阅读说明：本技术 一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法 (Meat product protein fresh-keeping preservative and preparation method thereof ) 是由 汤佳鹏 陈忠平 朱俐 陈肖 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及食品保鲜技术领域,公开了一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法,制备方法包括：(1)蛋白酶抑制剂的提取；(2)将乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶和蛋白酶抑制剂与水混合,加入乙二胺四乙酸二钠,纳滤脱盐后浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液制得肉制品蛋白保鲜防腐剂。本发明食品保鲜剂主要由蛋白质构成,喷洒到肉类表面后能够长期抑制微生物的生长,且用量少不改变食材的色泽和风味,是一种较安全的食品保鲜剂。(The invention relates to the technical field of food preservation, and discloses a meat product protein preservative and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) extracting a protease inhibitor; (2) mixing lactoferrin, nisin, lysozyme, a protease inhibitor and water, adding ethylene diamine tetraacetic acid, performing nanofiltration desalination, and mixing the concentrated solution with a sodium carboxymethylcellulose solution to obtain the meat product protein fresh-keeping preservative. The food preservative mainly comprises protein, can inhibit the growth of microorganisms for a long time after being sprayed on the surface of meat, does not change the color and flavor of food materials with small dosage, and is a safer food preservative.)

一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品保鲜技术领域，具体涉及一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法。

背景技术

传统的食物保鲜方法分为物理保鲜法与化学保鲜法。物理保鲜法，如低温冰冻保鲜、盐渍保鲜等，只能用于短期保鲜，而且不可避免地会改变水产品原有的风味。而常用的化学保鲜法，如添加化学保鲜剂、抗生素，则因不同程度的加入了化学成分越来越受到消费者的排斥。相对而言，生物保鲜剂不但对人体的健康无害，且不改变食品的风味。有些生物保鲜剂的效果甚至超过了化学保鲜剂。因此，研制新型、安全、高效的生物保鲜剂成了食品研究工作者关注的重点。但是生物保鲜剂往往存在保鲜效果差，且时效短的问题。因此，有必要开发一种能保鲜效果好、保鲜时效长并且对人体无害的保鲜防腐剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法，该肉制品蛋白保鲜防腐剂能够抑制微生物蛋白酶和淀粉酶活性，且用量少不改变食材的色泽和风味，是一种较安全的食品保鲜剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肉制品蛋白保鲜防腐剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.蛋白酶抑制剂的提取：取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂；

S2.将乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶和所述蛋白酶抑制剂与水混合，加入乙二胺四乙酸二钠，得混合溶液，将所述混合溶液纳滤脱盐后得浓缩液，将所述浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液制得肉制品蛋白保鲜防腐剂。

优选的，步骤S1中，所述超滤的超滤膜截留分子量为300-500kDa。

优选的，步骤S1中，所述蛋白酶抑制剂的蛋白浓度为80-100μg/L。

优选的，步骤S2中，所述乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶、蛋白酶抑制剂、乙二胺四乙酸二钠和水的用量比例是(8-10)g:(3.5-4)g:(15-20)g:(3-5)mL:(8.4-16.8)g:1000mL。

优选的，步骤S2中，所述乳铁蛋白的铁饱和度为10％-15％，乳酸链球菌素的比活力为1.0×10⁵-1.0×10⁶IU/mg，溶菌酶的比活力为10000-20000IU/mg。

优选的，步骤S2中，所述浓缩液的体积为所述混合溶液体积的1/8-1/5。

优选的，步骤S2中，所述浓缩液的掺入量为每100mL羧甲基纤维素钠溶液中掺入5-9mL的所述浓缩液。

优选的，步骤S2中，所述羧甲基纤维素钠溶液的浓度为10-30g/L，所述羧甲基纤维素钠溶液中羧甲基纤维素钠的分子量为30-50kDa，。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的肉制品蛋白保鲜防腐剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂中成分包括有乳铁蛋白(LF)、乳酸链球菌素(Nisin)、溶菌酶(LZ)和本发明方法提取得到的蛋白酶抑制剂。其中，本发明方法提取得到的蛋白酶抑制剂能够抑制蛋白酶对LF、LZ和Nisin的水解，使得三者能够发挥长效抗菌作用，LZ可以破坏细菌细胞壁，使LF和Nisin能直接作用于原生质体，通过几种成分之间的协同抗菌作用，达到了食品保鲜的目的。

