阅读说明：本技术 一种caii的突变体及其应用 (CAII mutant and application thereof ) 是由 杨艳 于 2020-04-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CAII的突变体及其应用,本发明通过对CAII缺陷综合征的患者进行外显子测序,发现在368位的核苷酸处存在一个突变,该突变的发现为CAII缺陷综合征的诊断以及CAII相关的疾病的诊断和药物的开发提供了新手段。(The invention discloses a CAII mutant and application thereof, and the invention discovers that a mutation exists at a 368 bit nucleotide position by sequencing exons of patients with CAII deficiency syndrome, and the discovery of the mutation provides a new means for diagnosing the CAII deficiency syndrome and CAII related diseases and developing medicaments.)

一种CAII的突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种CAII的突变体及其应用。

背景技术

碳酸酐酶(CA)是一类催化二氧化碳和水生成碳酸氢根和氢离子的可逆反应的锌酶。它广泛存在于动植物及微生物体中且在生物加工过程中起重要作用。由于碳酸酐酶的特性，它正被广泛应用于诸如生物检测、天然活性物质的筛选、生物传感器、CO₂捕集和生理诊断等领域。碳酸酐酶在各器官中有不同的功能：位于肺部红细胞内的HCO₃ ^-与H⁺结合生成H₂CO₃，碳酸酐酶I、碳酸酐酶II加快H₂CO₃分解成CO₂和H₂O的速率，CO₂通过扩散的方式进入血浆，为了补充消耗的HCO₃ ^-，血浆中的HCO₃ ^-进入红细胞。大量的CA存在于胃的壁细胞，它们可以介导合成和分解盐酸。近来研究发现，乳头肌收缩机械力下降与酶抑制剂密切相关，严重的话还会使得细胞内发生酸中毒。对碳酸酐酶结构和功能的深入理解使得研究者发现了其除催化CO₂的可逆水合反应的，其他功能：参与酯的水解反应、催化乙醛与其他醛的水合等。

CAII缺陷综合征是因为CAII基因发生突变，导致编码的CAII活性降低或者编码不完整的、失活的CAII引起的，其属于属于常染色体隐性遗传。患者常表现骨硬化(Osteopetrosis)、肾小管酸中毒(Renal Tubular Acidosis，RTA)和脑钙化(CerebralCalcification)。编码CAII的基因位于8号染色体，全长约20kb，7个外显子，CAII蛋白全长260个氨基酸。CAII是人体CA活性最高的一个，在多个器官、组织均有表达，也是人体内CA中研究最多的一个。

基因外显子区域突变与疾病的发生发展密切相关，其中，错义突变可直接引起氨基酸序列的改变，从而影响蛋白的结构及功能。而有越来越多的研究报道，不改变氨基酸序列的同义突变亦可成为疾病致病的危险因素，突变导致前体mRNA剪接异常是其主要的致病机制，据估计有90％的疾病相关同义突变可能影响剪接功能。同义突变的致病研究提示，错义或无义突变的致病机理不局限于蛋白水平单个氨基酸的变化，可能与前体mRNA剪接异常相关。基因外显子区域含有许多剪接增强子(exonic splicing enhancers，ESEs)及剪接沉默子(exonicsplicing silencers，ESSs)，可以增强或削弱前体mRNA的剪接功能。剪接增强子主要存在于外显子区域，因此发生编码区的突变一方面影响所编码的蛋白质如无义突变或错义突变，另一方面可能通过改变剪接调控序列而影响RNA剪接，产生更严重的后果。通过外显子测序发现与CAII功能相关的突变，对于研究CAII缺陷综合征或者与CAII相关的疾病具有重要的意义。

本发明基于临床研究，收集CAII缺陷综合征患者的样本进行外显子测序，发现CAII的4号外显子存在突变c.G368A(p.W123X)，并通过进一步实验证明，该突变与蛋白的功能相关，为疾病致病机制以及临床应用的研究提供分子基础。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于，提供一种CAII的新突变及其应用。

本发明的第一方面提供了一种突变的CAII蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具有p.W123X突变。

本发明的第二方面提供了本发明的第一方面述突变的CAII蛋白的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有c.G368A突变。

本发明的第三方面提供了一种重组载体，其包含本发明第二方面所述的核苷酸。

本发明的第四方面提供了一种重组细胞或微生物，其导入本发明的第二方面所述的核苷酸或本发明的第三方面所述的重组载体。

本发明的第五方面提供了用于检测CAII基因突变的引物或探针，所述突变为c.G368A突变。

进一步，所述引物对可以特异性扩增出含第368位突变的A的核酸扩增产物。

进一步，所述的探针可以特异性的结合于第368位突变的A的核酸片段。

本发明的第六方面提供了用于检测CAII蛋白突变的试剂，所述突变为p.W123X突变。

进一步，所述的试剂可以特异性结合于含第123位突变的蛋白。

本发明的第七方面提供了一种用于检测CAII基因或蛋白突变的产品，所述产品包括本发明的第五方面所述的引物或探针，或本发明第六方面所述的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或制剂。

