和通用反向引物。

具体地，通用正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，通用反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。

具体地，以H5亚型禽流感病毒(AIV)HA基因为靶基因的第一引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为223bp，靶序列为GenBank:AF144305.1；以H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)HA基因为靶基因的第二引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为116bp，靶序列为GenBank:DQ064368.1；以新城疫病毒(NDV)F基因为靶基因的第三引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为129bp，靶序列为GenBank:M23407.1；以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因为靶基因的第四引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为168bp，靶序列为GenBank:DQ473615.1；以J亚型禽白血病病毒(ALV-J)gp85基因为靶基因的第五引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为204bp，靶序列为GenBank:Z46390.1；以B亚型禽白血病病毒(ALV-B)gp85基因为靶基因的第六引物对，预计扩增产物长度(即目的峰位置)为286bp，靶序列为GenBank:HM446005.1。

本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，有利于提高对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性，通用引物对能够有效避免多重PCR扩增中出现的扩增偏好性问题，使目的基因得到高效表达扩增。

实施例二

本公开实施例提供了一种检测病毒混合感染的试剂盒，该试剂盒包括本公开实施例一提供的引物组，第一正向引物、第一反向引物的终浓度、第五正向引物和第五反向引物均为1μM/L；第二正向引物和第二反向引物、第三正向引物和第三反向引物的终浓度均为1.25μM/L，第四正向引物和第四反向引物的终浓度均为0.75μM/L；第六正向引物和第六反向引物的终浓度均为1.5μM/L；正向通用引物和反向通用引物的终浓度均为20μM/L。

具体地，该试剂盒还包括：阴性对照样品、阳性对照样品、EX Taq聚合酶和RNaseFree dH₂O，EX Taq聚合酶的终浓度为5U/μL。

进一步地，该阳性对照样品包括：模板为含有H5亚型禽流感病毒HA基因的阳性标准质粒、含有H9亚型禽流感HA基因的阳性标准质粒、含有新城疫病毒F基因的阳性标准质粒、含有鸡传染性支气管炎病毒N基因的阳性标准质粒、含有B亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒和含有J亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒。

进一步地，阴性对照样品为pMD18-T空载质粒。

本公开实施例提供的试剂盒能够全面检测禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，从而得到准确的检测结果。

实施例三

本发明实施例提供了一种采用本公开实施例二提供的试剂盒检测病毒混合感染的方法，该方法包括：

提取待测样本的RNA，

将RNA反转录成cDNA，将cDNA作为模板；

将模板与引物组以及试剂盒中试剂一同进行扩增反应，得到扩增产物；

将扩增产物采用毛细管电泳分析病毒混合感染。

在本实施例中，提取待测样本的RNA是按照商品化DNA/RNA提取试剂盒(购于北京全式金生物技术有限公司)按照使用说明书从含有以下病毒的鸡胚尿囊液中提取禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)疫苗Losota株、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株H52株和H120株的RNA；从含有禽白血病病毒的DF-1细胞增殖液中提取J亚型禽白血病病毒(ALV-J)和B亚型禽白血病病毒(ALV-B)的RNA。将得到的RNA利用商品化试剂盒进行反转录成cDNA，将cDNA作为模板。在本实施例中可以利用核酸蛋白分析仪器测定其浓度和纯度，以此控制cDNA的质量，-20℃保存。

以终浓度为1ng/μL的pMD18-T空载质粒为阴性对照，阳性对照样品包括：模板为终浓度为1ng/μL的含有H5亚型禽流感病毒HA基因的阳性标准质粒、终浓度为1ng/μL的含有H9亚型禽流感HA基因的阳性标准质粒、终浓度为1ng/μL的含有新城疫病毒F基因的阳性标准质粒、终浓度为1ng/μL的含有鸡传染性支气管炎病毒N基因的阳性标准质粒、终浓度为1ng/μL的含有B亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒和终浓度为1ng/μL的含有J亚型禽白血病病毒gp85基因的阳性标准质粒。

在本实施例中，扩增反应体系包括：第一正向引物、第一反向引物的终浓度、第五正向引物和第五反向引物均为1μM/L；第二正向引物和第二反向引物、第三正向引物和第三反向引物的终浓度均为1.25μM/L，第四正向引物和第四反向引物的终浓度均为0.75μM/L；第六正向引物和第六反向引物的终浓度均为1.5μM/L；正向通用引物和反向通用引物的终浓度均为20μM/L；扩增反应体系包括：DNA混合模板2μL，通用正向引物和通用反向引物各1.2μL，第一正向引物、第二正向引物、第三正向引物、第四正向引物、第五正向引物、第六正向引物和第一反向引物、第二反向引物、第三反向引物、第四反向引物、第五反向引物、第六反向引物的混合引物分别为0.6μL，5U/μL的EX Taq聚合酶15μL，RNase Free dH₂O 9.4μL，反应体系共30μL。

扩增反应包括第一阶段和第二阶段，第一阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸30s，共10个循环；

第二阶段的扩增程序为每个循环均包括：94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共20个循环；终延伸：72℃延伸10min，4℃保存。得到PCR扩增产物。

