一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物

文档序号：1320952 发布日期：2020-07-14 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物 (Probe and primer composition for simultaneously detecting novel human coronavirus, influenza A virus and influenza B virus ) 是由曹新文杨静李秀林王政峰赵西浩崔东明李青范东颖张蓉刘中华王国强于 2020-02-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物,主要是根据甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的NS基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)的ORF1ab和N基因及内标基因RNaseP的基因组特异性设计10条特异性引物和5条探针,利用实时荧光PCR扩增技术,根据不同通道的扩增曲线来区分甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒2019-nCoV。(The invention discloses a probe and a primer composition for simultaneously detecting novel human coronavirus, influenza A virus and influenza B virus, which are mainly characterized in that 10 specific primers and 5 probes are designed according to genome specificity of M gene of influenza A virus, NS gene of influenza B virus, ORF1ab and N gene of novel coronavirus (2019-nCoV) and internal standard gene RNaseP, and real-time fluorescent PCR amplification technology is utilized to distinguish influenza A virus, influenza B virus and novel coronavirus 2019-nCoV according to amplification curves of different channels.)

技术领域：

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及生物检测技术领域，特别涉及一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物。

背景技术：

流行性感冒病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒可自然感染人和多种动物，常突然发生、传播迅速，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒在自然情况下仅感染人，一般呈散发、爆发或小流行；丙型流感病毒常感染儿童，多呈散发、偶发或爆发，但不流行。甲型流感病毒的表面抗原血凝素(HA)个神经氨酸酶(NA)容易变异，已知HA有16个亚类(H1-H16)，NA有9个亚类 (N1-N9)，它们之间的随意组合可形成多种亚型，各亚型之间无交叉免疫力。这种变异特性给流感的诊断和防控造成很大困难。

冠状病毒属于单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。截止2019 年，已发现的人冠状病毒(humancoronavirus,HCoV)g共有6种，包括HcoV-229E、 HcoV-OC43、SARS-CoV、HcoV-NL63、HcoV-HKU1和MERS-CoV，HcoV既可引起普通的感冒也可以引起急性呼吸道感染。其中HcoV-229E、HcoV-OC43、HcoV-NL63、 HcoV-HKU1在人群中流行较为普遍，可以引起普通感冒，致病性较弱，但在多重病毒共感染的情况下，老人、儿童和免疫缺陷病人中也可引起严重急性呼吸道感染。SARS是一种呼吸道烈性传染性疾病，由SARS-CoV引起，该病传播快，病情凶险，死亡率高，2003年未再出现。MERS-CoV是2012年中东地区新发现的一种致死率较高的新型冠状病毒，可以引起严重急性呼吸道感染，多在中东几个国家流行。2019新型冠状病毒(2019-nCoV)于2019年被发现，随后在全球多个国家快速传播，患者主要表现有发热、肺炎影像学特征，发病早期白细胞总数正常或降低。

传统的流感病毒和人冠状病毒的检测主要有血清学检测、抗原检测、病毒分离和电镜检测等方法，但是上述方法由于检测费时、方法复杂、特异性差、灵敏度不高等缺点，临床检测实用性不高。而目前，市面上缺乏针对同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物检测的试剂盒。

发明内容

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本发明的目的在于提供一组用于快速鉴定甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒(2019-nCoV)和内标基因RNaseP的特异性引物和探针，及一种用实时荧光PCR技术快速鉴定甲型流感病毒、乙型流感病毒和人新型冠状病毒 (2019-nCoV)的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用，为甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒(2019-nCoV)提供临床辅助诊断。

本发明的另一目的在于提供含有同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物的试剂盒。该试剂盒可特异快速地进行甲流、乙流和新冠病毒感染的检测与诊断，减低成本，快速检测，有效满足临床使用的需要。

为实现上述目的，本发明提供了一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物,其特征在于,包括以下组分：

包含1种探针及包含2种引物的第一引物组，其中所述一种探针具有如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列；

包含1种探针及包含2种引物的第二引物组，其中所述一种探针具有如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列；

包含1种探针及包含2种引物的第三引物组，其中所述一种探针具有如SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸序列；

包含1种探针及包含2种引物的第四引物组，其中所述一种探针具有如SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID NO.10-11所示的核苷酸序列；

本发明根据甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的NS基因、新型冠状病毒(2019-nCoV)的ORF1ab和N基因及内标基因RNaseP的基因组特异性设计10 条特异性引物和5条探针，利用实时荧光PCR扩增技术，根据不同通道的扩增曲线来区分甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒(2019-nCoV)。

核酸检测因其快速、准确、灵敏度高、特异性强等优点而成为最主要手段的临床诊断方法。

优选地，上述技术方案中，还具有包含1种探针及包含2种引物的第五引物组，其中所述一种探针具有如SEQ ID NO.156所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQID NO.13-14所示的核苷酸序列。

