阅读说明：本技术 鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及应用 (Fluorescent quantitative PCR primer, probe and kit for identifying porcine epidemic diarrhea virus vaccine strain and epidemic strain and application ) 是由 朱俊辉 廉维 陈立思 何玉友 杨泽彬 王国辉 李长艳 赵涵 贾小营 白杨 郑洪娟 于 2020-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针、试剂盒及其应用。本发明筛选获得特异性好的2条探针和1对特异性引物,使用一步法扩增试剂进行扩增,建立了一种可快速鉴别诊断PEDV疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒,只扩增猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行株,而对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增,保证检测结果的准确性。本发明所建立的检测试剂盒具有较高灵敏度和特异性,同时具有较好的批内和批间检测的稳定性和准确性,可以实现PEDV毒株类型精准鉴定,符合检测标准,能广泛应用于PEDV临床监测和疾病诊断。(The invention discloses a fluorescent quantitative PCR primer pair, a probe and a kit for identifying a porcine epidemic diarrhea virus vaccine strain and an epidemic strain and application thereof. The invention obtains 2 probes with good specificity and 1 pair of specific primers by screening, and uses a one-step amplification reagent for amplification to establish a fluorescent quantitative RT-PCR detection kit capable of quickly identifying and diagnosing PEDV vaccine strains and epidemic strains, only amplifies the porcine epidemic diarrhea virus vaccine strains and the epidemic strains, but has no non-specific amplification to the porcine transmissible gastroenteritis virus, rotavirus, classical swine fever virus, pseudorabies virus and porcine circovirus, thereby ensuring the accuracy of the detection result. The detection kit established by the invention has higher sensitivity and specificity, has better stability and accuracy of detection in batches and among batches, can realize accurate identification of the PEDV strain type, meets the detection standard, and can be widely applied to PEDV clinical monitoring and disease diagnosis.)

鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引 物、探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴定，本发明进一步涉及鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株PCR引物对和探针以及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的分子鉴定领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以仔猪急性腹泻为临床特征的高度接触性传染病。PEDV为冠状病毒科，α冠状病毒属成员，有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长28kb，有七个开放阅读框，编码4个结构蛋白(S、E、M和N)和3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b 和ORF3)，其中S基因编码的的纤突蛋白是PEDV重要组成部分，其于中和抗体产生、病毒感染和受体融合等密切相关，也是当前致病机制研究、诊断试剂及疫苗研发的重要蛋白。PEDV自1971年爆发即给世界养猪业造成巨大经济损失，2010年PEDV在中国再次大规模爆发，此次流行毒株与当前使用的疫苗株在S基因发生多处碱基的插入与缺失，并伴有大量点突变。时至今日PEDV已成为我国90％猪场的头号疫病，因此开展PEDV 的检测和精准鉴定是防控重要措施之一。

然而，由于可引起猪群消化道疾病的病原较多且临床症状基本相似，很难从临床症状诊断得以区分病原类型，因此建立有效的PEDV实验室和临床检测方法势在必行。当前针对PEDV检测方法有RT-PCR、ELISA、 IFA和RT-LAMP等检测方法，但是这些方法较难实现准确快速的检测诊断，同时也很难对当前猪场的疫苗株和流行毒株进行精准鉴定。因此基于OIE和国内认可的荧光定量PCR检测方法为基础，建立多重荧光定量 RT-PCR PEDV检测方法具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种鉴定猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量PCR引物对和探针；

本发明的目的之二是提供一种鉴定猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明根据猪流行性腹泻病毒疫苗毒株与流行毒株在S基因N端多处碱基的差异，分别设计了多对检测疫苗株探针和流行毒株的探针，经过反复试验验证筛选，最终获得了两条可同时稳定有效检测猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行毒株探针，并在110bp～170bp之间设计一对上下游引物，并使用一步法扩增试剂进行扩增，建立了一种可快速鉴别诊断PEDV 疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，可以用于养殖场猪流行性腹泻病毒的快速检测及区分评判疫苗免疫效果。

