阅读说明：本技术 一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的方法 (Method for rapidly detecting prunus necrotic ringspot virus ) 是由 王磊 宿红艳 吴凡林 朱冬姿 王雪辉 王先钰 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物病毒检测技术领域,特别涉及一种甜樱桃李属坏死环斑病毒的检测方法。包括以下步骤：1)、DNA片段与探针的设计合成；2)纳米金的制备；3)、纳米金-探针1复合物的制备；4)、试纸条的组装；5)、样品的制备；6)、核酸外切酶Ⅲ信号放大；7)、试纸条检测。本发明采用核酸检测探针制备试纸条,不需要制备抗体,制备工艺简单,成本低廉；针对甜樱桃李属坏死环斑病毒的高度特异保守区设计探针,检测效果好,特异性强,不易产生假阳性；利用核酸外切酶Ⅲ循环酶切进行信号放大,提高了检测灵敏度,且无需专业人员和专门的仪器,携带、检测方便,结果凭肉眼可测；显色时间短,仅需10min。(The invention relates to the technical field of plant virus detection, in particular to a method for detecting prunus necrotic ringspot virus. The method comprises the following steps: 1) designing and synthesizing a DNA fragment and a probe; 2) preparing nano gold; 3) preparing a nano gold-probe 1 compound; 4) assembling the test strip; 5) preparing a sample; 6) amplifying exonuclease III signals; 7) and detecting by using a test strip. The test strip is prepared by adopting the nucleic acid detection probe, an antibody does not need to be prepared, the preparation process is simple, and the cost is low; the probe is designed aiming at the highly specific conserved region of the prunus necrotic ringspot virus, the detection effect is good, the specificity is strong, and false positive is not easy to generate; signal amplification is carried out by using exonuclease III circulating enzyme digestion, so that the detection sensitivity is improved, professional personnel and special instruments are not needed, the carrying and the detection are convenient, and the result can be detected by naked eyes; the color development time is short, and only 10min is needed.)

一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，特别涉及一种甜樱桃李属坏死环斑病毒的检测方法。

背景技术

甜樱桃(Cerasus avium(L.)Moench.)，又名大樱桃，为蔷薇科李属樱桃亚属植物，是我国目前樱桃的主栽品种。甜樱桃起源于欧洲及西亚，栽培历史悠久，栽培品种多，分布范围广泛。1871年前后甜樱桃引入我国，目前主要在环渤海湾地区栽种。因其果实色泽鲜艳、晶莹剔透、香甜可口、营养丰富，享有“果中珍品”的美誉，具有极高的营养价值和商业价值，深受消费者的青睐。

随着我国甜樱桃产业的不断发展，病毒病害也日趋严重，已成为制约产业健康发展的主要瓶颈。其中李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring-spot virus,PNRSV)是我国发生最为普遍、危害较为严重的病害之一，其引起的甜樱桃病害可使果园减产25％～50％。目前对于李属坏死环斑病尚无有效的药剂防治，一旦发病很难根治。现阶段行之有效的防控措施是，加强苗木的早期检疫，推广和种植无病苗木，杜绝其传播。因此，开发具有我国自主知识产权的简便、灵敏、高效的甜樱桃病毒检测技术及产品是保障我国甜樱桃产业的健康发展的迫切需要。

目前，我国PNRSV病毒主要采用基于血清学的ELISA方法和基于分子生物学的RT-PCR检测技术。但以上这些方法具有制备困难、检测繁琐、耗时长、需要特殊设备、对操作人员的技术要求较高、容易出现假阳性等缺点。检测试纸条因其便于携带、操作简单、快捷、灵敏，成为适于推广和普及的检测方法。但传统的检测试纸条是基于抗原抗体特异结合的免疫试纸条，需要繁琐而漫长的实验周期制备单克隆抗体，限制了试纸条的研究和开发。因此，目前尚无樱桃病害检测试纸条及检测方法。