优选地，上述技术方案中，第一引物组-第五引物组中所述探针均带有标记物。

优选地，上述技术方案中，第一引物组-第五引物组中标记物为荧光标记物。

优选地，上述技术方案中，第一引物组-第五引物组中的荧光标记物分别是不同的。

优选地，上述技术方案中，第一引物组用于检测甲型流感病毒；第二引物组用于检测乙型流感病毒；第三引物组和第四引物组用于检测新型冠状病毒 2019-nCoV；第五引物组用于检测内标基因RNaseP。

一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的检测试剂盒，包含如下组分：第一检测组，包含针对甲型流感病毒的引物和探针，所述探针具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID NO.1-2 所示的核苷酸序列；

第二检测组，包含针对乙型流感病毒的引物和探针，所述探针具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列；

第三检测组，包含针对新型冠状病毒2019-nCoV中N基因的引物和探针，所述探针具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸序列；

第四检测组，包含针对新型冠状病毒2019-nCoV中ORF1ab基因的引物和探针，所述探针具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID NO.10-11所示的核苷酸序列；

第五检测组，包含针对内标基因RNaseP的引物和探针，所述探针具有如SEQ IDNO.15所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列。

本设计建立的基于实时荧光PCR技术(TaqMan探针法)的同时检测甲型流感、乙型流感和人冠状病毒(2019-nCoV)的核酸检测试剂盒弥补了这一不足。

优选地，上述技术方案中，还包括RT-PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照；所述RT-PCR反应液包括缓冲液、Mg2+和dNTPs；所述酶混合液包括 RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶；所述阳性对照为人工合成的基因；所述空白对照为灭菌的去RNA酶水一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的检测试剂盒的操作方法：包括如下步骤：(1)模版RNA提取，采用核酸提取盒提取待测样品RNA；(2)实时荧光PCR扩增反应：在100μl或 200μl PCR管配制反应体系：引物混合液4μl，Taqman One Step Buffer 7.5μl，Taqman One Step Enzyme 5μl，模板DNA 5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl，然后将上述反应管于实时荧光PCR仪按照①50℃×30min，95℃×5min(1cycle)； ②95℃×10Sec，55℃×40Sec(45cycles，55℃采集荧光，荧光通道选择FAM、 VIC、ROX、CY5、CY5.5)；(3)结果判断：根据实时荧光PCR扩增曲线进行结果判断。阳性，检测结果Ct≤37，扩增曲线应呈典型S形且具有明显的指数增长期；阴性：检测结果Ct＞40或未检出为阴性；疑似：37＜Ct≤40，需重复检测，Ct值仍在此区间且曲线呈标准S型且有明显指数增长期，则判断为阳性，否则判断为阴性。

阳性对照阳性、阴性对照阴性、CY5.5呈阳性的条件下，FAM通道阳性为甲型流感病毒、VIC通道阳性为乙型流感病毒、ROX通道和CY5通道同时阳性为新型冠状病毒(2019-nCoV)。

优选地，上述技术方案中，该反应的反应液中：第一检测组引物探针浓度分别为200nM、200nM、100nM，第二检测组引物探针浓度分别为300nM、300nM、 200nM；第三检测组引物探针浓度分别为500nM、500nM、300nM；第四检测组引物探针浓度分别为500nM、500nM、600nM；第五检测组引物探针浓度分别为600nM、 600nM、600nM。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、不需要特殊的昂贵仪器，常规的实时荧光PCR仪可用；

2、本发明提供给的试剂盒操作简便，适应性好、成本较低；单次检测在2 小时内鉴别一份样本中是否存在甲型流感病毒/乙型流感病毒/新型冠状病毒 (2019-nCoV)；

3、内标基因RNaseP的设置能够有效监控样本采集、样本保存、样本核酸提取过程；

4、特异性强，与常见呼吸道的其他病原体无交叉反应；灵敏度高，甲型流感病毒的检出限为1000copies/mL、乙型流感病毒的检出限为1000copies/mL、新型冠状病毒(2019-nCoV)的检出限为1000copies/mL；本发明对于普通流感和新型冠状病毒(2019-nCoV)的诊断与临床用药具有较高的参考价值，具有适用于多种样本的优势，适于推广应用。

附图说明：

图1为阳性对照、阴性对照检测的荧光PCR扩增曲线图

图2为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的甲型流感病毒阳性样本荧光PCR扩增曲线图

图3为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的乙型流感病毒阳性样本荧光PCR扩增曲线图

图4为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性样本荧光PCR扩增曲线图(ORF1ab和N基因检测阳性)

图5为特异性分析。

具体实施方式

：

下为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：引物、探针的设计：

通过NCBI查找甲型流感病毒的M基因序列、乙型流感病毒的NS基因序列、 RNaseP基因的基因组序列，通过Primer Express3.0.1进行序列比对，BioEdi t设计引物和探针，Blast确认引物探针特异性，得到甲型流感、乙型流感、RN aseP的引物和探针；在国家疾控中心公布的新型冠状病毒(2019-nCoV)的ORF 1ab和N基因的引物和探针基础上设计得到ORF1ab和N基因的引物和探针。

用于快速鉴定甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型冠状病毒(2019-nCoV) 的特异性引物和探针，包括：

