阅读说明：本技术 以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂 (Cat calicivirus inhibitor containing nitazoxanide and mizoribine as effective components ) 是由 王开 崔占鼎 张双 李登亮 裴志花 郭衍冰 赵艳丽 董浩 黄海龙 张茜 陈晓学莹 于 2020-02-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以硝唑尼特与咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂,其中硝唑尼特的作用浓度为1.529μmol/L～200μmol/L,在200μmol/L时,细胞活性大于90%。咪唑立宾的作用浓度为1.529μmol/L～200μmol/L,在200μmol/L时,且细胞活性大于90%。硝唑尼特与咪唑立宾对猫杯状病毒的抑制作用发生在病毒感染的复制阶段。0.2μmol/L～2.5μmol/L浓度的硝唑尼特与0.6μmol/L～20μmol/L浓度的咪唑立宾同时使用时,具有协同作用,其中当硝唑尼特0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾2.5μmol/L～10μmol/L时最为显著。(The invention discloses a feline calicivirus inhibitor with nitazoxanide and mizoribine as effective components, wherein the action concentration of the nitazoxanide is 1.529 mu mol/L-200 mu mol/L, the cell activity is more than 90% at 200 mu mol/L0, the action concentration of the mizoribine is 1.529 mu mol/L1-200 mu mol/L2, at 200 mu mol/L3, the cell activity is more than 90%, the inhibition effect of the nitazoxanide and the mizoribine on feline calicivirus occurs at the replication stage of virus infection, the nitazoxanide with the concentration of 0.2 mu mol/L-2.5 mu mol/L and the mizoribine with the concentration of 0.6 mu mol/L-20 mu mol/L have synergistic effect, and the nitazoxanide with the concentration of 0.3 mu mol/L-1.2 mu mol/L and the mizoribine with the concentration of 0.5 mu mol/L-10 mu mol/L is most obvious.)

以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种以硝唑尼特与咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂。

背景技术

猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)是杯状病毒科(Caliciviridae)的主要代表，其主要引起猫科动物的上呼吸道疾病。一些强毒株可引起全身性的疾病，主要体现于皮下水肿，多个器官（肝、脾、胰腺）的坏死和间质性肺炎。过去30年中，市场上已有可购买的猫杯状病毒商品化疫苗，但猫杯状病毒仍然在猫群中高度流行，并且目前市售的疫苗中没有一种可以保护猫免受所有猫杯状病毒毒株的侵害。就猫杯状病毒而言，研究人员已发现了多种药物在体外对其有抗病毒作用。但其中大部分都停留在单一化合物的抗病毒研究的水平上，这些化合物是否具有药物协同作用的效果还未知。因此，迫切需要开发一种能有效抗猫杯状病毒的药物，来抑制或控制猫杯状病毒的传播。

硝唑尼特(Nitazoxanide, NTZ)，中文别名2-乙酰氧基-N-（5-硝基-2-噻唑基）苯甲酰胺，是一种广谱的抗原虫药物，如治疗隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫引起的腹泻。此外，它也被证明对多种RNA和DNA病毒有抗病毒作用。硝唑尼特是被美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)批准的口服药物之一，同时其也被发现对猫杯状病毒同科的诺如病毒(Norwalk Viruses, NV)有抗病毒作用。咪唑立宾(Mizoribine, MZR)，中文别名1-[（2R,3R,4S,5R）-3,4-二羟基-5-（羟甲基）氧戊环-2-基]-5-羟基-1H-咪唑-4-羧酰胺，是一种咪唑核苷，由于其对淋巴细胞有抑制作用，因此在一些国家或地区已被用作免疫抑制剂，用于治疗肾移植、自身免疫性疾病和类固醇抵抗性肾病综合征。近些年发现，咪唑立宾对巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)、严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome, SARS-CoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus, FMDV)具有抗病毒作用。

发明内容

本发明的目的是针对目前猫杯状病毒防治过程中存在的问题，而提供一种以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂。所述抑制剂能在体外有效抑制猫杯状病毒的复制，同时具有较低的细胞毒性，可显著降低猫杯状病毒的病毒滴度及其mRNA的表达水平。