本发明首先提供了一对猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR引物，所述引物对分别由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条碱基序列组成，可扩增的PEDV片段长度为135bp：

SEQ ID No.1：5’-AYTTTAGGCGGTTCTTTTC-3’；

SEQ ID No.2：5’-ARATACCATGAACGCCACT-3’；

本发明进一步提供了8个猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR探针，所述探针为核苷酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的单独一种探针；或选自(1)-(4)中的任何一对探针对：(1)SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；(2)SEQ ID No.5和 SEQID No.6；(3)SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；(4)SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。

SEQ ID No.3：FAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA；

SEQ ID No.4：HEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA。

SEQ ID No.5：CY5-TAGCTGGTACTGTGGCACAGGCAT-TAMRA

SEQ ID No.6：HEX-TCAACTTGGTACTGTGCTGGCCA-TAMRA

SEQ ID No.7：FAM-TAGCCATATTAGGAGGTGGTCAGG-BHQ

SEQ ID No.8：HEX-TTSTCAGCTACATCGATTCT-TAMRA

SEQ ID No.9：CY5-CCTAGTATGAACTCTTCTAGCT-TAMRA

SEQ ID No.10：FAM-ATTGGTGAAAACAGGGTGTC-TAMRA

本发明通过大量的筛选试验发现：SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条探针组成的探针对能够稳定有效地检测猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行毒株的荧光定量RT-PCR探针；

所述的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的探针两端分别连接有FAM荧光集团和TAMAR淬灭集团；核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的探针两端分别连接有HEX荧光集团和TAMAR淬灭集团。其中，所述的核苷酸序列为 SEQ ID No.3所示的探针的5’端连接有FAM荧光集团，其3’连接TAMAR淬灭集团；所述的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的探针的5’端连接有HEX 荧光集团，其3’连接TAMAR淬灭集团。

本发明更进一步提供了一种猪流行性腹泻病毒疫苗与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括RNA反转录试剂、荧光定量RT-PCR 扩增试剂、荧光定量PCR引物对和探针。

所述的RT-qPCR MIX扩增试剂包括One-Step PrimeScriptⅢ RT-qPCR Mix(2×)和ROX Reference DyeⅡ(50×)。

所述的荧光定量PCR引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成；所述荧光定量PCR探针由SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的单独一种探针或由核苷酸序列分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的两条探针组成的探针对。

本发明更进一步提供了应用所述猪流行性腹泻病毒疫苗与流行毒株的鉴别荧光定量RT-PCR检测试剂盒的方法，包括：

(1)提取待检测样品的RNA的提取；

(2)将样品中提取的RNA用一步扩增法进行荧光定量RT-PCR反应；

(3)根据荧光定量RT-PCR反应结果进行判定，具体判定过程为，当 FAM检测探针出现S型扩增曲线且Ct值小于35，HEX探针和阴性对照均无扩增时，检测样品为PEDV流行毒株；当HEX检测探针出现S型扩增曲线且Ct值小于35，FAM探针和阴性对照均无扩增时，检测样品为PEDV疫苗毒株；当FAM探针和HEX同时扩增S型曲线时，阴性对照无扩增，检测样品为PEDV疫苗株和流行株同时感染；当FAM探针和HEX探针扩增曲线的35＜CT值≤40时，判为结果可疑，重新进行检测，重新检测结果若仍为可疑，判为阴性。

所述的荧光定量RT-PCR扩增体系为：15μL One-Step PrimeScriptⅢ RT-qPCRMix(2×)，ROX Reference Dye or DyeⅡ(50×)1μL，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各1μL，探针SEQ ID No.3和SEQ ID No.4各1μL， ddH2O 3μL，RNA模板2μL，共计25μL。