发明内容

本发明拟针对甜樱桃高发病毒PNRSV，建立的樱桃病毒可视化检测技术及产品研发平台，将核酸外切酶Ⅲ辅助放大策略与纳米金标记的核酸探针结合，以建立一种全新的快速灵敏的樱桃病毒试纸条检测方法。本发明建立的检测试纸条打破的免疫试纸条对抗体的依赖，以人工合成核酸探针代替抗体，绕开了的杂交瘤技术制备单克隆抗体瓶颈，检测探针直接可以在生物公司中合成，大大降低了生产成本和制备周期。显色过程仅需10min，不需特殊仪器，结果直接用肉眼判读，方便快捷。

一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条，其特征在于由样品垫、涂覆纳米金-探针(Probe1)复合物的金标结合垫、设有检测线探针(Probe2)及质控线探针(Probe3)的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上，各部分间应有2～3mm重叠，组装完成后压实，4℃下干燥储存，所述试纸条的制备工艺如下：

1、DNA片段与探针的设计

通过在NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，寻找高度特异保守区，确定检测序列，并以此为根据，设计出发夹DNA(Hairpin DNA)、纳米金Probe1、Probe2和Probe3。其中Probe1的5’端有巯基标记，可与纳米金结合；

2、纳米金的制备

纳米金的制备采用氯金酸还原法制备，制备好的纳米金溶液4℃避光保存备用；

3、纳米金-Probe 1复合物的合成

将上述1mL纳米金溶液浓缩后，将巯基修饰的Probe1通过Au-S键共价结合在纳米金表面,组装成纳米金-Probe1复合物，4℃避光保存；

4、试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备；

(1)样品垫(17mm×5mm)由玻璃纤维组成，将样品垫在缓冲液中浸泡，37℃下干燥；

(2)金标结合垫(8mm×5mm)由玻璃纤维组成，将40μL步骤2制备的纳米金-探针复合物滴加到玻璃纤维垫上，37℃下干燥。

(3)将硝酸纤维素膜(25mm×5mm)在缓冲液中浸泡，37℃下干燥。在硝酸纤维素膜一端划上10μM的probe2溶液做为检测线，另一端划上10μM的Probe3溶液做为质控线，两条线之间的间隔为5mm，固定交联。

(4)吸收垫(30mm×5mm)由吸水纸组成，在PBS缓冲液中浸泡，在37℃下干燥。

(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板(77mm×5mm)上，各部分间应有2～3mm的重叠，组装完成后经重物过夜压实，4℃下干燥储存。

本发明的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条的检测方法，其特殊之处在于包括以下步骤：

1、样品的制备

取PNRSV阳性樱桃植株及无病毒组培苗(阴性对照)叶片，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，采用CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取叶片总RNA，取1μg总RNA进行DNaseⅠ处理去除残余的DNA，95℃加热5min使酶失活后，冰上冷却，采用cDNA第1链合成试剂盒进行反转录获得cDNA；

2、核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ)酶切放大

为了提高检测的灵敏度，借助核酸外切酶Ⅲ循环酶切进行信号放大，首先设计一段68nt的Hairpin DNA，其5'端20nt部分为PNRSV病毒序列，3'端28nt部分为PNRSV病毒互补序列，中间20nt部分是一段可与质控线探针结合的序列；

具体原理是：当目标PNRSV病毒存在时，将Hairpin DNA茎环结构打开，可与之互补杂交形成双链DNA，ExoⅢ只能作用于双链DNA中的互补单链，沿3'→5'方向酶切，对游离DNA单链无法切割，由于樱桃病毒序列两端和Hairpin DNA的5'端是游离的，因此ExoⅢ只能从Hairpin DNA3'端切割28nt的互补部分，然后将樱桃病毒序列和Hairpin DNA的残余部分释放出来，释放的樱桃病毒序列又可再次与Hairpin DNA发生杂交，经过ExoⅢ酶切再次释放出Hairpin DNA的5'端部分，如此循环往复，最终使Hairpin DNA的5'端和中间部分得到累积，即可作为富集信号用于试纸条的检测。具体操作步骤如下：