(1)扩增甲型流感病毒的引物探针，优选的引物探针浓度分别为200nM、2 00nM、100nM，序列如下：

引物SEQ1：5’-GAAACGTAYGTTCTCTCTATC-3’；

引物SEQ2：5’-GTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA-3’；

探针SEQ3(FAM荧光标记)：5’-(FAM)-CGGCTTTGAGGGGGCCTG-(MGB)- 3’；

(2)扩增乙型流感病毒的引物探针，优选的引物探针浓度分别为300nM、3 00nM、200nM，序列如下：

引物SEQ4：5’-GGAGCAACCAATGCCAC-3’；

引物SEQ5：5’-TAGGCGGTCTTGACCAG-3’；

探针SEQ6(VIC荧光标记)：5’-(VIC)-TAAACTTTGAAGCAGGAAT-(MGB) -3’；

(3)扩增新型冠状病毒(2019-nCoV)的N基因的引物探针，优选的引物探针浓度分别为500nM、500nM、300nM，序列如下：

引物SEQ7：5’-CCCTGTGGGTTTTACAC-3’；

引物SEQ8：5’-CGATTGTGCATCAGCTG-3’；

探针SEQ9(ROX荧光标记)：5’-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGG-(MGB)-3’；

(4)扩增新型冠状病毒(2019-nCoV)的ORF1ab基因的引物探针，优选的引物探针浓度分别为500nM、500nM、600nM，序列如下：

引物SEQ10：5’-GAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；

引物SEQ11：5’-GACATTTTGCTCTCAAGCT-3’；

探针SEQ12(CY5荧光标记)：5’-CY5-CTGCTGCTTGACAGATTG-(MGB)- 3’；

(5)扩增内标基因RNaseP的引物探针，优选的引物探针浓度分别为600n M、600nM、600nM，序列如下：

引物SEQ13：5’-GATTTGGACCTGCGAGC-3’；

引物SEQ14：5’-CGGCTGTCTCCACAAGT-3’；

探针SEQ15(CY5.5荧光标记)：5’-CY5.5-CTGACCTGAAGGCTCTGC-(MG B)-3’。

实施例2：模板RNA的提取

(1)样本的采集，包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本、血液标本、血清标本，采集方法如下：

①咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

②鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

③鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次 (亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

④痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml采样液的50ml螺口塑料管中。

⑤支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约30cm 深处)，注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集)。

⑥肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次30～50ml，总量100～250ml，不应超过300ml。

⑦血液标本：建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。

⑧血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1 500～2000rpm离心10分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。

按照上述方法采集好的标本按照核酸提取试剂盒说明书进行提取，可使用以下提取试剂，硕世生物公司的病毒核酸提取试剂盒，凯杰公司的QIAamp Vir al RNA MiniKit。

实施例3：引物探针反应液和试剂盒反应液的配制

(1)引物探针反应液的配制：

(2)试剂盒反应液的配制：

实施例4：扩增程序

(1)50℃×30min，95℃×5min。1cycle；

(2)95℃×10Sec，55℃×40Sec。45cycles，55℃采集荧光，荧光通道选择 FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5)。

实施例5：结果判断

阳性对照检测阳性、阴性对照检测阴性、样本检测结果CY5.5通道RNaseP检测阳性基础上，按照下表进行结果判断：

实施例6：附图及说明

图1为阳性对照、阴性对照检测的荧光PCR扩增曲线图

图2为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的甲型流感病毒阳性样本荧光PCR扩增曲线图

图3为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的乙型流感病毒阳性样本荧光PCR扩增曲线图

图4为咽拭子样本采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测的新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性样本荧光PCR扩增曲线图(ORF1ab和N基因检测阳性)

图5为特异性分析，分别对阳性冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKU1型、冠状病毒NL63型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、副流感病毒、腺病毒、巨细胞病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脑膜炎奈瑟菌、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌以及人类白细胞采用硕世生物的核酸提取试剂盒提取检测，检测结果如表1 所示，荧光PCR扩增曲线图如图5所示。

表1：特异性分析

基于实时荧光PCR的甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒 (2019-nCoV)的最低检出限的确认。采用硕世生物的核酸提取试剂盒分别提取甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒(2019-nCoV)不同浓度样本核酸进行检测

表2：甲型流感病毒最低检出限确认

样本浓度(copies/mL)	检测重复数	检测阳性数	阳性检出率
				10	20	4	20.0％
100	20	16	80.0％
				1000	20	20	100.0％
10000	20	20	100.0％

表3：乙型流感病毒最低检出限确认

样本浓度(copies/mL)	检测重复数	检测阳性数	阳性检出率
				10	20	5	25.0％
100	20	13	65.0％
				1000	20	20	100.0％
10000	20	20	100.0％

表4：新型冠状病毒(2019-nCoV)最低检出限确认

样本浓度(copies/mL)	检测重复数	检测阳性数	阳性检出率
				10	20	2	10.0％
100	20	8	40.0％
				1000	20	20	100.0％
10000	20	20	100.0％

。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏硕世生物科技股份有限公司

<120> 一种同时检测人新型冠状病毒和甲型流感、乙型流感病毒的探针及引物组合物

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA