正丁醇基-2-O-（L-焦谷氨酸-N-6-）-α-D-呋喃果糖苷的新应用
阅读说明：本技术 正丁醇基-2-O-（L-焦谷氨酸-N-6-）-α-D-呋喃果糖苷的新应用 (New application of N-butyl alcohol group-2-O- (L-pyroglutamic acid-N-6-) -alpha-D-fructofuranoside ) 是由 雷霞 李冰 雷双媛 张正一 张子涵 王来 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的新应用,包括在治疗阿尔茨海默病中的应用、在神经元细胞增殖中的应用、在学习记忆和认知能力改善中的应用、在抑制AchE活性、提高ChAT及Ach含量中的应用。本发明中的L-焦谷氨酸α的空间构型使其可与毒蕈碱型受体M3结合,L-焦谷氨酸α与毒蕈碱型受体M3结合后,使阿尔茨海默病患者大脑中的Ach保留下来,从而提高了Ach含量,而L-焦谷氨酸β则无法与毒蕈碱型受体M3结合,这也说明了L-焦谷氨酸α具有更加优异的抗AD作用,本发明通过分子生物学为L-焦谷氨酸α抗AD提供了有效性依据,从而为开发抗AD药的研究提供新思路。(The invention discloses a new application of N-butyl alcohol group-2-O- (L-pyroglutamic acid-N-6-) -alpha-D-fructofuranoside, which comprises an application in treating Alzheimer disease, an application in proliferating neuron cells, an application in improving learning memory and cognitive ability, and an application in inhibiting AchE activity and increasing ChAT and Ach contents. The spatial configuration of the L-pyroglutamic acid alpha in the invention enables the L-pyroglutamic acid alpha to be combined with a muscarinic receptor M3, after the L-pyroglutamic acid alpha is combined with a muscarinic receptor M3, the Ach in the brain of an Alzheimer disease patient is retained, so that the Ach content is improved, and the L-pyroglutamic acid beta cannot be combined with a muscarinic receptor M3, which also indicates that the L-pyroglutamic acid alpha has more excellent anti-AD effect.)
技术领域
本发明涉及一种正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的新应用，属于制药技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。
目前，全世界有5种抗AD药物获上市资格，即多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚和多奈哌齐+美金刚复方制剂，这些药物均为化药，仅通过作用于单一致病机制来改善AD症状，并不能延缓疾病的发展。
另外，现有的药物对AD的改善机制研究不够深入，不能从分子生物学角度来验证药物具有治疗作用。而本发明可为正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷抗AD的有效性提供依据，为开发抗AD药物的研究提供新思路。
发明内容
为解决背景技术中提到的技术问题，本发明提供一种正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的新应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷在治疗阿尔茨海默病中的应用。即正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷在作为阿尔茨海默病治疗药剂中的应用。
所述的应用在神经元细胞增殖中的应用。即正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷在作为神经元细胞增殖药剂中的应用。
