利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用
阅读说明：本技术 利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用 (Application of ribavirin in preparation of medicine for inhibiting bacterial quorum sensing ) 是由 赵克雷 褚以文 王欣荣 林家富 刘超兰 宋涛 黄挺 张新宜 翟龙飞 于 2021-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用。可高效抑制革兰氏阴性病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统。解决传统抗生素治疗多重耐药病原菌相关感染有效药物选择少、周期长、病情易反复的问题。本发明包括如下特点：可同时抑制铜绿假单胞菌群体感应系统三个主控基因lasR、rhlR、pqsR及其下游功能基因的表达,可显著抑制铜绿假单胞菌群体感应系统控制的细菌毒力因子的合成,减轻感染症状。本发明可用于以铜绿假单胞菌为代表的多重耐药革兰氏阴性菌感染这类需要长期治疗的疾病,不容易产生耐药。(The invention discloses an application of ribavirin in preparation of a medicament for inhibiting bacterial quorum sensing. Can effectively inhibit gram-negative pathogenic bacteria pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ) A quorum sensing system. Solves the problems of few effective drug choices, long period and easy relapse of the traditional antibiotic treatment for the infection related to multi-drug resistant pathogenic bacteria. The invention comprises the following characteristics: three main control genes capable of simultaneously inhibiting pseudomonas aeruginosa quorum sensing system lasR 、 rhlR 、 pqsR And the expression of downstream functional genes thereof can obviously inhibit the synthesis of bacterial virulence factors controlled by a pseudomonas aeruginosa quorum sensing system and relieve infection symptoms. The invention can be used for treating diseases needing long-term treatment, such as multiple drug-resistant gram-negative bacteria infection represented by pseudomonas aeruginosa, and the drug resistance is not easy to generate.)
技术领域
本发明涉及一种高效群体感应小分子抑制剂及其应用。具体而言，涉及一种广谱抗病毒药物利巴韦林（Ribavirin）可通过高效抑制群体感应系统进而实现抑制多重耐药革兰氏阴性菌毒性发挥的新应用。本发明的化合物可用于以铜绿假单胞菌为代表的多重耐药革兰氏阴性菌感染这类需要长期治疗的疾病，不容易产生耐药。
背景技术
利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷，化学名称1-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，分子式为C8H12N4O，为广谱抗病毒药，可抑制HCV，HIVl，RSV等非逆转录病毒，其化学结构与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等革兰氏阴性菌的群体感应信号分子高丝氨酸内酯母核结构具有一定的相似。