取上述步骤制备的cDNA，加入杂交Buffer，在95℃下加热5min，然后迅速置于冰水浴中，使之形成自由直链状态，将10μM发夹型DNA溶液5μL加入10μL双蒸水中，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温，使其退火形成发夹型的二级结构，然后，将上述两种DNA溶液混合，加入ExoⅢ外切酶4μL，双蒸水补齐至50μL，37℃酶切60min，将反应后的溶液在80℃加热10min，使ExoⅢ外切酶失活，酶切反应终止，最后将酶切反应液冷却至室温，用于试纸条的检测；

3、试纸条的检测

将酶切反应液滴加在核酸检测试纸条的样品垫上，再加PBS缓冲液100μL作为展开液冲洗试纸条，最后根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：若检测线和质控线同时显示红色条带，则结果为阳性；若检测线不显色，质控线显示红色条带，则结果判定为阴性；若质控线不显色，则检测无效。

经过5～10min溶液的展开，检测阳性植株样本的试纸条检测线和质控线同时显示红色条带，说明该试纸条成功检测到阳性植株中PNRSV病毒的存在；而检测无毒组培苗样本的试纸条仅质控线显示红色条带，说明本发明制备的试纸条有效。将PNRSV病毒核酸的酶切产物稀释10000倍后滴加到PNRSV病毒试纸条上，检测线依然显色，说明PNRSV检测试纸条具有极高的灵敏度。

为了研究试纸条的特异性，我们分别采集李属坏死环斑病毒(PNRSV)、樱桃小果病毒-2(LChV-2)、李矮缩病毒(PDV)、樱桃病毒A(CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)和樱桃潜花叶病毒(CLMV)的阳性植株叶片提取RNA，反转录cDNA后，经ExoⅢ酶切，酶切液分别滴到PNRSV病毒检测试纸条上进行检测。结果所有试纸条的质控线均显色，说明试纸条有效。而仅PNRSV病毒对应的试纸条的检测线显色，而滴加其它病毒样本的试纸条的检测线均不显色，说明本发明制备的试纸条检测特异性好，能排除其它樱桃病毒的干扰。

本发明所建立的纳米金核酸试纸条法与现有技术相比，具有以下优点：

1、采用核酸检测探针制备试纸条，不需要制备抗体，制备工艺简单，成本低廉；

2、针对PNRSV病毒的高度特异保守区为靶点设计探针，检测效果好，特异性强，不易产生假阳性；

3、利用ExoⅢ循环酶切进行信号放大，提高了检测灵敏度，且无需专业人员和专门的仪器，携带、检测方便，结果凭肉眼可测；

4、显色时间短，仅需10min；

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条，由样品垫、涂覆纳米金-Probe1复合物的金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和粘合底板组成，样品垫、金标结合垫、设有检测线Probe2及质控线Probe3的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上，各部分间应有2～3mm重叠，组装完成后压实，4℃下干燥储存，所述试纸条的制备工艺如下：

1、DNA片段与探针的设计

通过在NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，寻找高度特异保守区，确定检测序列，并以此为根据，设计出发夹DNA(Hairpin DNA)、纳米金Probe1、Probe2和Probe3。其中Probe1的5’端有巯基标记，可与纳米金结合。具体序列如下：

Hairpin DNA:

AACTCTATGAGTTCGAATGGTACATTACTCGAACTGATCACCATTCGAACTCATAGAGTTCATTCGGA

Probe1：SH-AAAAAATGATCAGTTCGAGTAATGTA

Probe2：CCATTCGAACTCATAGAGTT

Probe3：TACATTACTCGAACTGATCA。

将设计好的Hairpin DNA、Probe1、Probe2、Probe3序列交由大连宝生物工程有限公司合成。

2、纳米金的制备

纳米金的制备采用氯金酸还原法制备：将1mM氯金酸溶液100mL置于双颈瓶中，快速搅拌加热至沸腾，迅速加入38.8mM柠檬酸三钠溶液10mL，继续加热搅拌，至溶液变为深红色，除去热源后继续搅拌至室温，4℃避光保存备用。