本发明的第八方面提供了一种检测CAII基因突变的装置，包括PCR混合液制备单元，PCR反应单元和信息处理单元，所述PCR混合液制备单元配置用于将待测DNA模板，针对目标区域的上、下游PCR扩增引物以及PCR预混液混合制备得到PCR混合液。

本发明的第九方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明的第一方面所述的蛋白/本发明的第二方面所述的核苷酸/本发明的第三方面所述的重组载体/本发明的第四方面所述的重组细胞或微生物/本发明的第五方面所述的探针或引物/本发明的第六方面的试剂在/本发明的第七方面所述的产品/本发明的第八方面所述的装置制备诊断CAII缺陷综合征的工具中的应用；

2)本发明的第一方面所述的蛋白/本发明的第二方面所述的核苷酸/本发明的第三方面所述的重组载体/本发明的第四方面所述的重组细胞或微生物/本发明的第五方面所述的探针或引物/本发明的第六方面的试剂在/本发明的第七方面所述的产品/本发明的第八方面所述的装置在制备诊断CAII相关疾病的工具中的应用。

发明详述

在本发明中，“样本”是指出于体外评估目的自个体获得的生物学样本，本发明中样本或患者样本可以包括任何体液。优选的样本是血液，诸如血清、血浆或全血。

在本发明中，术语“载体””是指含有与能够在合适宿主中表达DNA的控制序列可操作地连接的DNA序列的DNA产物。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入物。一旦用载体转化合适的宿主，它可以独立于宿主的基因组复制和起作用，或者可以与基因组本身整合。由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”有时在本发明的说明书中可互换使用。然而，本发明包括具有与本领域已知或应当已知的载体相同的功能的其他形式的载体。用于哺乳动物细胞培养表达的典型表达载体包括例如pRK5、pSV16B和pVL1392。

可以将多种表达控制序列中的任何一种用于载体以表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd code蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母α-交配系统的启动子和已知具有控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的结构和诱导的其他序列以及它们的各种组合。T7RNA聚合酶启动子Φ10可用于在大肠杆菌中表达蛋白。

如本领域众所周知的，为了增加宿主细胞中转基因的表达水平，该基因应该与在选定的表达宿主中起作用的转录/翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应的基因包含在一个含有细菌选择标记和复制起始点的重组载体中。当表达宿主为真核细胞时，重组载体应进一步包括可用于真核表达宿主中的表达标记。

多种表达宿主/载体组合可用于表达本发明主题蛋白的DNA序列。用于真核宿主的合适表达载体包括，例如，衍生自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列。可用于细菌宿主的表达载体包括细菌质粒，可例举为从大肠杆菌获得的那些，例如pBlueScript、pGEX2T、pUC载体、colE1、pCR1、pBR322、pMB9及它们的衍生物；具有宽宿主范围的质粒，例如RP4；噬菌体DNA，其可以例举为多种噬菌体λ衍生物，例如λgt10、λgt11和NM989，以及其他DNA噬菌体，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。用于昆虫细胞的载体为pVL941。

用上述重组载体转染或转化的宿主细胞构成了本发明的另一个方面。如本文所用，术语“转染”是指将DNA导入宿主并使DNA可通过染色体外因子或染色体整合而复制。如本文所用，术语“转化”是指表达载体被宿主细胞容纳，而无论是否实际表达任何编码序列。

本发明的宿主细胞可以是原核或真核细胞。此外，通常使用具有高DNA导入效率和高地导入DNA表达效率的宿主。可以使用的宿主细胞的实例包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、真菌和酵母；昆虫细胞，例如草地夜蛾(SF9)；动物细胞，例如CHO和小鼠细胞；非洲绿猴细胞，例如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10；以及组织培养的人细胞。当克隆编码本发明蛋白的cDNA时，优选使用细菌细胞作为宿主。在本发明中，以大肠杆菌为示例，但本发明不限于此。

应当理解，并非所有载体在表达本发明的DNA序列时都发挥相同的功能。同样，对于同一表达系统，并非所有宿主都发挥相同的功能。然而，在无需过度实验且不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员将能够从各种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择。例如，载体的选择应当考虑宿主，因为载体应该在其中复制。还应考虑载体的复制次数、控制复制次数的能力以由相应载体编码的其他蛋白的表达，例如抗生素标记的表达。在选择表达控制序列时，应考虑许多因素。例如，应该考虑序列的相对强度、可控性以及与本发明的DNA序列的相容性，特别是对于可能的二级结构。可以考虑诸如所选载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因子以及纯化本发明的DNA序列编码的产物的容易性等因素来选择单细胞宿主。在这些因素的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型培养中表达本发明的DNA序列的各种载体/表达控制序列/宿主组合。作为通过表达克隆来克隆蛋白的cDNA的筛选方法，可以采用结合法、膜乳液法等。