所述的荧光定量RT-PCR扩增反应程序为：反转录52℃5min，95℃ 10s，PCR过程为95℃5s，60℃30s，共计40个PCR反应循环。

本发明的主要有益效果包括：

1、本发明参照NCBI GenBank中公布的PEDV疫苗株和流行毒株在S 基因序列多处变异处筛选设计了4对探针和1对引物，建立了一种猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量RT-PCR检测方法，该方法通过一步反应快速扩增法进行PCR反应，闭管操作减少污染，提高检测结果的准确性，检测快速且敏感性比普通RT-PCR敏感100倍以上，适用于猪流行性腹泻病毒流行病学调查和疫苗株和流行毒株的鉴别。

2、本发明最终筛选获得的2条探针和1对检测引物特异性好，只扩增猪流行性腹泻病毒疫苗株和流行株，而对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒均无非特异性扩增，保证检测结果的准确性。

3、本发明开发建立了一种PEDV疫苗株与流行毒株的检测试剂盒，实现了PEDV毒株类型精准鉴定，符合检测标准，能够广泛应用于PEDV 临床监测和疾病诊断。

附图说明

图1是多种荧光探针扩增筛选结果，1：SEQ ID No.3；2：SEQ ID No.4； 3：SEQ IDNo.7；5：SEQ ID No.5；6：SEQ ID No.6；图中7：SEQ ID No.8；图中8：SEQ ID No.9；图中9：SEQ ID No.10。

图2是荧光定量RT-PCR PEDV流行毒株鉴定结果，1：猪流行性腹泻病毒流行毒株；2：猪流行性腹泻病毒疫苗毒株。

图3是荧光定量RT-PCR PEDV疫苗毒株鉴定结果，1：猪流行性腹泻病毒流行毒株；2：猪流行性腹泻病毒疫苗毒株。

图4是荧光定量RT-PCR同时鉴定PEDV疫苗毒株和流行毒株的鉴定结果，1：猪流行性腹泻病毒流行毒株；2：猪流行性腹泻病毒疫苗毒株。

图5是荧光定量RT-PCR特异性鉴定结果，1：猪流行性腹泻病毒流行毒株；2：猪流行性腹泻病毒疫苗毒株；3：猪传染性胃肠炎病毒；4：猪瘟病毒；5：轮状病毒；6；猪伪狂犬病毒；7：猪圆环病毒2型；8:阴性对照。

图6是荧光定量RT-PCR敏感性鉴定结果，1：猪流行性腹泻病毒核酸浓度为1.53×10⁶copies/μL；2：1.53×10⁵copies/μL；3：1.53×10⁴copies/μL； 4：1.53×10³copies/μL；5：1.53×10²copies/μL；6：1.53×10¹copies/μL；7： 1.53copies/μL；8：阴性对照。

图7荧光定量RT-PCR重复性试验鉴定结果，1：10⁷copies/μL；2：10⁶ copies/μL；3：10⁵copies/μL；4：10⁴copies/μL

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的鉴别诊断方法的建立

1试验方法

1.1探针和引物设计及探针筛选

本发明根据NCBI中GenBank公布的疫苗毒株代表CV777(登录号AF353511)和流行毒株代表CH-ZWBZb-01-2015(登录号KR296681)等毒株的大量序列比对，寻找两种类型毒株多处差异位点，设计了1对特异性引物和8条探针，探针的5’端连接有FAM荧光集团，其3’连接TAMAR 淬灭集团。如下所示：

SEQ ID No.1：5’-AYTTTAGGCGGTTCTTTTC-3’；

SEQ ID No.2：5’-ARATACCATGAACGCCACT-3’；

SEQ ID No.3：FAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA；

SEQ ID No.4：HEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA。

SEQ ID No.5：CY5-TAGCTGGTACTGTGGCACAGGCAT-TAMRA

SEQ ID No.6：HEX-TCAACTTGGTACTGTGCTGGCCA-TAMRA

SEQ ID No.7：FAM-TAGCCATATTAGGAGGTGGTCAGG-BHQ

SEQ ID No.8：HEX-TTSTCAGCTACATCGATTCT-TAMRA

SEQ ID No.9：CY5-CCTAGTATGAACTCTTCTAGCT-TAMRA

SEQ ID No.10：FAM-ATTGGTGAAAACAGGGTGTC-TAMRA

1.2 RNA的提取

对毒株样品、参考用病毒和已处理的病料肠组织、粪便和血清等样品参照大连宝生物TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取试剂盒说明书进行核酸提取。

