阅读说明：本技术 铁死亡抑制剂在制备防治淹溺所致的肺损伤药物中的应用 (Application of iron death inhibitor in preparation of medicine for preventing and treating lung injury caused by drowning ) 是由 庞庆丰 邱玉保 吴亚先 陈丹 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,具体涉及铁死亡抑制在制备防护淹溺所致的肺损伤的药物中的应用。该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-1。本发明通过小鼠和细胞实验验证,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1抑制铁死亡,明显改善了淹溺引起的小鼠肺损伤和细胞损伤,对淹溺导致的肺损伤具有显著的保护作用。本发明为防治淹溺导致的肺损伤提供一个新的嵌入点。(The invention belongs to the field of biological medicine, and particularly relates to application of iron death inhibition in preparation of a medicine for preventing lung injury caused by drowning. The iron death inhibitor is Ferrostatin-1. According to the invention, experiments on mice and cells prove that the iron death inhibitor Ferrostatin-1 inhibits iron death, obviously improves the lung injury and cell injury of the mice caused by drowning, and has a remarkable protection effect on the lung injury caused by drowning. The invention provides a new embedded point for preventing and treating lung injury caused by drowning.)

铁死亡抑制剂在制备防治淹溺所致的肺损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及铁死亡抑制在制备防护淹溺所致的肺损伤的药物中的应用。

技术背景

溺水是全球意外死亡的重要原因之一，是重要的公共卫生问题。肺损伤是溺水最常见的并发症，约有三分之一溺水者患有急性肺损伤，严重的将发展成为急性呼吸窘迫综合征。研究表明氧化应激在小鼠淹溺性肺损伤中起重要作用。海水淹溺引起的肺损伤过程中，肺组织会产生过量的自由基且清除自由基的能力下降，引起氧化与抗氧化系统紊乱，导致氧化应激损伤。并且有研究表明清除ROS能减轻海水吸入引起的大鼠肺损伤。

最新研究表明，细胞死亡类型除了坏死、凋亡、自噬和坏死外，还有其他新的程序性死亡模式。铁死亡是2012年提出的一种不同于其他细胞病变类型，由脂质过氧化物积累引起的，铁依赖调节的细胞死亡形式。铁死亡形态上与其他细胞死亡形式不同，主要表现为线粒体明显收缩，膜密度增加，线粒体嵴的减少或消失，但细胞膜保持完整，细胞核大小正常，没有染色质浓缩。铁死亡的生化过程中，细胞内谷胱甘肽耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶4活性降低，脂质过氧化物不能被GPX4催化的还原反应所代谢，Fe²⁺以Fenton反应的方式氧化脂质，产生了大量ROS，进一步促进了铁死亡过程。Ferrostatin-1(Fer-1)是一种铁死亡抑制剂。作为含有N-环己基的化合物，Fer-1与细胞膜磷脂双分子层有较高亲和性，能有效清除长链多不饱和脂肪酸的脂质过氧化。

目前尚无铁死亡及抑制剂在淹溺所致的肺损伤方面作用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供铁死亡抑制剂Fer-1在制备治疗淹溺所致的肺损伤的药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种铁死亡抑制剂在制备防治淹溺所致的肺损伤方面药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Fer-1。

在发明过程中，发明人发现Fer-1处理能够显著改善海水淹溺导致的小鼠肺病理损伤、降低肺湿/干质量比、提高谷胱甘肽(GSH)含量、减少丙二醛(MDA)产生和提高超氧化物歧化酶(SOD)活性。还发现Fer-1处理能显著改善海水淹溺导致小鼠肺上皮细胞MLE-12细胞活力降低、降低细胞ROS含量和降低细胞脂质ROS含量。此外，Fer-1处理能明显改善海水淹溺引起的MLE-12细胞谷胱甘肽含量降低，减少了细胞丙二醛含量并且提高细胞超氧化物歧化酶活性。本发明的研究结果为Fer-1改善淹溺导致的肺损伤提供了理论依据，特别是对相关药物研发提供了基础。

铁死亡抑制剂Fer-1在治疗淹溺导致的小鼠肺损伤时，其用法和用量为：小鼠淹溺造模后3小时、24小时和48小时分别腹腔注射给药，每次剂量约为1～10毫克/公斤体重。