利巴韦林的结构式如图1。
细菌群体感应是用来描述细菌生长到一定种群密度之后，个体细菌可以连贯接收单位环境内其他个体分泌至胞外的高丝氨酸内酯信号分子，激活细菌胞内复杂调控网络进而大范围调控毒力因子（如胞外蛋白酶、毒素物质等）释放和代谢通路，从而显著提高细菌种群生存适合度。鉴于细菌群体感应系统介导的毒力系统在感染性疾病中的关键作用，通过抑制细菌群体感应系统实现细菌毒性的降低进而被宿主免疫系统清除是一种抗生素替代药物开发策略。该策略与传统的抗生素作用机制不同，不会直接抑制细菌的生长繁殖，而是抑制细菌毒性的发挥并降低细菌毒素对宿主组织器官的破坏。基于细菌群体感应系统信号分子开发的靶向小分子化合物直接作用于群体感应中控蛋白，如果中控蛋白通过突变影响靶向小分子的药效，即产生耐药性，那么其自身蛋白构象的变化也会影响其对天然信号分子的绑定，从而主动抑制群体感应系统。因此，无论细菌是否通过突变产生耐药性，靶向小分子化合物应用结果都将是细菌群体感应系统被抑制，是一种进化稳定且不易产生耐药性的抗毒力策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种利巴韦林用于制备抑制多重耐药革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌群体感应的药物中的应用。
本发明是这样实现的：
利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用
利巴韦林作用浓度为50-200微摩尔/L。
利巴韦林以药学上可接受的制剂形式呈现，制剂的形式包含片剂，颗粒剂，胶囊，注射剂，喷雾剂或其它能够被人体吸收的形式。
所述的细菌为革兰氏阴性菌。
所述的细菌为铜绿假单胞菌。
利巴韦林与革兰氏阴性菌群体感应常见信号分子具有类似的呋喃结构母核，可靶向结合群体感应系统多个中控蛋白，抑制胞外蛋白酶的产生，并且显著抑制群体感应系统多个中控基因及其下游功能基因的表达。
所述的细菌为以铜绿假单胞菌模式菌株PAO1为代表的革兰氏阴性菌。
本发明所述利巴韦林包括如下特点：可同时作用于群体感应系统多个中控蛋白，在较低的使用剂量下有效，可高效抑制群体感应系统。本发明的利巴韦林能够用于以铜绿假单胞菌为代表的多重耐药革兰氏阴性菌感染这类需要长期治疗的疾病，不容易产生耐药性。
利巴韦林可同时抑制细菌群体感应系统多个中控基因及其下游功能基因的表达，并且抑制细菌胞外蛋白酶的产生。
利巴韦林这些作用采用铜绿假单胞菌模式菌株PAO1进行体外的评价，结果见实施例。
在体外，小分子化合物利巴韦林对富营养条件（如LB培养基）下培养的铜绿假单胞菌不具备抑菌活性，但可显著抑制铜绿假单胞菌在需要激活群体感应系统才能生长的环境（如M9-adenosine培养基）中的增殖。利巴韦林可显著抑制铜绿假单胞菌群体感应系统中控基因lasR的功能、胞外蛋白酶的合成，同时抑制目前已知的铜绿假单胞菌群体感应系统三个中控基因及其下游关键毒力相关功能基因的表达，并且可以有效保护线虫免受铜绿假单胞菌侵染。
本发明利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用包括如下优点：与传统抗生素作用机制完全不同，可避开多重抗生素耐药性直接作用于群体感应系统多个中控蛋白，进而高效抑制群体感应系统介导的毒性发挥。本发明的利巴韦林能够用于以铜绿假单胞菌为代表的多重耐药革兰氏阴性菌感染这类需要长期治疗的疾病，不容易产生耐药。
附图说明
图1为利巴韦林的结构式。
图2为利巴韦林对铜绿假单胞菌的生长影响。A: LB培养基；B: M9-adenosine培养基。
图3为利巴韦林对铜绿假单胞菌群体感应调控基因表达影响。
图4为利巴韦林对铜绿假单胞菌感染线虫的保护作用。Control，大肠杆菌OP50感染组。PAO1, 铜绿假单胞菌感染组。Ribavirin，利巴韦林干预下的铜绿假单胞菌感染组。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明涵盖了权利要求书范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例1
利巴韦林制剂抑制铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa PAO1) 群体感应。
利巴韦林制剂为颗粒剂溶于无菌去离子水。
利巴韦林抑菌活性分析：
将铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa PAO1) （1.0×106 CFU）分别接种于普通LB肉汤培养基（海博生物技术有限公司）和M9-adenosine（0.1%, w/v）培养基（Sigma-Aldrich），处理组于各培养基中分别加入50、100、200微摩尔/L利巴韦林制剂，对照组加入等量的无菌去离子水，37 ℃培养16小时后于光密度OD600下测定菌液密度。