在本发明中，术语“外显子”一词是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。

术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸

术语“芯片”、“阵列”、“生物芯片”可互换使用，而且指在共同基片上排列的多种探针、标志物的集合，该基片可以是硅片、尼龙带、塑料带、或玻璃载片。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”指有意创建的物质(诸如分子、标志物、开口、微线圈、检测仪和/或传感器)集合，其附着至基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)或在基片或固体表面(诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料)上装配。阵列可用于同时测量大量(例如数十、数千或数百万)反应或组合的水平。阵列也可含有少量物质，例如一个、少数或一打。阵列中的物质可以彼此相同或不同。阵列可以采取多种形式，例如可溶性分子的文库、固定化分子的文库、固定化抗体的文库、拴系至树脂珠、硅片、或其它固体支持物的化合物的文库。阵列可以是宏阵列或微阵列，取决于阵列上的垫的大小。宏阵列一般含有约300微米或更大的垫大小，而且能容易地通过凝胶和印迹扫描仪来成像。微阵列一般会含有小于300微米的垫大小。

“固体支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以对其附着或共价结合(常常经由接头)文库成员或试剂，从而固定化或容许它们易于与过量的试剂、可溶性反应副产物、或溶剂分开(通过过滤、离心、清洗等)。

本发明中，试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。

DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤：

1.提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；

2.在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。

3.对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。

在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。

术语“外显子捕获”，“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。

DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法对基因进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。

有益效果：

本发明首次发现了CAII的致病突变，可以用于疾病的诊断，为开发疾病的治疗药物提供科学依据。

同时本发明提供了CAII缺陷综合征或者与CAII相关的疾病诊断产品和手段，有利于疾病的发现。

附图说明

图1是患者的家系图谱；

图2是sanger测序图；

图3是免疫荧光检测图；

图4是Western Blot检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1测序分析

1、患者信息及样本采集

该患者固性低血钾(最低时1点几)伴代谢性酸中毒，指甲生长慢(薄且少)，智力评分低，慢性鼻炎，幼儿时发烧曾使用干扰素治疗。无家庭史，父母属近亲结婚，有病历。诊断：肾小管酸中毒。家系图谱如图1所示。

采集患者及其父母的全血2ml(EDTA抗凝血)进行基因分析，患者签署知情同意书，并获得伦理委员会的同意。

2、外显子测序

(1)基因组DNA的提取

取患者新鲜全血，使用BloodGen Midi Kit(CWBIO,China)提取患者全基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。

(2)文库制备

a.基因组片段化：Cavoris仪打断至200bp左右。

b.末端补平修复：片段化DNA在Klenow Fragment,T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下进行末端补平修复。

c.3’端腺苷化：在聚合酶体系下，使上一步得到的修复产物在3’末端加上A碱基，为下一步连接做好准备。

d.加接头：配置T4DNA连接酶反应体系，在Thermo mixer中适温反应一定时间使adapter和加“A”产物连接。

e.扩增：连接产物经4-6轮LM-PCR扩增。

f.杂交：文库与探针混于杂交体系中65℃，60-68h杂交。

g.洗涤磁珠和洗脱DNA：使用链霉素磁珠，与杂交样本孵育后洗脱液洗脱。

h.洗脱产物扩增：洗脱产物经10轮LM-PCR扩增。

(3)测序

a.测序，Illumina hiseq2500平台标准化上机测序操作流程。

b.测序得到图像原始数据，Illumina官方basecall分析软件BclToFastq得到原始数据(raw data)。

(4)数据分析

a.原始数据产量统计：去接头污染，去低质量的数据。

b.比对：数据与参考序列比对统计(比对软件BWA)，参考基因组：hg19基因组。

c.SNP检测及注释：分析软件samtools。

d.Indel检测及注释：分析软件pindel。

e.突变假阳性过滤：根据测序深度，突变质量，对检测得到的SNP，Indel进行过滤筛选，得到高质量可靠的突变。

f.突变注释：SNP和Indel根据在基因上的位置，分析得到氨基酸变化影响，剪切影响，UTR，内含子突变影响等。

g.筛选出的变异对蛋白功能影响的预测：使用SIFT利用基于同源比对，蛋白结构的保守性等的算法，预测筛选出的变异对蛋白质的影响。

h.对剪切位点附近的突变，做剪切危害性预测。

(5)结果

外显子测序结果显示，该患者在CAII基因的4号外显子上存在一个截断突变，该突变位于核苷酸的第368位，由G突变为A(c.G368A)，氨基酸为p.W123X。

3、Sanger测序验证

针对CAII基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s,60℃退火30s,72℃链延伸30s，扩增30个循环；最后72℃补充延伸10min。PCR的体系均为50μL。