神经元细胞包括PC12细胞。
所述的应用在学习记忆和认知能力改善中的应用。即正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷在作为学习记忆改善药剂和认知能力改善药剂中的应用。
所述的应用包括在抑制AchE活性、提高ChAT及Ach含量中的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷与Ach竞争性地与毒蕈碱型受体M3结合，所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷与毒蕈碱型受体M3结合后，使阿尔茨海默病患者大脑中的Ach保留下来，从而相对地提高了Ach含量。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为Ach竞争性抑制剂的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为AchE活性抑制剂的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为ChAT含量增高剂的应用。
所述的应用在使下丘脑区内ERα含量增高；使海马中ERβ含量减少、P-P38/P38含量减少、APP和BACE1蛋白含量减少中的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为ERα含量增高剂、ERβ含量减少剂、P-P38/P38含量减少剂、APP蛋白含量减少剂和BACE1蛋白含量减少剂的应用。
所述的应用在降低凋亡因子Bad和Caspase-3的表达，增加抗凋亡因子Bcl-2的表达中的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为凋亡因子抑制剂和抗凋亡因子促进剂的应用，其中凋亡因子包括Bad和Caspase-3，抗凋亡因子包括Bcl-2。
所述的应用在ER-P38/MAPK信号通路调节Aβ代谢系统中的应用。
所述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷作为ER-P38/MAPK信号通路调节剂的应用。
本发明中的正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷为白色粉末，ESI-MS+在m/z348处可见[M+H]+离子峰，表明化合物分子量为347，确定分子式为C15H25NO8，其酸水解给出D–果糖，提示该化合物中含有果糖。
1H-NMR中可观察到δ4.35(1H,d,11.6，H-1-a)，δ4.24(1H,d,11.6，H-1-b)，δ3.96(1H,d,8.0，H-3)，δ3.91(1H,d,8.0，H-4)归属于果糖的氢质子信号；δ3.74(1H,m，-OCH2-a)，δ3.52(1H,m，-OCH2-b)，δ1.53(2H,m,-CH2)，δ1.37(2H,m,-CH2)，δ0.92(3H,t,7.2,-CH3)归属于正丁醇基的氢质子信号；还可观察到δ4.32(1H,dd,8.0,4.0,-CH)，δ2.49(1H,m,-CH2-a)，δ2.33(2H,m,-CH2)，δ2.23(1H,m,-CH2-b)归属于焦谷氨酸的氢质子信号。
在谱中13C-NMR中，一共可观察到15个碳信号，除了6个归属于果糖和4个归属于正丁基的碳信号外，剩余的5个碳信号δ181.2，173.4，57.1，30.2，25.8归属于L-焦谷氨酸。
HMBC谱中观察到谷氨酸上的次甲基质子信号δ4.32(1H,dd,8.0,4.0,-CH)除了与游离羧基碳信号(δ181.2)相关外，还与羰基碳信号(δ173.4)相关，表明谷氨酸形成了L-焦谷氨酸；观察到归属于正丁醇基羟甲基的一个氢质子信号δ3.74(1H,m，-OCH2-a)与果糖C-2碳信号(δ102.9)相关，表明正丁基连结在果糖的2位；还可观察到果糖上的1位羟甲基的两个氢质子信号δ4.35(1H,d,11.6，H-1-a)，δ4.24(1H,d,11.6，H-1-b)均与焦谷氨酸的内酯酰胺羰基碳信号(δ173.4)相关，表明L-焦谷氨酸通过氮原子与果糖的1位羟甲基成苷。
综上，结合DEPT、HSQC谱将1H-NMR和13C-NMR数据进行归属，该化合物的结构鉴定为：正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷，并简称为L-焦谷氨酸α。
上述正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的同分异构体为正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷。