利巴韦林抑菌活性分析结果如图2。在肉汤LB培养基中，各浓度利巴韦林处理铜绿假单胞菌后菌液密度与对照组相比并无显著变化（图2A）。而在M9-adenosine培养基中，与对照组相比，利巴韦林可以显著抑制铜绿假单胞菌的增殖（图2A）。鉴于铜绿假单胞菌对于adenosine的代谢需要利用群体感应中控基因lasR调控的胞内水解酶Nuh，利巴韦林存在的情况下铜绿假单胞菌在adenosine为唯一碳源的条件下生长减弱表明其群体感应系统受到了抑制进而影响了增殖。
利巴韦林抑制群体感应活性分析：
将5微升铜绿假单胞菌（5.0×106 CFU）分别接种于含不同浓度梯度利巴韦林（0、50、100、200微摩尔/L）的M9-skim milk（0.5%, w/v）（Sigma-Aldrich）和M9-adenosine（0.1%, w/v）琼脂培养板（Sigma-Aldrich），37 ℃培养20小时后测量M9-skim milk培养板上蛋白水解圈的直径，检测铜绿假单胞菌在M9-adenosine培养板的生长情况。
利巴韦林抑制群体感应活性分析如表1。在M9-skim milk培养板上，利巴韦林可以显著抑制铜绿假单胞菌菌落的胞外蛋白酶产量，并且抑制了铜绿假单胞菌在M9-adenosine培养板上的生长。鉴于铜绿假单胞菌对于skim milk的代谢需要利用群体感应调控的胞外蛋白酶，而对adenosine的代谢需要利用群体感应中控基因lasR调控的胞内水解酶Nuh，利巴韦林存在的情况下铜绿假单胞菌在skim milk为唯一碳源的条件下蛋白水解圈减小，在adenosine为唯一碳源的条件下生长减弱共同表明其群体感应系统受到了抑制。
Ribavirin (微摩尔/L)
M9-skim milk (cm)
M9-adenosine<sup>1</sup>
0
1.72 ± 0.148
+
50
1.43 ± 0.05****
-
100
1.38 ± 0.076****
-
200
1.18 ± 0.083****
-
表1 利巴韦林对铜绿假单胞菌群体感应系统的影响
1：‘+’代表正常生长；‘-’代表未生长或生长较弱
利巴韦林对群体感应调控基因表达影响分析：
将铜绿假单胞菌（1.0×106 CFU）接种于M9-skim milk（0.5%, w/v）液体培养基，处理组加入200微摩尔/L利巴韦林制剂，对照组加入等量的无菌去离子水，37 ℃培养16小时后收集菌体并提取总RNA，利用Real-time PCR检测铜绿假单胞菌三个群体感应中控基因lasR, rhlR, pqsR及其下游功能基因lasB, rhlA, pqsA, pqsD, phzA, hcnA的表达量，以16S rRNA作为内参基因。
利巴韦林对群体感应调控基因表达影响分析结果如图3。在M9-skim milk培养液培养后，利巴韦林可以同时显著抑制铜绿假单胞菌三个群体感应中控基因lasR, rhlR,pqsR，并且其下游功能基因lasB, rhlA, pqsA, pqsD, phzA, hcnA的表达同样受到了显著抑制。这些结果综合表明广谱抗病毒药物利巴韦林可以高效抑制铜绿假单胞菌群体感应系统。
实施例2
对铜绿假单胞菌感染线虫的保护作用。
利巴韦林，制剂为片剂，片剂磨成干粉溶于无菌去离子水，离心取上清作为供试液。
利巴韦林对铜绿假单胞菌感染线虫的保护作用分析：
将50微升铜绿假单胞菌（5.0×107 CFU）接种于PGS（peptone-glucose-sorbitol）培养板（Sigma-Aldrich），处理组于相应培养板中加入200微摩尔/L利巴韦林供试液，对照组加入等量的无菌去离子水，37 ℃培养24小时后置于室温冷却，然后每板接种10只新培养的线虫成虫（L4期），继续于25 ℃培养并观察线虫的存活情况。阴性对照组初始接种菌为大肠杆菌OP50，其它培养条件均于铜绿假单胞菌感染组一致。
利巴韦林对铜绿假单胞菌感染线虫的保护作用分析结果如图4所示。对照组中铜绿假单胞菌对线虫的致死作用随感染时间的延长逐渐增强，而在利巴韦林处理组中，线虫的生存情况得到明显改善，且与未处理组存在极为显著的统计学差异（P < 0.0001），表明利巴韦林可以较好的保护线虫免受铜绿假单胞菌侵染。
利巴韦林在制备抑制细菌群体感应的药物中的应用
实施例中涉及的LB肉汤和琼脂培养基均购买于海博生物技术有限公司。M9-adenosine和M9-skim milk培养基的主成份adenosine和skim milk以及PGS（peptone-glucose-sorbitol）培养基主成份PGS均购买于Sigma-Aldrich公司。
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