Sanger测序结果如图2所示，从图中可以看出，患者的父母都为杂合携带者，该患者为纯合子，符合常染色体隐性遗传的发病机制。

实施例2 CAII突变对前体mRNA剪接影响的功能研究

1、CAII基因Minigene模型的构建

将长度为1562bp CAII mRNA transcript variant 1的783bp的CDS区域序列克隆到pIRES2-EGFP载体中，分别构建pIRES2EGFP-CAII MUT368和pIRES2EGFP-CAII WT。CAII参考序列依照NM_000067.3。以上所有质粒由博迈德合成，并经sanger测序检测基因无误。

2、细胞转染实验

(1)细胞培养

293T细胞用含10％的FBS、100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂以及饱和湿度的条件下培养。适时更换培养基和传代。

(2)转染

细胞分组：细胞分为正常培养组(293T)、野生型基因组(293T-WT)、突变型基因组(293T-G368A)。具体转染步骤如下：

转染前一天：铺平皿/铺六孔板(免疫荧光实验需提前在六孔板里加入细胞爬片)，每皿/每孔大约10⁷/10⁶个细胞，培养24，稀释质粒和转染试剂(4μL质粒+50μL NaCl；6μL转染试剂+50μL NaCl)将稀释后的转染试剂加入到稀释后的质粒中，制备质粒与转染试剂的混合液；将110μL混合物滴加入上述平皿/六孔板的细胞中，终体积为10mL，培养24h后更换成10mL正常培基。24h后进行后续的实验检测。

3、免疫荧光实验

分别取未处理组和转染组对数生长期的293T细胞接种于放有盖玻片的6孔细胞培养板中，进行细胞培养。细胞培养24h后，取出盖玻片，用预温的PBS洗涤3次，细胞经100％甲醇固定、0.2％TritonX-100(PBS稀释)通透和血清封闭30min后，加入抗CAII抗体，孵育过夜，再加入荧光标记的二抗，于37℃避光孵育30min，PBS清洗后用激光共聚焦显微镜进行观察和记录，滴加DAPI避光孵育10分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS 5分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。

4、Western Blot检测碳酸酐酶相对表达量

取对数生长期的细胞，制备细胞悬液。加入1mL PBS，500g离心5分钟。吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀。冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s)。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清。BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度，蛋白上样Buffer将蛋白定量为5mg/mL，-20℃保存备用。避免反复冻融。进行Western Blot实验。

5、结果

免疫荧光检测结果如图3所示，图中红色为用红光标记的免疫荧光抗体，其分布情况可显示CAII蛋白表达情况。相比野生型组，突变组的CAII蛋白的表达量显著降低，与对照组基本一致，说明突变c.G368A导致CAII蛋白的表达水平显著降低。

Western Blot检测结果如图4所示，其中，条带1/4/7为对照组，条带2/5/8位野生型组，条带3/6/9为突变组，从图中可以看出，转染突变组的CAII蛋白并未增加，其CAII蛋白的表达水平与对照组相一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川省人民医院

<120> 一种CAII的突变体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp

1 5 10 15

His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp

20 25 30

Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser

35 40 45

Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His

50 55 60

Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys

65 70 75 80

Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His

85 90 95

Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys

100 105 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His

115 120

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgtcccatc actgggggta cggcaaacac aacggacctg agcactggca taaggacttc 60

cccattgcca agggagagcg ccagtcccct gttgacatcg acactcatac agccaagtat 120

gacccttccc tgaagcccct gtctgtttcc tatgatcaag caacttccct gaggatcctc 180

aacaatggtc atgctttcaa cgtggagttt gatgactctc aggacaaagc agtgctcaag 240

ggaggacccc tggatggcac ttacagattg attcagtttc actttcactg gggttcactt 300

gatggacaag gttcagagca tactgtggat aaaaagaaat atgctgcaga acttcacttg 360

gttcactaga acaccaaata tggggatttt gggaaagctg tgcagcaacc tgatggactg 420

gccgttctag gtattttttt gaaggttggc agcgctaaac cgggccttca gaaagttgtt 480

gatgtgctgg attccattaa aacaaagggc aagagtgctg acttcactaa cttcgatcct 540

cgtggcctcc ttcctgaatc cttggattac tggacctacc caggctcact gaccacccct 600

cctcttctgg aatgtgtgac ctggattgtg ctcaaggaac ccatcagcgt cagcagcgag 660

caggtgttga aattccgtaa acttaacttc aatggggagg gtgaacccga agaactgatg 720

gtggacaact ggcgcccagc tcagccactg aagaacaggc aaatcaaagc ttccttcaaa 780

taa 783