1.3荧光定量RT-PCR探针的筛选及反应建立

以步骤2获得的模板，利用上述4对探针进行荧光定量RT-PCR反应，反应体系为：

其中，荧光定量RT-PCR反应程序为：反转录52℃5min，95℃10s， PCR过程为95℃5s，60℃30s，共计40个PCR反应循环。

对扩增曲线利用ABI 7500软件(V2.3)进行分析，观察扩增曲线并读取Ct值，筛选能稳定有效扩增PEDV并能鉴别疫苗毒株和流行毒株的探针序列。

2试验结果

荧光定量RT-PCR探针筛选及扩增结果表明4对探针中只有SEQ ID No.3和4这对探针对能稳定的扩增PEDV疫苗毒株和流行毒株，其他3 对探针对未能实现鉴别或同时检测。因此选用SEQ ID No.3和4探针建立荧光定量RT-PCR检测方法能准确的鉴别PEDV疫苗毒株与流行毒株，如图2所示为检测流行毒株扩增曲线，图3为疫苗毒株时扩增曲线，图4为检测样品同时含有PEDV疫苗株和流行株扩增曲线。(图1为4对探针同时检测扩增图)

试验1特异性试验

提取几种常见且伴有腹泻症状的猪病毒如猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒的核酸，对最终筛选获得的稳定有效探针建立的荧光定量RT-PCR方法进行特异性试验，以评价该方法检测的准确性。

检测结果显示所建立的荧光定量RT-PCR鉴别检测方法，只扩增 PEDV疫苗毒株和流行毒株，而对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒均无扩增，表明该方法具有较好的特异性，可保证检测结果的准确性。

试验例2敏感性试验

将提取的PEDV RNA进行NanoDrop 2000进行定量，随后将该RNA 利用RNA-freewater进行10倍梯度稀释(10¹⁰-1)，设置阴性对照，并对检测最低值进行记录分析。

将Nano Drop 2000测定的PEDV RNA为68.1ng/μL通过公式换算为 9.38×10⁹copies/μL进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中1.53×10⁶ copies/μL到1.53copies/μL，进行敏感度测定。并按实例1的方法进行检测，结果显示荧光定量RT-PCR最低可检测1.53copies/μL，表明该方法具有较好的敏感性。

试验例3重复性试验

选取同一标准品质粒进行浓度稀释，并选择4个稀释度，每个稀释度设置3个重复，以验证该检测方法的重复性效果。

将稀释好的标准品选取10⁷-10⁴copies/μL的4个浓度滴度，每个浓度滴度设置3个重复，结果显示不同滴度的3个重复Ct值分别为 14.15/14.11/14.05、16.68/16.63/16.69、20.33/20.36/20.38、24.42/24.49/24.47，变异系数分别为0.147％、0.192％、0.123％和0.147％，Ct值重现性稳定，表明该检测方法重复性较好。

试验例4临床应用检测

利用本发明建立的方法对采集全国多个省市的养殖场组织病料等样品进行检测分析，并对PEDV的阳性率及毒株类型进行统计分析。

应用该荧光定量RT-PCR检测方法对河南、吉林、安徽、湖南、四川、辽宁、广东和黑龙江送检的共计291份肠组织、粪便和血清等病料进行检测，结果表明PEDV阳性率为77.32％(225/291)；其中，流行毒株为96.89％ (218/225)，疫苗毒株3.11％(7/225)，表明当前PEDV流行毒株分布较广，对猪群的危险系数较高。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林正业生物制品股份有限公司

<120> 鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与流行毒株的荧光定量

PCR引物、探针、试剂盒及应用

<130> JL-3002-190811A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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attggtgaaa acagggtgtc 20