3、纳米金-Probe 1复合物的合成

将上述1mL纳米金溶液浓缩成300μL后加入100μL浓度为10μM的Probe 1，充分混匀，在避光条件下，4℃静置16h。加入PBS溶液(10mM PB，0.3M NaCl，pH＝7.0)30μL，充分混匀，4℃静置24h。吸取上清，4℃、12000r/min离心5min，弃上清，用PBS溶液(10mM PB，0.3MNaCl，pH＝7.0)1mL漂洗，12000r/min离心10min，弃上清，最后用PBS溶液(10mM PB，0.3MNaCl，pH＝7.0)300μl重悬沉淀，4℃避光保存。

4、试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备。

(1)样品垫(17mm×5mm)由玻璃纤维组成，将样品垫在缓冲液(0.25％TritonX-100、20mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 7.0)中浸泡10min，并在37℃下干燥2h。

(2)金标结合垫(8mm×5mm)由玻璃纤维组成，将40μL步骤2)制备的纳米金-探针1复合物滴加到玻璃纤维垫上，避光室温干燥过夜。

(3)将硝酸纤维素膜(25mm×5mm)在5mM PBS缓冲液(pH 7.0)中浸泡5min，并在37℃下干燥2h。在硝酸纤维素膜一端划上10μM的probe2溶液做为检测线，另一端划上10μM的Probe3溶液做为质控线，两条线之间的间隔为5.0mm，80℃固定1.5h。

(4)吸收垫(30mm×5mm)由吸水纸组成，在5mM PBS缓冲液(pH7.0)中浸泡10min，在37℃下干燥2h。

(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板(77mm×5mm)上，各部分间应有2～3mm的重叠，组装完成后经重物过夜压实，4℃下干燥储存。

实施例2

本实施例的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条，由样品垫、涂覆纳米金-Probe1复合物的金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和粘合底板组成，样品垫、金标结合垫、设有检测线Probe2及质控线Probe3的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上，各部分间应有2～3mm重叠，组装完成后压实，4℃下干燥储存，所述试纸条的制备工艺如下：

1、DNA片段与探针的设计

通过在NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，寻找高度特异保守区，确定检测序列，并以此为根据，设计出发夹DNA(Hairpin DNA)、纳米金Probe1、Probe2和Probe3。其中Probe1的5’端有巯基标记，可与纳米金结合。具体序列如下：

Hairpin DNA:

AACTCTATGAGTTCGAATGGTACATTACTCGAACTGATCACCATTCGAACTCATAGAGTTCATTCGGA

Probe1：SH-AAAAAATGATCAGTTCGAGTAATGTA

Probe2：CCATTCGAACTCATAGAGTT

Probe3：TACATTACTCGAACTGATCA。

将设计好的Hairpin DNA、Probe1、Probe2、Probe3序列交由大连宝生物工程有限公司合成。

2、纳米金的制备

纳米金的制备采用氯金酸还原法制备：将0.01％氯金酸溶液250mL置于双颈瓶中，快速搅拌加热至沸腾，迅速加入1％的柠檬酸三钠溶液10mL，继续加热搅拌，至溶液变为深红色，除去热源后继续搅拌至室温，4℃避光保存备用。

3、纳米金-Probe 1复合物的合成

将上述1mL纳米金溶液浓缩成200μL后加入20μL浓度为10μM的Probe 1，充分混匀，在避光条件下，80rpm轻轻振荡16h，加入PBS溶液(20mM PB，0.6M NaCl，pH＝7.2)30μL，超声震荡处理，超声功率100W，超声时间10min。4℃静置24h，吸取上清，4℃、12000r/min离心10min，弃上清，用PBS溶液(20mM PB，0.6M NaCl，pH＝7.2)500μL漂洗，12000r/min离心5min，弃上清，最后用PBS溶液(20mM PB，0.6M NaCl，pH＝7.2)100μl重悬沉淀，4℃避光保存。

4、试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备。

(1)样品垫(17mm×5mm)由玻璃纤维组成，将样品垫在10mM PBS缓冲液(pH7.2)中浸泡5min，并在37℃下干燥1h。

(2)金标结合垫(8mm×5mm)由玻璃纤维组成，将40μL步骤2制备的纳米金-探针1复合物滴加到玻璃纤维垫上，在37℃干燥1h。

(3)将硝酸纤维素膜(25mm×5mm)在10mM PBS缓冲液(pH7.2)中浸泡5min，并在37℃下干燥2h。在硝酸纤维素膜一端划上10μM的probe2溶液做为检测线，另一端划上10μM的Probe3溶液做为质控线，两条线之间的间隔为5mm，紫外灯下交联1h。