硝唑尼特和/或咪唑立宾在制备抗猫杯状病毒药物方面的应用。

一种猫杯状病毒抑制剂，硝唑尼特和咪唑立宾的摩尔比为：0.2～2.5: 0.6～20；

所述的摩尔比为0.3～1.2: 2.5～10。

本发明的有益效果：

1、本发明所述猫杯状病毒抑制剂，以硝唑尼特和咪唑立宾为基础，评估其对猫杯状病毒的抑制效果，该抑制剂能从体外有效的抑制猫杯状病毒的复制。所述的抑制作用发生在猫杯状病毒感染的复制阶段。更进一步，在病毒复制的任意时间，更确切地说，主要在复制阶段的前8h，硝唑尼特与咪唑立宾对病毒均具有抑制作用。加之，硝唑尼特与咪唑立宾成分清楚单一，这就为将硝唑尼特与咪唑立宾应用于猫杯状病毒的分子或细胞学研究，以及进行抗病毒药物的研究奠定了基础和提供了便利的条件。

2、本发明所述猫杯状病毒抑制剂，基于硝唑尼特与咪唑立宾能够抑制猫杯状病毒的复制，提出其在制备抗猫杯状病毒药物中的应用，当硝唑尼特浓度高至200μmol/L时，依旧能够保证正常细胞活性率在90%以上，同时硝唑尼特浓度为20μmol/L时，相比于阴性对照组，处理后猫杯状病毒的mRNA表达水平下降约88%，猫杯状病毒的病毒滴度下降约25%。当咪唑立宾浓度高至200μmol/L时，依旧能够保证正常细胞活性率在90%以上，同时咪唑立宾浓度为20μmol/L时，相比于阴性对照组，处理后猫杯状病毒的mRNA表达水平下降约92%，猫杯状病毒的病毒滴度下降约24%。将其制备成猫杯状病毒药物，相比于常用的疫苗免疫，制备简单、使用方便、成本较低、作用周期较长。

3、本发明所述猫杯状病毒抑制剂，基于硝唑尼特与咪唑立宾能够协同抑制猫杯状病毒的复制，提出其在制备抗猫杯状病毒药物中的应用。当硝唑尼特与咪唑立宾的药物浓度分别不高于2.5μmol/L和20μmol/L时，相比于阴性对照，两者合用具有抗猫杯状病毒的协同作用。当0.2μmol/L～2.5μmol/L的硝唑尼特与0.6μmol/L～20μmol/L的咪唑立宾同时使用时，两个药物显示出对猫杯状病毒抗病毒的协同作用，其中当硝唑尼特浓度范围为0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾浓度范围为2.5μmol/L～10μmol/L最为显著，这就为利用硝唑尼特与咪唑立宾相关药物来防治猫杯状病毒感染奠定了理论基础。

附图说明

图1是不同浓度的硝唑尼特对F81细胞的毒性结果图；

图2是不同浓度的咪唑立宾对F81细胞的毒性结果图；

图3是不同浓度的硝唑尼特对FCV抑制作用的间接免疫荧光OD分析图；

图4是不同浓度的硝唑尼特对FCV病毒滴度的影响差异图；

图5是不同浓度的硝唑尼特对FCV mRNA表达水平的影响差异图；

图6是不同浓度的咪唑立宾对FCV抑制作用的间接免疫荧光OD分析图；

图7是不同浓度的硝唑尼特对FCV的抑制浓度分析图；

图8是不同浓度的咪唑立宾对FCV病毒滴度的影响差异图；

图9是不同浓度的咪唑立宾对FCV mRNA表达水平的影响差异图；

图10是不同浓度的咪唑立宾对FCV的抑制浓度分析图；

图11是不同时间添加硝唑尼特对FCV病毒滴度的影响差异图；

图12是不同时间添加硝唑尼特对FCV mRNA表达水平的影响差异图；

图13是不同时间添加咪唑立宾对FCV病毒滴度的影响差异图；

图14是不同时间添加咪唑立宾对FCV mRNA表达水平的影响差异图；

图15是不同浓度的硝唑尼特对FCV协同抑制作用的分析图；

图16是不同浓度的硝唑尼特与咪唑立宾对FCV协同抑制作用的分析图。

具体实施方式

实验材料

1、药物来源：咪唑立宾（Mizoribine, MZR）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号为M129842。硝唑尼特（Nitazoxanide, NTZ）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号为N159057。

2、生化试剂：MEM、PBS、FBS购自Gibco。DMSO购自Sigma。CCK8购自白鲨生物。SimplyP总RNA提取试剂盒购自Bioer。RNA反转录试剂、SYBR® Prime-ScriptTM RT-PCR Kit购自宝生生物。抗猫杯状病毒IgG(一抗)购自VMRD，二抗FITC标记兔抗猫IgG购自博奥森。

