一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用 (Site-directed mutagenesis modified alginate lyase mutant and application thereof ) 是由 史劲松 李恒 李星霖 吴雯 龚劲松 于 2020-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用,属于酶工程技术领域。本发明的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸和/或第222位精氨酸替换为赖氨酸。本发明通过分子对接模拟确定褐藻胶裂解酶活性中心氨基酸并进行定点饱和突变改变蛋白质分子活性位点附近氨基酸残基,提高褐藻胶裂解酶催化效率,进一步提高褐藻胶裂解酶产量。本发明构建的褐藻胶裂解酶分泌能力增强的重组大肠杆菌可将褐藻胶裂解酶酶活较出发菌株提高2.83倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高,摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶酶活达到15000U/mL,更适合工业应用,可降低生产成本,提高生产效率。(The invention discloses an alginate lyase mutant modified by site-specific mutagenesis and application thereof, belonging to the technical field of enzyme engineering.A 212 th glutamic acid of the alginate lyase with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.1 is replaced by histidine and/or a 222 th arginine is replaced by lysine.)
技术领域
本发明涉及一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
褐藻是三大藻类之一，主要成分为褐藻胶、甘露醇和海带多糖。其中，甘露醇和海带多糖的利用的相关研究较为成熟，因此，如何高效降解褐藻胶并实现工业化应用是目前研究的热点。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)构成的线性多糖，其降解产物褐藻寡糖具有重要的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、促进植物根细胞生长等，因此受到了广泛的关注。
褐藻胶裂解酶(Aly)可以通过β-消除反应机制来降解褐藻胶，并且在降解产物的非还原端形成不饱和的碳碳双键，由此于紫外235nm下产生特殊吸收峰，可用来进行产物检测。根据Aly的底物特异性，可将其分为polyM，polyG和双功能型的褐藻胶裂解酶；根据其酶切方式，可将其分为内切型(endo-type)和外切型(exo-type)褐藻胶裂解酶，内切型Aly降解褐藻胶的终产物为褐藻寡糖(AOs)，常见产物聚合度为2-6，而外切型Aly的产物单一，终产物为单糖，但也有二糖为最小酶切单元的报道；根据CAZY数据库的分类，褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(PL)，并具体分为PL-5，PL-6，PL-7，PL-14，PL-15，PL-17和PL-18七个家族。
目前，制备褐藻寡糖的方法主要是酸解等化学法，制备条件剧烈且容易造成环境污染，而相比之下，生物法降解褐藻多糖条件温和、易于控制并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的褐藻胶裂解酶是十分必要的。目前的研究表明，基因工程是提高褐藻胶裂解酶酶活的主要手段。另外，常规的提高重组蛋白表达水平的方法是更换强启动子，高分泌能力强的信号肽等。
根据褐藻胶裂解酶的性质不同具有不同的划分方式：根据褐降解底物专一性的不同褐藻胶裂解酶可分为三类：专一性酶解甘露糖醛酸片段(PolyM)的酶，专一降解古罗糖醛酸片段(Poly G)的酶以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。但是现有的褐藻胶裂解酶的性能还需要进一步提高以适应工业化应用的需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过PCR定点饱和突变得到催化活性和底物偏好性明显提高的突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。
本发明的第一个目的是提供一种褐藻胶裂解酶突变体，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸和/或第222位精氨酸替换为赖氨酸。
进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，将将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第222位精氨酸替换为赖氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸，并将第222位精氨酸替换为赖氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达质粒。
进一步地，所述的质粒是以pET-28a(+)为载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是以细菌、真菌或动植物细胞为宿主。
本发明的第五个目的是提供所述的重组菌在生产含褐藻胶裂解酶的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过分子对接模拟确定褐藻胶裂解酶活性中心氨基酸并进行定点饱和突变改变蛋白质分子活性位点附近氨基酸残基，提高褐藻胶裂解酶催化效率，进一步提高褐藻胶裂解酶产量。本发明构建的褐藻胶裂解酶分泌能力增强的重组大肠杆菌可将褐藻胶裂解酶酶活较出发菌株提高2.83倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高，摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶酶活达到15000U/mL，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
附图说明
图1为突变后褐藻胶裂解酶核酸凝胶电泳图；M，marker；1～分别为：Alg212A，Alg222A，Alg212H，Alg222K，Alg212H-222K；
图2为突变菌株中褐藻胶裂解酶蛋白凝胶电泳图；M，marker；1～3分别为：Alg212H，Alg222K，Alg212H-222K；
图3为定点饱和突变为丙氨酸时褐藻胶裂解酶酶活；
图4为对212位点突变时褐藻胶裂解酶酶活；
图5为对222位点突变时褐藻胶裂解酶酶活；
图6为组合突变前后褐藻胶裂解酶酶活。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
培养基：
LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 5.0g/L。