(4)吸收垫(30mm×5mm)由吸水纸组成，在10mM PBS(pH7.2)缓冲液中浸泡5min，在37℃下干燥1h。

(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板(77mm×5mm)上，各部分间应有2～3mm的重叠，组装完成后经重物过夜压实，4℃下干燥储存。

实施例3

本实施例的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的检测方法，包括以下步骤：

1、样品的制备

取PNRSV阳性樱桃植株及无病毒组培苗(阴性对照)叶片，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，采用CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取叶片总RNA，取1μg总RNA进行DNaseⅠ处理去除残余的DNA，95℃加热5min使酶失活后，冰上冷却，采用cDNA第1链合成试剂盒进行反转录获得cDNA。

2、ExoⅢ酶切放大

测定上述步骤制备的cDNA的浓度，稀释成100ng/mL，取10μL，加5μL10×杂交Buffer(3M NaCl，0.1％SDS，0.1M PB，pH7.0)，在95℃下加热5min，然后迅速置于冰水浴中，使之形成自由直链状态。将10μM发夹型DNA溶液5μL加入10μL双蒸水中，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温，使其退火形成发夹型的二级结构。然后，将上述两种DNA溶液混合，加入ExoⅢ外切酶4μL，双蒸水补齐至50μL，37℃酶切60min，将反应后的溶液在80℃加热10min，使ExoⅢ外切酶失活，酶切反应终止，最后将酶切反应液冷却至室温，用于试纸条的检测；

3、试纸条检测

将酶切反应液滴加在实施例1制备的核酸检测试纸条的样品垫上，再加5mM PBS缓冲液(pH7.0)100μL作为展开液冲洗试纸条，经过10min溶液的展开，检测阳性植株样本的试纸条检测线和质控线都显示清晰的条带，检测到了阳性植株中PNRSV病毒的存在；而检测无毒组培苗样本的试纸条仅质控线显示红色条带，说明制备的试纸条有效。

为了研究试纸条的特异性，我们分别采集李属坏死环斑病毒(PNRSV)、樱桃小果病毒-2(LChV-2)、李矮缩病毒(PDV)、樱桃病毒A(CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)和樱桃潜花叶病毒(CLMV)的阳性植株叶片提取RNA，反转录cDNA后，经ExoⅢ酶切，酶切液分别滴到PNRSV病毒检测试纸条上进行检测。结果所有试纸条的质控线都显色，说明试纸条有效。而仅PNRSV病毒对应的试纸条的检测线显色，其它病毒所对应的试纸条的检测线均不显色，说明本发明制备的试纸条检测特异性好，能排除其它樱桃病毒的干扰。

实施例4

本实施例的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的检测方法，包括以下步骤：

1、样品的制备

取PNRSV阳性樱桃植株及无病毒组培苗(阴性对照)叶片，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，采用CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取叶片总RNA，取1μg总RNA进行DNase Ⅰ处理去除残余的DNA，95℃加热5min使酶失活后，冰上冷却，采用cDNA第1链合成试剂盒进行反转录获得cDNA。

2、ExoⅢ酶切放大

测定上述步骤制备的cDNA的浓度，稀释成1ng/mL，取10μL，加10×杂交Buffer(1.5M NaCl，0.15M柠檬酸钠，pH7.2)，在95℃下加热5min，然后迅速置于冰水浴中，使之形成自由直链状态。将10μM发夹型DNA溶液5μL加入10μL双蒸水中，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温，使其退火形成发夹型的二级结构。然后，将上述两种DNA溶液混合，加入ExoⅢ外切酶4μL，双蒸水补齐至50μL，37℃酶切60min，将反应后的溶液在80℃加热10min，使ExoⅢ外切酶失活，酶切反应终止，最后将酶切反应液冷却至室温，用于试纸条的检测；