3、RT-qPCR引物序列如表1所示。

实施例1 硝唑尼特与咪唑立宾的细胞毒性

为确定硝唑尼特与咪唑立宾的细胞毒性，应用CCK8试剂盒对硝唑尼特与咪唑立宾的细胞毒性进行了检测，具体操作步骤如下：将硝唑尼特与咪唑立宾在二甲基亚砜(DMSO)中溶解终浓度为100mmol/L的母液，之后用含有2%FBS的MEM溶解至不同浓度。F81细胞在96孔细胞培养板上生长至单层之后，去除含有8%FBS的MEM培养液，并将含有不同浓度(20、40、60、80、100和200μmol/L)的咪唑立宾或(20、40、60、80、100和200μmol/L)的硝唑尼特的溶液加入96孔细胞培养板的每列中，并用含有0.4%的DMSO的MEM作为模拟处理。将96孔细胞培养板在37℃和5%CO₂的二氧化碳培养箱中孵育24h或72h，弃去培养液之后，用PBS洗涤两次，每孔加入180μl无FBS的MEM，每孔再加入20μl的CCK8溶液，在37℃孵育1～2h。使用Cmax Plus酶标仪读取450nm波长下的光密度(OD)。之后按照[OD(化合物)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100%计算细胞存活率。低于50%细胞抑制浓度(CC₅₀)的浓度定义为无毒浓度。最后结果利用Spss 18.0和Graphpad Prism 8软件分析并作图。

由图1可知，当硝唑尼特浓度不高于200μmol/L时，能够保证正常F81细胞活性率在90%。由图2可知，当咪唑立宾浓度不高于200μmol/L时，能够保证正常F81细胞活性率在90%以上。因此，当以硝唑尼特用作抗猫杯状病毒的药物时，其浓度在200μmol/L以下时有较低的细胞毒性；当以咪唑立宾用作抗猫杯状病毒的药物时，其浓度在200μmol/L以下时有较低的细胞毒性。

实施例2 硝唑尼特与咪唑立宾对猫杯状病毒的抗病毒作用的确定

将200μl含有100TCID₅₀的猫杯状病毒和不同浓度咪唑立宾或硝唑尼特，加入铺满单层F81细胞的96孔细胞培养板中(重复3个孔)，之后在37℃和5%CO₂中孵育28h，并用含有100TCID₅₀的猫杯状病毒和0.4%的DMSO的MEM作为模拟处理。反复冻融三次后进行TCID₅₀和RT-qPCR检测，以评估其对猫杯状病毒的抗病毒作用。同时确定其半数最大抑制浓度(IC₅₀)，并用GraphPad Prism 8绘制结果。同时为更直观的观察其对猫杯状病毒的抗病毒作用，进行间接免疫荧光检测。将96孔细胞培养板中的培养液弃去并用PBS洗涤两次后，再用冷丙酮固定和洗涤。使用300倍稀释的抗猫杯状病毒的IgG做为一抗，200倍稀释的FITC标记的兔抗猫IgG作为二抗，避光，并将其放置于37℃恒温培养箱中培养1h，在Leica DMi8倒置荧光显微镜下观察荧光，同时用软件Image J对结果进行灰度分析。最后结果利用Spss 18.0和Graphpad Prism 8软件分析并作图。

由图3可知与添加0μmol/L的硝唑尼特可显著抑制猫杯状病毒在F81细胞增殖。进一步由图4得知，当硝唑尼特浓度分别为20、40、60、80、100和200μmol/L时其可显著降低猫杯状病毒的病毒滴度，其结果呈现出具有剂量依赖性的下降趋势。说明硝唑尼特可在一定浓度范围内抑制猫杯状病毒的复制。进一步由图5可知，硝唑尼特可降低猫杯状病毒的基因表达水平。进一步由图6可知，硝唑尼特的IC₅₀为1.529μmol/L。说明硝唑尼特在1.529μmol/L～200μmol/L浓度范围内具有对猫杯状病毒的抗病毒作用。由图7可知与添加0μmol/L的咪唑立宾相比，咪唑立宾可显著抑制猫杯状病毒在F81细胞增殖。进一步由图8可知，当咪唑立宾浓度分别为20、40、60、80、100和200μmol/L时，其可显著降低猫杯状病毒的病毒滴度，结果呈现出具有剂量依赖性的下降趋势。说明咪唑立宾可在一定浓度范围内抑制猫杯状病毒的复制，进一步由图9可知，咪唑立宾可降低猫杯状病毒的基因表达水平。进一步由图10可知，咪唑立宾的IC₅₀为12.68μmol/L。说明咪唑立宾在1.529μmol/L～200μmol/L浓度范围内具有对猫杯状病毒的抗病毒作用。