采用毛细管电泳对引物组的特异性进行检测，具体如下：

使用全自动核酸分析系统:Qsep₁₀₀ ^TM对PCR扩增产物进行检测，具体操作步骤如下：

(1)Qsep₁₀₀ ^TM全自动核酸蛋白分析系统，在清洗槽P(Park)、W(Wash)、C(Clean)位置放入2/3体积的蒸馏水，S位置放2/3体积的Separation Buffer，MA1孔中放置20bp-1000bp的Alignment Marker，MA2孔中放置对应的Size Marker(C109200-100)(注：P、W、C和S槽中的液面高度以缓刻度线处为宜，不能低于槽体积的2/3)；取30μl Alignment Marker和SizeMarker，加到PCR管(去除管盖)中，再在上方覆盖30μl矿物油(Mineral Oil)以防止挥发。点击Change Sample(A)，放入样品；置入SI卡夹，选择6KV电压进行高压通胶检查(HV check)和卡夹校正。

(2)将PCR扩增产物进行10～100倍稀释放入样品位置，在对应位置输入样品信息(Sample ID)；程序选择20bp～1000bp的Alignment Marker和6KV的Method(注意：所选方法的电泳电压要与卡夹校正时的电压一致)；Sample Duration(吸样时间)10S；Runs(检测重复次数)1次和Separation Duration(分离时间)300S开始电泳分离。样品检测完成后，使用自定义Qsep₁₀₀ ^TM全自动核酸蛋白分析系统对分离后的片段分析，判定结果。

结果如图1所示，由图1可知，毛细管电泳及片段分析大小分别为119bp、129bp、170bp、207bp、225bp、292bp，共六个目的峰，表明样品中含有AIV-H9、NDV、IBV、ALV-J、AIV-H5、ALV-B六种病毒cDNA，以上扩增大小均与目的片段大小相符，无非特异性扩增，表明本公开提供的引物组具有高度的特异性。

以等体积比例混合引物对中的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对和第六引物对，分别对重组质粒pMD18-T-A、pMD18-T-B、pMD18-T-C、pMD18-T-D、pMD18-T-E、pMD18-T-F各浓度梯度进行单重PCR检测及毛细管电泳分析，验证特异性引物的灵敏度。结果显示，在多重PCR反应体系中，对AIV-H9的最低检测量为10⁴copies/μL，对AIV-H5的最低检测量为10³copies/μL，对NDV的最低检测量为10⁴copies/μL，对IBV的最低检测量为10⁴copies/μL，对ALV-J的最低检测量为10³copies/μL，对ALV-B的最低检测量为10⁴copies/μL。由此可见，本公开提供的引物组具有较高的灵敏度。

模拟临床混合感染的多重PCR检测，将6种病毒的cDNA选2或3种随机组合，分两组试验，第一组：AIV-H5与NDV两种病毒cDNA混合作为模板，第二组：AIV-H9、NDV和IBV三种病毒cDNA混合作为模板，扩增反应体系与扩增反应程序同上。

结果分别如图2和图3所示，在图2中，第一组检测两个目的峰，无其他杂峰，两个目的峰分别为：131bp和230bp，这表明待测样品中含有AIV-H5与NDV两种病毒的cDNA，与实际相符；第二组检测三个目的峰，无其他杂峰，三个目的峰分别为：120bp、131bp和176bp，这表明待测样品中含AIV-H9、NDV和IBV三种病毒的cDNA，与实际相符，由此可见，本公开提供的引物组、试剂盒及检测方法具有较高的准确性。

本公开提供的引物组能够检测禽白血病病毒以及由禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原，有利于提高对禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9 AIV、NDV或IBV 4病原的诊断结果的准确性及防控方案的有效性。该试剂盒能够全面检测禽白血病病毒以及由以禽白血病病毒作为原发性病原引发H5/H9AIV、NDV或IBV 4病原，从而得到准确的检测结果。该检测方法运用多重PCR扩增与毛细管电泳相结合，利用双引物的特性，采用两步法扩增，有效避免了常规多重PCR扩增中的偏好性问题，提高了扩增效率；与毛细管电泳相结合，不仅比普通凝胶电泳更环保、安全，避免有毒有害核酸染料的使用，而且提高了分辨率，在目的片段相差7bp以上即可分辨，提高了检测的准确性。

以上仅为本公开的较佳实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种检测病毒混合感染的引物组、试剂盒及其方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtgacact atagaataat ttggagctat agcaggtttt at 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacgactca ctatagggat caaactgagt gttcattttg tc 42

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggtgacact atagaataat gaccaaattc aagacatatg g 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacgactca ctatagggat gctcatcgag tgttttctg 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtgacact atagaataat aaggaggcat gtgcgaaag 39

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtacgactca ctatagggat atcctacgga tagagtcacc 40

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggtgacact atagaataat agtgtgggtt gctggt 36

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtacgactca ctatagggat cccaacggaa attaccat 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggtgacact atagaatatt agccagccaa acagcat 37

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtacgactca ctatagggac agactctact gcgattgttc 40

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtgacact atagaatata ctgcgaactg tacgggt 37

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtacgactca ctatagggaa gaatatctgt atggttgggt gc 42

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggtgacact atagaata 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtacgactca ctataggga 19