正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷为白色粉末。ESI-MS+在m/z348处可见[M+H]+离子峰，表明该化合物分子量应为347，确定分子式为C15H25NO8，计算其不饱和度为4。酸水解给出D–果糖，提示该化合物中含有果糖。
1H-NMR中可观察到δ4.28(2H,o，H-6)，δ4.12(1H,d,8.0，H-3)，δ3.99(1H,d,8.0，H-4)，δ3.91(1H,m，H-5)归属于果糖的氢质子信号；δ3.61(1H,m，-OCH2-a),δ3.45(1H,m，-OCH2-b)，δ1.53(2H,m,-CH2)，δ1.37(2H,m,-CH2)，δ0.91(3H,t,7.2,-CH3)归属于正丁醇基的氢质子信号；还可观察到δ4.30(1H,m,-CH-5)，δ2.49(1H,m,-CH2-a-3)，δ2.34(2H,m,-CH2-4)，δ2.21(1H,m,-CH2-b-3)归属于焦谷氨酸的氢质子信号。
在谱中13C-NMR中，15个碳信号中，有4个归属于正丁基的碳信号和5个碳信号δ181.2，173.8，57.0，30.2，25.9归属于L-焦谷氨酸，剩余为果糖的碳信号，经比对发现是β-D-呋喃果糖，并且除2位碳向低场位移，6位羟甲基碳也向低场位移了2.5ppm。
HMBC谱中观察到谷氨酸上的次甲基质子信号δ4.30(1H,m,-CH-5)除了与游离羧基碳信号(δ181.2)相关外，还与羰基碳信号(δ173.4)相关，进一步确证形成了L-焦谷氨酸；观察到归属于正丁醇基羟甲基的一个氢质子信号δ3.61(1H,m，-OCH2-a)与果糖C-2碳信号(δ105.6)相关，表明正丁基连结在果糖的2位；观察到果糖上的6位羟甲基的两个氢质子信号δ4.28(2H,o，H-6)与焦谷氨酸的内酯酰胺羰基碳信号(δ173.8)相关，表明L-焦谷氨酸通过氮原子与果糖的1位羟甲基成苷。
结合DEPT、HSQC谱将1H-NMR和13C-NMR数据进行归属，该化合物的结构鉴定为：正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷，并简称为L-焦谷氨酸β。
本发明将L-焦谷氨酸α和L-焦谷氨酸β统称为L-焦谷氨酸。
本发明的有益效果为：与空白组相比，东莨菪碱诱导的小鼠出现学***台次数及靶象限停留时间(P<0.01)，降低P-P38/P38、APP、BACE1的表达(P<0.01)，L-焦谷氨酸α给药组海马区神经元排列较为紧密，数量较多，形态正常，囊泡数量明显增多，细胞双层核膜清晰，核仁明显，线粒体发达。故L-焦谷氨酸α对东莨菪碱记忆障碍模型小鼠是通过ER-P38/MAPK信号通路调节Aβ代谢系统达到神经保护作用。
另外本发明中的L-焦谷氨酸α的空间构型导致其可与毒蕈碱型受体M3结合，L-焦谷氨酸α与毒蕈碱型受体M3结合后，使阿尔茨海默病患者大脑中的Ach保留下来，从而相对地提高了Ach含量。而L-焦谷氨酸β则无法与毒蕈碱型受体M3结合，这也说明了L-焦谷氨酸α具有更加优异的抗AD作用，即本发明通过分子生物学来验证L-焦谷氨酸α是否通过ER-P38/MAPK信号，调节Aβ代谢，对海马神经元产生保护作用，提供了L-焦谷氨酸α抗AD的有效性依据，从而为开发抗AD药的研究提供新思路。
附图说明
图1为本发明中正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的结构式图；
图2为本发明中正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷的结构式图；
图3为本发明的细胞增值率图；
图4为本发明中L-焦谷氨酸对小鼠海马ERβ、P-P38/P38、APP、BACE1表达的影响图；
图5为本发明的L-焦谷氨酸α与M3受体分子对接三维图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图以及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的新应用，具体包括以下内容。
如图1所示，图1为正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的结构式，其中，正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷的果糖的C1和C4上的大基团位于两侧，即该糖苷键为α型，即将正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-α-D-呋喃果糖苷简称为L-焦谷氨酸α。
如图2所示，图2为正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷的结构式，其中，正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷的果糖的C1和C4上的大基团位于同侧，即该糖苷键为β型，即将正丁醇基-2-O-(L-焦谷氨酸-N-6-)-β-D-呋喃果糖苷简称为L-焦谷氨酸β。