2)在本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂的制备过程中还添加有乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠能够络合二价铁，再利用纳滤除去，就能达到LF脱铁的目的，进而提高LF的抗菌效能。

3)鲜肉中含有丰富的铁，本发明将纳滤脱盐后的浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液中，羧甲基纤维素钠膜能够有效隔绝铁与LF，阻止了LF因接触铁而引起的抗菌作用失效。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明提供了一种肉制品蛋白保鲜防腐剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.蛋白酶抑制剂的提取：取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂；

S2.将乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶和所述蛋白酶抑制剂与水混合，加入乙二胺四乙酸二钠，得混合溶液，将所述混合溶液纳滤脱盐后得浓缩液，将所述浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液制得肉制品蛋白保鲜防腐剂。

具体的，首先取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂；然后将乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶和蛋白酶抑制剂与水混合，加入乙二胺四乙酸二钠，得混合溶液，将混合溶液纳滤脱盐后得浓缩液，所得的浓缩液的体积优选为混合溶液体积的1/8-1/5；最后将浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液制得肉制品蛋白保鲜防腐剂。

鲜肉中含有丰富的铁，本发明将纳滤脱盐后的浓缩液掺入羧甲基纤维素钠溶液中，羧甲基纤维素钠膜能够有效隔绝铁与LF，阻止了LF因接触铁而引起的抗菌作用失效，其中浓缩液的掺入量优选为每100mL羧甲基纤维素钠溶液掺入5-9mL，羧甲基纤维素钠分子量优选为30-50kDa，羧甲基纤维素钠溶液的浓度优选为10-30g/L。

本发明中，超滤脱盐采用的超滤膜的截留分子量优选为300-500kDa，经过超滤脱盐浓缩后的蛋白酶抑制剂的蛋白浓度优选为80-100μg/L。本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂的制备过程中，乳铁蛋白、乳酸链球菌素、溶菌酶、蛋白酶抑制剂、乙二胺四乙酸二钠和水的用量比例优选为(8-10)g:(3.5-4)g:(15-20)g:(3-5)mL:(8.4-16.8)g:1000mL；其中，乳铁蛋白的铁饱和度优选为10％-15％，乳酸链球菌素的比活力优选为1.0×10⁵-1.0×10⁶IU/mg，溶菌酶的比活力优选为10000-20000IU/mg。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的肉制品蛋白保鲜防腐剂。

本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂中采用的乳铁蛋白(LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白，LF的抑菌作用是由于乳铁蛋白能高度结合铁，使细菌(乳酸杆菌除外)失去生长所需的基本元素铁而无法生长。LF的抑菌效果受多种因素影响，其中LF的铁含量对其抑菌作用起决定作用，当LF被铁饱和后，其抑菌特性就会消失。

本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂中采用的乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。食用后在人体的生理pH条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。

本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂中采用的溶菌酶(LZ)能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖。而对于革兰氏阳性菌(G⁺)，如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，细胞壁几乎全部由肽聚糖组成；对于革兰氏阴性菌(G^-)，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中内壁层为肽聚糖。因此，溶菌酶能够有效破坏细菌细胞壁，进而让乳铁蛋白(LF)和乳酸链球菌素(Nisin)能直接作用于原生质体。

通过几种成分之间的协同抗菌作用，本发明肉制品蛋白保鲜防腐剂达到了食品安全、长效保鲜的目的。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法进行详细描述。

α₂M粗提物的制备方法：

将新鲜的猪血浆，在-5℃条件下加入0.1％(w/v)大豆胰蛋白酶抑制剂，另加EDTA(乙二胺四乙酸)溶液使其终浓度至10mmol/L，经5％-18％聚乙二醇6000分级沉淀，充分搅拌60min后，4℃下10000r/min离心30min，5倍质量50mmol/L pH7.4 Tris-HCl溶液溶解沉淀，50mmol/L pH7.4 Tris-HCl溶液充分透析，即得α₂M粗提物。

实施例1

1、蛋白酶抑制剂的提取：取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为400kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂，其蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒测定为90μg/L；