铁死亡抑制剂Fer-1在治疗淹溺导致的MLE-12细胞损伤时，用法和用量为：MLE-12细胞造模前用含有终浓度1～20微摩尔/升Fer-1的培养基培养预处理2小时，后用含有终浓度1～20微摩尔/升Fer-1的25％人工海水DMEM培养基培养6小时。

综上所述，本发明发现了铁死亡抑制剂Fer-1可用于防治海水淹溺导致的肺损伤相关疾病，有广泛的临床应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

作进一步详细说明。

图1为Fer-1对淹溺导致的小鼠肺组织病理损伤和肺湿/干质量比的影响。

图2为Fer-1对淹溺导致的小鼠肺组织谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。

图3为Fer-1对海水淹溺导致的MLE-12细胞活力和细胞ROS含量的影响。

图4为Fer-1对海水淹溺导致的MLE-12细胞脂质ROS含量的影响。

图5为Fer-1对海水淹溺导致的MLE-12细胞谷胱甘肽含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实验一：铁死亡抑制剂减轻海水淹溺导致的小鼠肺损伤

1.材料和方法

1.1实验动物

8周龄雄性C57野生型小鼠采购自南京大学模式动物研究所，SPF环境饲养，按体重随机分组，每组6只。

1.2药物及处理

化合物单体Fer-1购自Med Chem Express公司，溶于含2％二甲基亚砜DMSO的生理盐水中。Fer-1以5毫克/公斤体重的剂量在鼠淹溺造模后3小时、24小时和72小时分别腹腔注射给药。

1.3小鼠淹溺性肺损伤模型的构建

将小鼠放入镂空容器中，浸没在深度为6cm、水温为25±2℃的人工海水中35秒后取出进行心肺复苏。淹溺后72小时，用戊巴比妥(70毫克/公斤)麻醉小鼠，收集肺组织进行检测。

说明：对照不给药，与其他组同时间注射的是生理盐水。

1.4小鼠肺组织病理损伤检测

用4％多聚甲醛浸泡小鼠肺组织进行固定，用浓度从70％到100％梯度酒精脱水，脱水完成后用100％二甲苯进行组织透明。透明完成后放入蜡缸浸蜡，完成后包埋组织，进行石蜡切片。切片HE染色后，通过显微镜观察拍照。相关图像如图1A所示，淹溺+Fer-1组相对于淹溺组肺泡璧增厚和肺泡腔破坏等病理损伤现象明显改善，表明Fer-1具有改善淹溺导致的肺损伤的作用。

1.5小鼠肺组织肺湿/干质量比检测

取小鼠肺组织，用无尘纸吸去表面多余血液，称重获取湿重；将肺组织置于称量纸上，放入恒温干燥箱，60℃烘干72h后称重获取干重；计算肺组织湿重和干重的比值，得到肺组织湿/干质量比，此数值反映了肺组织水肿的程度。如图1B所示，淹溺+Fer-1组相对于淹溺组肺组织湿/干质量比明显降低，表明Fer-1具有改善淹溺导致的肺水肿的作用。

1.6小鼠肺组织谷胱甘肽含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性检测

称取适量的肺组织，使用生理盐水制备10％的肺组织匀浆，离心取上清，通过BCA法测定蛋白浓度，按照南京建成公司生产的剂盒说明书进行操作，通过酶标仪检测肺组织谷胱甘肽含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。谷胱甘肽耗竭和丙二醛积累是铁死亡的典型特征。超氧化物歧化酶活性降低也是机体抗氧化失衡和铁死亡的重要表现。如图2所示，淹溺+Fer-1组相对于淹溺组肺组织谷胱甘肽含量(图2A)明显升高、丙二醛含量明显降低(图2B)、超氧化物歧化酶活性明显升高(图2C)，表明Fer-1抑制铁死亡具有改善淹溺导致的肺损伤的作用。

1.7统计方法

全部数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism 7.0统计学软件进行统计学分析。P＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义。