实施例3 硝唑尼特与咪唑立宾抑制病毒的复制

将200μl含有100TCID₅₀的猫杯状病毒，加入铺满单层F81细胞的96孔细胞培养板中（重复3个孔），并用含有100TCID₅₀的猫杯状病毒和0.4%的DMSO的MEM作为模拟处理。为了确定两种药物在F81细胞中的抗病毒作用是否有时间依赖性，分别在猫杯状病毒感染的-1h、0h、2h、4h、6h、8h使用了终浓度为20μmol/L的硝唑尼特或40μmol/L的咪唑立宾。在37℃和5%CO₂条件下，二氧化碳培养箱孵育28h后，检测病毒滴度和猫杯状病毒的基因表达水平。最后结果利用Spss 18.0和Graphpad Prism 8软件分析并作图。

由图11和图12可知与模拟组相比，硝唑尼特治疗组在-1h、0h、2h、4h、6h、8h感染后，病毒滴度和猫杯状病毒的基因表达量显着降低，表明猫杯状病毒感染8h后，硝唑尼特(20μmol/L)仍具有对抗猫杯状病毒的作用。说明硝唑尼特可在猫杯状病毒感染的复制阶段起作用。由图13和图14可知与模拟组相比，咪唑立宾治疗组在-1h、0h、2h、4h、6h、8h感染后，病毒滴度和猫杯状病毒的基因表达水平显著降低，表明猫杯状病毒感染8h后，咪唑立宾(40μmol/L)仍具有对猫杯状病毒的抗病毒作用。说明咪唑立宾可在猫杯状病毒感染的复制阶段起作用。

实施例4 硝唑尼特与咪唑立宾可协同抑制猫杯状病毒

为了验证咪唑立宾与硝唑尼特之间的药物协同作用，分别将硝唑尼特稀释至2.5μmol/L，咪唑立宾稀释至20μmol/L之后，采用棋盘法将两种药物进行梯度稀释并使两种药物充分混合。将200μl含有100TCID₅₀的猫杯状病毒与不同浓度混合的药物共同加入铺满单层F81细胞的96孔细胞培养板中（重复3个孔）。之后检测每个孔的病毒滴度，并采用SynergyFinder评估药物间的组合效果，之后使用零交互效能(Zero Interaction Efficacy, ZIP)模型计算不同药物浓度组合后的协同作用得分。对于每种处理至少进行3次试验，每次3个重复，，实验结果采用均值±标准误差的形式表示。

将利用棋盘法稀释的药物与猫杯状病毒充分混合，进行硝唑尼特与咪唑立宾的药物协同作用实验，最后通过ZIP模型统计不同药物剂量组合的得分情况。结果如图15、图16所示，硝唑尼特(0.2μmol/L～2.5μmol/L)与咪唑立宾(0.6μmol/L～20μmol/L)的ZIP协同作用平均得分为31.07，其中硝唑尼特浓度范围为0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾浓度范围为2.5μmol/L～10μmol/L时，二者具有最佳协同作用，其作用区域的得分为45.5，表明硝唑尼特与咪唑立宾在上述浓度范围内具有协同作用。

由上述实施例1-4的细胞水平试验可知，1.529μmol/L～200μmol/L浓度的硝唑尼特能够显著抑制病毒的病毒滴度，进一步的病毒mRNA的表达水平，在不影响正常细胞活性率的前提下，抑制效果显著。相比于模拟处理组照，硝唑尼特(20μmol/L)处理后病毒的mRNA表达水平下降约88%，病毒的病毒滴度下降约25%。1.529μmol/L～200μmol/L浓度的咪唑立宾能够显著抑制病毒的病毒滴度，进一步的病毒mRNA的表达水平，在不影响正常细胞活性率的前提下，抑制效果显著，相比于模拟处理组，咪唑立宾(20μmol/L)处理后病毒的mRNA表达水平下降约92%，病毒的病毒滴度下降约24%。另外，通过对病毒感染细胞的过程进行分别分析可知：对猫杯状病毒的抑制主要发生在复制阶段，同时发现硝唑尼特与咪唑立宾可对猫杯状病毒在F81细胞复制的早期阶段起作用，其中以-1h～8h内最为显著。进一步的，浓度为0.2μmol/L～2.5μmol/L的硝唑尼特与0.6μmol/L～20μmol/L的咪唑立宾同时使用时，发现两个药物对猫杯状病毒具有协同抑制作用，其中硝唑尼特的浓度范围为0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾的浓度范围为2.5μmol/L～10μmol/L时具有最佳协同作用。通过对硝唑尼特与咪唑立宾抑制猫杯状病毒复制的研究，为开发抗猫杯状病毒药物提供了理论基础和技术条件。