TB发酵培养基：蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH2PO417mmol/L，K2HPO4 72mmol/L。
褐藻胶裂解酶酶活力的测定：
在改良DNS法上稍作调整。酶活测定条件：0.1mL酶液加入0.9mL 1％海藻酸钠溶液中，混匀后于45℃下反应20min，然后向体系中加入1mL DNS，沸水浴3min终止反应，迅速定容至10mL，吸取200μL加入96孔板，于520nm处测定吸光值。对照组采用去离子水代替粗酶液。1酶活活力单位(U)定义：上述条件下，1mL的酶液每分钟产1μg还原糖所需的酶量。配制不同浓度的葡萄糖醛酸溶液，加入1mL DNS试剂后进行反应，并于520nm处测定不同浓度溶液的吸光值。根据标准曲线计算酶活。
比酶活(U/mg)＝酶活/蛋白质量
表1引物序列
实施例1：大肠杆菌来源褐藻胶裂解酶晶体结构模拟
以己报道的alginate lyase AlyA5褐藻胶裂解酶(PDB code：4BE3)为模板(crystal structure of the exolytic PL7 alginate lyase AlyA5 from Zobelliagalactanivorans,2013年公开)(两者氨基酸相似度为38.2％)，利用分子模拟对接软件，模拟大肠杆菌来源的褐藻胶裂解酶的晶体结构。实施实例1中蛋白3D结构模拟对接后选择褐藻胶裂解酶催花域附近的第212位谷氨酸与第222位精氨酸为本研究的褐藻胶裂解酶的活性位点。
实施例2：褐藻胶裂解酶活性位点突变对褐藻胶裂解酶酶活表达的影响
利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物212A-F,212A-R，222A-F,222A-R(如表1示)，以已经构建的pET-28a(+)为模版，进行PCR，将褐藻胶裂解酶第212位谷氨酸和第222位精氨酸分别替换为丙氨酸，PCR反应条件为：98℃5min，34个循环(98℃30S、57.6℃60S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star(Premix)DNA20μL，ddH2O 17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。在Bam HI和Mlu I快切酶作用下进行酶切，尝试利用T4连接酶方法进行连接处理PCR回收产物，将其转化到感受态E.coil JM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，得到定点饱和突变的重组菌株。
实施例2中将基因工程褐藻胶裂解酶第212位谷氨酸和第222位精氨酸定点突变为丙氨酸时褐藻胶裂解酶酶活均有较大幅度下降(如图3所示)，分别为1200U/ml和900U/ml，是出发菌株酶活的0.22倍和0.17倍，命名为pET-28a(+)-Alg212A、pET-28a(+)-Alg222A，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，以获得定点突变的突变菌株E.coli Rosetta-pET-28a(+)-Alg212A、E.coli Rosetta-pET-28a(+)-Alg222A。
证明这两个位点对于基因工程褐藻胶裂解酶酶活是有较大影响的。
实施例3：褐藻胶裂解酶活性位单点突变对褐藻胶裂解酶酶活表达的影响
利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物212H-F，212H-R和222K-F，222K-R(如表1示)，以已经构建的pET-28a(+)-Alg212A为模版，进行PCR，突变替换第212位谷氨酸或者第222位精氨酸，PCR反应条件为：98℃5min，34个循环(98℃30S、57.8℃60S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star(Premix)DNA 20μL，ddH2O17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。在Bam HI和Mlu I快切酶作用下进行酶切，尝试利用T4连接酶方法进行连接处理PCR回收产物，将其转化到感受态E.coil JM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒以获得定点突变的突变菌株。
实施例3中将基因工程褐藻胶裂解酶第212位谷氨酸点突变为组氨酸时褐藻胶裂解酶酶活有明显提升(如图4所示)，为7300U/ml，是出发菌株酶活的1.38倍，命名为pET-28a(+)-Alg212H，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，以获得定点突变的突变菌株E.coliRosetta-pET-28a(+)-Alg212H。证明对褐藻胶裂解酶第212位进行点突变可以明显改变该酶的酶活。
实施例3中将基因工程褐藻胶裂解酶第222位精氨酸点突变为赖氨酸时褐藻胶裂解酶酶活有明显提升(如图5所示)，为8000U/ml，是出发菌株酶活的1.51倍，命名为pET-28a(+)-Alg222K，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，以获得定点突变的突变菌株E.coliRosetta-pET-28a(+)-Alg222K。证明对褐藻胶裂解酶第222位进行点突变可以明显改变该酶的酶活。
实施例4：褐藻胶裂解酶活性位点组合突变对褐藻胶裂解酶酶活表达的影响
利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物222K-F,222K-R(如表1示)，以已经构建的pET-28a(+)-Alg212H为模版，进行PCR，突变替换第222位精氨酸，PCR反应条件为：98℃5min，34个循环(98℃30S、57.8℃60S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star(Premix)DNA 20μL，ddH2O 17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。在Bam HI和Mlu I快切酶作用下进行酶切，尝试利用T4连接酶方法进行连接处理PCR回收产物，将其转化到感受态E.coil JM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET-28a(+)-Alg212H-222K，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，以获得定点突变的突变菌株E.coliRosetta-pET-28a(+)-Alg212H-222K。
实施例4中将基因工程褐藻胶裂解酶第212位谷氨酸和第222位精氨酸定点突变为组氨酸和赖氨酸时褐藻胶裂解酶酶活有较大幅度提高(如图6所示)，为15000U/ml，是出发菌株酶活的2.83倍，命名为pET-28a(+)-Alg212H-222K，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，以获得定点突变的突变菌株E.coli Rosetta-pET-28a(+)-Alg212H-222K。证明组合突变这两个位点可以明显提高基因工程褐藻胶裂解酶酶活。
实施例5：褐藻胶裂解酶生产菌株的验证
挑选实施例2、3、4中转化子接种到装有LB液体培养基96孔板中，37℃，培养6h，转接到发酵培养基中，接种量为2％，培养30h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活。挑选产量发生明显变化的菌株进行摇瓶发酵。检测褐藻胶裂解酶酶活，结果如图2所示。又选取其中突变位点影响较大的第212位和第222位进行蛋白凝胶电泳验证。蛋白电泳上显示(图2)，其表达水平没有显著的差异。随后，利用Ni2+亲和柱进行纯化，获得高纯度蛋白。