2.结果

8周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分成4组，第一组为对照组，第二、三和四组均进行淹溺造模，其中第二组和第四组在淹溺造模后3小时、24小时和72小时分别腹腔注射Fer-1(5毫克/公斤体重)。淹溺72小时后解剖小鼠，收集肺组织，检测的小鼠肺病理损伤、肺湿/干质量比、谷胱甘肽含量、丙二醛产生和超氧化物歧化酶活性。

结果显示，相较于海水淹溺组，Fer-1处理能明显改善海水淹溺引起的小鼠肺组织病理损伤(图1A)，减轻肺水肿(图1B)，提高肺组织谷胱甘肽含量(图2A)、减少丙二醛含量(图2B)和提高超氧化物歧化酶活性(图2C)，说明其对肺损伤的保护作用。

实验二：铁死亡抑制剂减轻海水淹溺导致的细胞损伤

1.材料和方法

1.1实验细胞

小鼠肺上皮细胞株MLE-12购自美国模式培养物集存库(ATCC)，用10％胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.2药物及处理

①对照组：DMEM完全培养基培养；②Fer-1组：含有终浓度10μM Fer-1的DMEM完全培养基培养6h；③淹溺组：含25％人工海水的DMEM培养基培养6h；④淹溺+Fer-1组：人工海水造模前用含有终浓度10μM Fer-1的DMEM完全培养基培养预处理2h，后用含有终浓度10μMFer-1的25％人工海水DMEM培养基培养6h。

1.3细胞活力检测

将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔约5000个细胞，按实验需要处理完细胞后弃去培养基，每孔加入100μl CCK8工作液(按完全培养基体积：CCK8体积＝9:1配制)，避光置于细胞培养箱中孵育2h，通过酶标仪检测OD值。如图3A所示，相对于淹溺组，淹溺+Fer-1处理组细胞活力明显升高，Fer-1改善了海水导致的MLE-12细胞损伤。

1.4细胞内活性氧(ROS)检测

将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔约5000个细胞，按实验需要处理完细胞后弃去培养基，加入含有终浓度为10μM DCFH-DA的完全培养基，避光置于细胞培养箱中孵育1h，弃去培养基并用PBS洗涤3遍，通过全功能微孔板检测仪检测荧光强度。如图3B所示，Fer-1处理降低了MLE-12细胞ROS含量。

1.5细胞内脂质ROS检测

将MLE-12细胞接种于六孔板中，每孔约1×106个细胞，按实验需要处理完细胞后，加入C11-BODIPY581/591使得终浓度为2μM，置于细胞培养箱中避光孵育1h。PBS洗涤一次后，收集细胞重悬于适量的PBS中，通过流式细胞仪检测分析脂质ROS。脂质ROS积累是铁死亡的典型特征，如图4所示，Fer-1处理后明显改善了海水导致的MLE-12细胞脂质ROS积累的情况。

1.6细胞谷胱甘肽含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性检测

将MLE-12细胞接种于六孔板中，每孔约1×106个细胞，按实验需要处理完细胞后弃去培养基，PBS洗涤3遍，刮下细胞转入EP管，超声破碎后离心取上清，通过BCA法测定蛋白浓度，按照南京建成公司生产的剂盒说明书进行操作，通过酶标仪检测细胞谷胱甘肽含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。如图5所示，淹溺+Fer-1组相对于淹溺组细胞谷胱甘肽含量(图5A)明显升高、丙二醛含量明显降低(图5B)、超氧化物歧化酶活性明显升高(图5C)，表明Fer-1抑制铁死亡具有改善淹溺导致的MLE-12细胞损伤的作用。

1.7统计方法

全部数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism 7.0统计学软件进行统计学分析。P＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义。

2.结果

结果显示，相较于海水淹溺组，Fer-1处理能明显改善海水淹溺引起的MLE-12细胞活力降低(图3A)，减少MLE-12细胞ROS积累(图3B)，改善了MLE-12细胞脂质ROS积累的情况(图4)。此外，Fer-1处理能明显改善海水淹溺引起的MLE-12细胞谷胱甘肽含量降低(图5A)，减少了丙二醛含量(图5B)并且提高超氧化物歧化酶活性(图5C)，说明Fer-1抑制铁死亡对MLE-12细胞具有保护作用。

基于上述实验，运用Fer-1抑制铁死亡是治疗淹溺导致的肺损伤的新型疗法。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。