3、试纸条检测

将酶切反应液滴加在实施例2制备的核酸检测试纸条的样品垫上，再加10mM PBS缓冲液(pH 7.2)100μL作为展开液冲洗试纸条，经过10min溶液的展开，检测阳性植株样本的试纸条检测线和质控线都显示清晰的条带，检测到了阳性植株中PNRSV病毒的存在；而检测无毒组培苗样本的试纸条仅质控线显示红色条带，说明制备的试纸条有效。

为了研究试纸条的特异性，我们分别采集李属坏死环斑病毒(PNRSV)、樱桃小果病毒-2(LChV-2)、李矮缩病毒(PDV)、樱桃病毒A(CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)和樱桃潜花叶病毒(CLMV)的阳性植株叶片提取RNA，反转录cDNA后，经ExoⅢ酶切，酶切液分别滴到PNRSV病毒检测试纸条上进行检测。结果所有试纸条的质控线都显色，说明试纸条有效。而仅PNRSV病毒对应的试纸条的检测线显色，其它病毒所对应的试纸条的检测线均不显色，说明本发明制备的试纸条检测特异性好，能排除其它樱桃病毒的干扰。

对比例1

一种快速检测PNRSV-2核酸检测试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处在于参考目前RT-PCR分子检测方法中采用的引物序列PNRSV-F：CGAATTTGCAATCATACCC(卢美光,吴冰,高蕊,等.我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测[J].植物保护,2015,41(1):98-103)，并根据NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，确定检测序列，以此为根据设计检测过程中使用的核酸序列和探针，具体序列如下：

Hairpin DNA:

CAATCATACCCACGCTGGTGTACATTACTCGAACTGATCACACCAGCGTGGGTATGATTGCAAATTCG

Probe1：SH-AAAAAATGATCAGTTCGAGTAATGTA

Probe2：CACCAGCGTGGGTATGATTG

Probe3：TACATTACTCGAACTGATCA

按照实施例1条件组装试纸条，同样对PNRSV病毒阳性植株叶片提取RNA，反转录，并经ExoⅢ酶切后检测，结果该组装试纸条结果仅质控线有显色，而检测线不显色，可见设计的Hairpin DNA不能与病毒序列很好的结合，引发由ExoⅢ酶切产生的循环，不能产生足够的信号富集，导致检测线不能显色。说明探针的选用会直接影响试纸条的检测结果，而根据此用于分子生物学检测的引物序列设计的探针并不适用于本发明。

对比例2

一种快速检测PNRSV-2核酸检测试纸条的制备方法，步骤同实施例2。不同之处在于参考目前RT-PCR分子检测方法中的引物序列PNRSV-Fr：TGAAGGACCAACCGAGAG(宗晓娟,王文文,王甲威,等.SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用[J].植物保护学报,39(6):497-502.)，并根据NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，确定检测序列，以此为根据设计检测过程中使用的核酸序列和探针，具体序列如下：

Hairpin DNA:

CAACCGAGAGGTTGGCAGTTTACATTACTCGAACTGATCAAACTGCCAACCTCTCGGTTGGTCCTTCA

Probe1：SH-AAAAAATGATCAGTTCGAGTAATGTA

Probe2：AACTGCCAACCTCTCGGTTG

Probe3：TACATTACTCGAACTGATCA

按照实施例1条件组装试纸条，同样对PNRSV病毒阳性植株叶片提取RNA，反转录，并经ExoⅢ酶切后检测，结果该组装试纸条结果仅质控线有显色，而检测线不显色，可见设计的Hairpin DNA不能与病毒序列很好的结合，引发由ExoⅢ酶切产生的循环，不能产生足够的信号富集，导致检测线不能显色。说明探针的选用会直接影响试纸条的检测结果，而根据此用于分子生物学检测的引物序列设计的探针并不适用于本发明。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 发夹DNA(人工序列)

<400> 1

aactctatga gttcgaatgg tacattactc gaactgatca ccattcgaac tcatagagtt 60

cattcgga 68

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 探针1(人工序列)

<400> 2

aaaaaatgat cagttcgagt aatgta 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> DNA 探针2(人工序列)

<400> 3

ccattcgaac tcatagagtt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> DNA 探针3(人工序列)

<400> 4

tacattactc gaactgatca 20