本实施例中的L-焦谷氨酸α和L-焦谷氨酸β统称为L-焦谷氨酸。
一、如图3所示，L-焦谷氨酸对Aβ诱的PC12细胞损伤有良好的保护作用，L-焦谷氨酸明显提高损伤PC12细胞增殖，提高神经元存活率。其中，模型组为Aβ25-35损伤模型，阳性药物组为多奈哌齐。
二、L-焦谷氨酸对东莨菪碱记忆损伤模型小鼠的学习记忆、认知能力的改善作用。
分组及给药，75只小鼠随机分为5组，空白组(Control)、模型组(Scopolamine)、阳性药组(Donepezil)、L-焦谷氨酸α组、L-焦谷氨酸β组。Control组及Scopolamine组灌胃给予蒸馏水；Donepezil组、Scopolamine组灌胃分别给予多奈哌齐(585mg/kg·d)及L-焦谷氨酸(100mg/kg·d)，15min后给予L-焦谷氨酸(100mg/kg·d)。造模第22天除空白组腹腔注射生理盐水外，其余组腹腔注射等量的东莨菪碱(100mg/kg·d)，连续7日，第29日开始行为学实验，行为学试验在每日给药后30min进行。
行为学检测采用新物体识别实验(ORT)、Morris水迷宫实验(MWM)观察小鼠认知能力。识别指数＝(Tn-Tf)/(Tn+Tf)。对新物体的接触时间为(Time new)和对旧物体的接触时间(Time familiar)；Morris水迷宫实验包括定位航行实验及空间探索实验。记录动物的逃避潜伏期、穿过平台的次数。
病理学方法检测海马及下丘脑形态。HE染色：取出的海马及下丘脑用40％多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，切片。光镜下观察小鼠海马及下丘脑病理学变化。透射电镜固定，脱水、浸透、包埋及切片后，电镜下观察小鼠海马超微结构变化并拍摄。按试剂说明书方法，滴加适当比例稀释的一抗，二抗，观察ER表达。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算。
小鼠海马中相关蛋白表达行为学测试后，给予小鼠1％戊巴比妥钠(0.1mL/10g)腹腔注射麻醉，每组小鼠麻醉后快速断头，取出鼠脑组织中海马及下丘脑，整个操作过程于冰上进行，液氮速冻后蛋白提取，蛋白浓度测定按照BCA试剂盒说明书操作，计算各组样品的蛋白浓度，进行Western blot检测蛋白表达水平。
统计学分析数据用SPSS21.0统计学软件分析，组间比较利用单因素方差分析(one-way ANOVA)，实验数据均用平均数±标准差(x±SD)表示，P<0.05表示有统计学意义。
结果
新物体识别实验测试结果实验结果见表1，与空白组相比，Scopolamine组小鼠新物体识别指数显著减小(P<0.01)；与Scopolamine组相比，Donepezil和L-焦谷氨酸α组小鼠新物体识别指数显著增加(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠新物体识别指数显著减少(P<0.01)。
表1 L-焦谷氨酸对小鼠新物体识别指数的影响(
注：与Control组相比，**表示P<0.01；与Scopolamine组相比，##表示P<0.01；与L-焦谷氨酸α组相比，&&表示P<0.01。
Morris水迷宫实验测试结果：定位航行实验：结果见表2，与空白组相比，Scopolamine组小鼠潜伏期显著增加(P<0.01)，与Scopolamine模型组相比，Donepezil组和L-焦谷氨酸α组小鼠潜伏期显著减少(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠潜伏期显著减少(P<0.01)。同时记录5组小鼠在前4d训练中寻找平台潜伏期时长，可以看出5组的潜伏期均逐渐降低，但Control组、L-焦谷氨酸α组小鼠潜伏期下降较快，Scopolamine组和L-焦谷氨酸β组潜伏期缩短幅度较小，进步缓慢，表明其学习能力较差。
表2 L-焦谷氨酸对小鼠定位航行潜伏期的影响(
注：与Control组相比，**表示P<0.01；与Scopolamine组相比，##表示P<0.01；与L-焦谷氨酸α组相比，&&表示P<0.01。
由表3可见，与Control相比，Scopolamine组小鼠平台穿越次数和目标象限停留时间显著减少(P<0.01)；与Scopolamine组相比，Donepezil组和L-焦谷氨酸α组小鼠平台穿越次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠平台穿越次数和靶象限停留时间显著降低(P<0.01)，靶象限停留时间降低(P<0.05)。
表3 L-焦谷氨酸对小鼠空间探索试验穿台次数和靶象限停留时间的影响(