2、将9g铁饱和度为12％的乳铁蛋白、3.7g比活力为5.0×10⁵IU/mg的乳酸链球菌素、17g比活力为15000IU/mg的溶菌酶和4mL步骤1制得的蛋白酶抑制剂与1000mL水混合均匀，加入12.4g乙二胺四乙酸二钠，纳滤脱盐后浓缩至原液体积的1/7，将7mL浓缩液掺入100mL羧甲基纤维素钠分子量为40kDa、浓度为20g/L的羧甲基纤维素钠溶液，制得肉制品蛋白保鲜防腐剂A。

实施例2

1、蛋白酶抑制剂的提取：取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为300kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂，其蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒测定为80μg/L；

2、将8g铁饱和度为15％的乳铁蛋白、3.5g比活力为1.0×10⁵IU/mg的乳酸链球菌素、15g比活力为10000IU/mg的溶菌酶和3mL步骤1制得的蛋白酶抑制剂与1000mL水混合均匀，加入8.4g乙二胺四乙酸二钠，纳滤脱盐后浓缩至原液体积的1/8，将9mL浓缩液掺入100mL羧甲基纤维素钠分子量为50kDa、浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠溶液，制得肉制品蛋白保鲜防腐剂B。

实施例3

1、蛋白酶抑制剂的提取：取α₂M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为500kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得蛋白酶抑制剂，其蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒测定为100μg/L；

2、将10g铁饱和度为10％的乳铁蛋白、4g比活力为1.0×10⁶IU/mg的乳酸链球菌素、20g比活力为20000IU/mg的溶菌酶和5mL步骤1制得的蛋白酶抑制剂与1000mL水混合均匀，加入16.8g乙二胺四乙酸二钠，纳滤脱盐后浓缩至原液体积的1/5，将5mL浓缩液掺入100mL羧甲基纤维素钠分子量为30kDa、浓度为30g/L的羧甲基纤维素钠溶液，制得肉制品蛋白保鲜防腐剂C。

猪肉保鲜效果试验

肉样处理：超市购买猪通脊肉，冷却使其中心温度降至0-4℃。事先用75％的酒精棉球擦拭刀具和案板，并紫外照15min。无菌操作去掉该肉块表面层以降低其表面初始菌数，并去除筋膜及多余的脂肪，切成100g左右的肉块，随机分成6组，每组5块。

取5组肉块分别喷涂不同的蛋白保鲜防腐剂(肉制品蛋白保鲜防腐剂A、B、C、0.1wt％山梨酸钾溶液和0.1wt％双乙酸钠溶液)2-4mL，利用无菌蒸馏水喷涂1组肉块作为对照组。包装方式为保鲜膜托盘包装，贮藏保鲜温度为3±1℃。在第0、7、14、21d分别按照GB4789.2-94《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》提供的方法进行菌落总数测定，结果以对数值(LogCFU/g)表示。评价标准：新鲜肉为4LogCFU/g以下，次鲜肉为4-6LogCFU/g，变质肉为6LogCFU/g以上。各组肉块菌落总数对数值结果如表1。

表1菌落总数对数值结果(LogCFU/g)

组别	0d	7d	14d	21d
					对照组	2.51±0.05	4.91±0.04	7.12±0.02	8.07±0.03
实施例1	2.43±0.04	2.75±0.03	3.24±0.05	3.77±0.04
					实施例2	2.36±0.03	2.68±0.05	3.27±0.03	3.69±0.05
实施例3	2.61±0.02	2.91±0.02	3.33±0.04	3.95±0.02
					0.1wt％山梨酸钾溶液	2.48±0.05	3.51±0.03	4.65±0.03	5.87±0.03
0.1wt％双乙酸钠溶液	2.39±0.03	3.78±0.04	4.82±0.02	5.79±0.03

由表1可知，随着贮存期的延长，各组菌落总数对数值呈上升趋势。贮存到14d，对照组的菌落总数对数值约为7.12，已经超过了国家标准(6LogCFU/g)，是变质肉，没有保鲜作用。贮存到21d，使用0.1wt％山梨酸钾溶液和0.1wt％双乙酸钠溶液处理的肉样菌落总数对数值未超过6LogCFU/g，为次鲜肉，具有一定的保鲜作用；而实施例1～3的菌落总数对数值未超过4LogCFU/g，仍属于新鲜肉，说明本发明制备的肉制品蛋白保鲜防腐剂能有效抑制细菌生长，具有显著的保鲜效果。

本发明提供了一种肉制品蛋白保鲜防腐剂及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。