分析酶学性质如下表2示，动力学参数分析表明，突变体对褐藻胶的亲和力显著提高，催化效率也显著增加。与野生酶相比，Km分别降低了2.1～2.5倍，Kcat值基本没有变化，而催化效率(Kcat/Km)提高为野生酶的2.7～3.2倍。与之相对性的，我们发现产量提高的突变体的比酶活也显著提高，其中Alg212H-222K比酶活较野生酶提高2.7倍，达到382U/mg。同时稳定性分析表明，突变体最适反应温度没有显著变化(16℃)，通过检测突变体16℃的半衰期表明，突变体半衰期(t1/2)显著的提高，分别为261、288min，较野生酶提高4.5倍。分析自由能结果表明，突变体自由能分别提高3.63kJ/mol。上述结果表明，继续突变改造替换后能显著的提高褐藻胶裂解酶的底物结合能力、催化效率和热稳定性。
表2突变体酶学性质
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 352
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Arg Asn Thr Arg Val His His Pro Leu Val Thr Ala Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ala Val Ala Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ala Asn Asp Thr
20 25 30
Pro Pro Gly Glu Thr Phe Asp Leu Asp Thr Trp Lys Leu Thr Leu Pro
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Met Asp Ala Asp Gly Asn Gly Lys Val Asp Glu Ile Lys Val Ala Asp
50 55 60
Leu Gln Ser Tyr Arg His Ser Asp Tyr Phe Tyr Leu Asp Asp Asp Ser
65 70 75 80
His Met Val Phe Val Thr Pro Asn Lys Ala Phe Thr Thr Pro Asn Ser
85 90 95
Ser Asn Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gln Met Leu Arg Gly Thr Asp Thr
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Ser Ile Gly Thr His Asp Pro Lys Asn Asn Phe Ala Leu Ala Ser Asn
115 120 125
Gln His Ala Asp Glu Phe Ala Gln Ile Gly Gly Tyr Leu Ser Ala Thr
130 135 140
Leu Arg Val Glu His Val Ala Glu Arg Ser Lys Lys Pro Asp Arg Lys
145 150 155 160
Ser Ala Tyr Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Gly Lys Asp Gln
165 170 175
Ala Leu Met Glu Ala Asp Glu Gly Phe Gly His Gly Asn Glu Pro Leu
180 185 190
Lys Ile Phe Tyr Lys Lys Leu Pro Asp Asp Lys Thr Gly Ser Val Phe
195 200 205
Trp Asn Tyr Glu Lys Asn Leu Ala Lys Glu Asp Pro Lys Arg Thr Asp
210 215 220
Val Ser Tyr Ala Val Trp Gly Asn Asp Trp Ser Ser Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Gly Lys Glu Gly Ile Ala Leu Gly Asp Thr Phe Ser Tyr Lys Val Glu
245 250 255
Val Lys Gly Asp Ile Met His Leu Thr Phe Asn Ala Asp Gly His Pro
260 265 270
Thr His Asn Phe Glu Ile Asn Leu Ala Asp Asn Val Asp Ala Asn Gly
275 280 285
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290 295 300
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<211> 352
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<213> （人工序列）
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tcttttcgta gttccagaac accgagccag tg 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
tcccaaagaa acggatgtca gctatgcggt at 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
catccgtttc tttgggatct tccttggcga ga 32
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ctggaactac aaaaagaatc tcgccaagga agatcc 36
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
tctttttgta gttccagaac accgagccag tg 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
tcccaaaaaa acggatgtca gctatgcggt at 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
catccgtttt tttgggatct tccttggcga ga 32
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
ctggaactac cataagaatc tcgccaagga agatcc 36
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
tcttatggta gttccagaac accgagccag tg 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
tcccaaacat acggatgtca gctatgcggt at 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
catccgtatg tttgggatct tccttggcga ga 32