注：与Control组相比，**表示P<0.01；与Scopolamine组相比，##表示P<0.01；与L-焦谷氨酸α组相比，&&表示P<0.01。
三、L-焦谷氨酸对东莨菪碱模型小鼠海马及下丘脑组织病理改变的影响
Control组小鼠的海马神经细胞排列整齐，数量较多，染色均一。东莨菪碱损伤了小鼠海马，表现为紊乱排列和缩小的神经元细胞，由于核固缩现象明显，见不到明显的核仁；无论Donepezil还是L-焦谷氨酸α给药组都在一定程度上恢复了海马区神经元的数量，形态正常，排列规整，核仁清晰。下丘脑的HE染色也显示出类似的特征，东莨菪碱损伤了小鼠下丘脑，神经细胞排列松散，细胞间隙变大，细胞核染色浅，细胞核体积增大，核仁不明显，出现部分细胞结构消失，Donepezil和L-焦谷氨酸α给药组神经细胞排列较为紧密，细胞间隙变大，细胞核染色较深，核仁较清晰，部分细胞结构退化。
由表4可见，与Control组相比，Scopolamine组小鼠ERβ表达均显著减少(P<0.01)；与Scopolamine组相比，L-焦谷氨酸α组小鼠ERβ表达均明显增加(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠ERβ表达均显著减少(P<0.01)。与Control组相比，Scopolamine组小鼠小鼠下丘脑区内ERα表达情况均显著减少(P<0.01)；与Scopolamine组相比，给药组小鼠ERα表达均明显增加(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠ERα表达均显著减少(P<0.01)。
表4 L-焦谷氨酸对小鼠海马P-P38/P38表达的影响(
注：与Control相比，**P<0.01；与Scopolamine组相比，##P<0.01；与L-焦谷氨酸α组相比，&&P<0.01。
如图4、表5所示，海马中APP和BACE1蛋白的含量变化，与Control组相比，Scopolamine组APP，BACE1表达显著增加(P<0.01)，与Scopolamine组相比，给药组APP，BACE1表达显著减少(P<0.01)；与L-焦谷氨酸α组相比，L-焦谷氨酸β组小鼠海马中APP、BACE1表达显著增加(P<0.01)。
图4中，A-Control组；B-Scopolamine组；C-Donepezil组；D-L-焦谷氨酸α组；D-L-焦谷氨酸β组。
表5 NG对SN小鼠海马中APP、BACE1表达的影响(
注：与空白组相比，**表示P<0.01；与SN组相比，##表示P<0.01；与NG组相比，&&表示P<0.01。
AD主要病理特征为Aβ的异常沉积形成老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。BACE1(β-分泌酶)是APP生成Aβ所需的限速酶。Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结与AD患者的痴呆程度密切相关，Cdk5是细胞周期蛋白依赖性激酶的一种，与AD患者早期生成神经纤维缠结有关。本实验结果表明L-焦谷氨酸可降低APP、BACE1的表达，减少神经纤维缠结的形成，发挥对Aβ损伤的PC12细胞和东莨菪碱模型小鼠的神经保护作用。
研究发现胆碱能系统与学习记忆相关，而AD患者脑中有不同程度的Ach合成减少且Ach是胆碱能系统重要的神经递质之一，Ach合成减少导致神经元的损伤及缺失，还会引起突触信号传导障碍。本实验结果表明L-焦谷氨酸可抑制AchE活性、提高ChAT及Ach含量从而发挥对东莨菪碱模型小鼠的学习记忆保护作用。
如图5所示，L-焦谷氨酸α的空间构型导致其可与毒蕈碱型受体M3结合，L-焦谷氨酸α与毒蕈碱型受体M3结合后，使阿尔茨海默病患者大脑中的Ach保留下来，从而相对地提高了Ach含量。而L-焦谷氨酸β则无法与毒蕈碱型受体M3结合，这也说明了L-焦谷氨酸α具有更加优异的抗AD作用。
神经元凋亡是中枢神经系统中发挥重要的生理功能。Aβ异常沉积可以从多种途径诱导神经元凋亡，启动神经元细胞中多种蛋白参与凋亡信号的级联反应，诱导氧化应激和炎症反应，最终造成神经元凋亡及丢失，导致AD的发生。研究发现，Bad、Bcl-2及Caspase-3属于凋亡相关蛋白，正常情况下，抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白处于相对平衡的状态，当Bcl-2过多抑制神经元凋亡，而Bad和Caspase-3过多促进神经元凋亡。本实验结果表明L-焦谷氨酸能够降低凋亡因子Bad和Caspase-3的表达，增加抗凋亡因子Bcl-2的表达，减少神经元的凋亡，发挥对东莨菪碱模型小鼠神经保护作用。
本实施例的L-焦谷氨酸α能够明显改善记忆损伤模型小鼠的学习记忆功能。通过MAPK信号改善Aβ代谢系统，发挥对记忆损伤模型小鼠的神经保护作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。