阅读说明：本技术 铁死亡抑制剂在制备治疗金诺芬肝毒性的药物中的应用 (Application of iron death inhibitor in preparation of medicine for treating auranofin hepatotoxicity ) 是由 王福俤 王浩 杨磊 闵军霞 于 2019-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了铁死亡抑制剂在制备治疗金诺芬肝毒性的药物中的应用,该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-1。本发明提供了Ferrostatin-1在抑制金诺芬导致的铁死亡过程的证据,为以铁死亡为靶点的金诺芬肝损伤的治疗提供了理论依据,特别是对临床过程中金诺芬与铁死亡抑制剂联合用药提供了基础。(The invention discloses application of an iron death inhibitor in preparing a medicament for treating auranofin hepatotoxicity, wherein the iron death inhibitor is Ferrostatin-1. The invention provides evidence of Ferrostatin-1 in the process of inhibiting iron death caused by auranofin, provides a theoretical basis for treating auranofin liver injury taking iron death as a target, and particularly provides a basis for combined administration of auranofin and an iron death inhibitor in a clinical process.)

铁死亡抑制剂在制备治疗金诺芬肝毒性的药物中的应用

技术领域

本发明涉及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在治疗金诺芬肝毒性中的应用。

背景技术

铁死亡(Ferroptosis)是一类铁依赖的细胞死亡途径，不同于凋亡、坏死、自噬等其他死亡途径。铁死亡表现为细胞脂质过氧化水平、标志基因Ptgs2表达量升高等多指标综合变化，可特异性被铁离子螯合剂抑制。

Ferrostatin-1是目前公认的铁死亡抑制剂。作为含有N-环己基的化合物，Ferrostatin-1与细胞膜磷脂双分子层有较高亲和性，能有效清除细胞膜脂质过氧化。体外实验中，Ferrostatin-1作用于癌细胞，抑制Erastin诱导的胞浆和脂质ROS积累，进而抑制铁死亡。在亨廷顿舞蹈症模型中，Ferrostatin-1抑制谷氨酸毒性引发的神经元铁死亡；在遗传性血色病中，Ferrostatin-1抑制铁过载导致的肝细胞铁死亡。

申请号201710919871.7的发明《铁死亡抑制剂在制备预防心肌缺血再灌注损伤药物中的应用》、申请号201710137097.4的发明《铁死亡抑制剂在制备抑制阿霉素所致心脏毒性药物中的应用》，专利号201610307748.5的发明《铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用》公开了Ferrostatin-1的相应作用。

此外，Ferrostatin-1不能抑制细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化或螯合铁，说明Ferrostatin-1抑制铁死亡不通过调控MEK/ERK通路、细胞铁水平或抑制蛋白合成。与生育酚等还原剂类似，Ferrostatin-1不稳定，容易被氧化成稳定的2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)。

金诺芬(Auranofin)是由Smith Kline&French研制的一类专为治疗类风湿性关节炎的口服金制剂。金诺芬微溶于水，易溶于类脂体。在1985年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗类风湿性关节炎。金诺芬经口服给药后，血浆中可以检测到15％～25％的药物，主要与白蛋白结合。药物血浆半衰期为15～25天，55～80天后几乎完全排出体外。85％的金诺芬通过粪便***，仅有15％通过尿液***，而肾脏中仅仅会蓄积0.4％的给药剂量。金诺芬不良反应发生率高达30％～50％，多发生在服药后的3个月内，主要表现为肝毒性、造血抑制等。截至目前，金诺芬已逐渐退出临床一线用药。

金诺芬(Auranofin)肝毒性的原因目前还不清楚，也没有关于铁死亡与体内金诺芬毒性关联性的相关报道，高剂量注射金诺芬是否会导致Ferroptosis也不得而知；即，目前没有任何文献报道金诺芬与血色病或铁死亡之间的联系。目前还没有能有效治疗/缓解金诺芬(Auranofin)毒性的药物，临床上对于金诺芬毒性常做停药处理。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗金诺芬肝毒性药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种铁死亡抑制剂在制备治疗/缓解金诺芬肝毒性的药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-1。

虽然铁死亡是多种肝损伤疾病的致病机制，但是药物造成的肝毒性有很多形式，例如抗肿瘤的化疗药、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂、降糖降脂药、抗细菌、抗真菌及抗病毒药等造成的肝毒性各不相同；因此已知的Ferrostatin-1抑制铁过载导致的肝细胞铁死亡不能提供本发明以技术启示。

在发明过程中，发明人发现高剂量金诺芬会导致铁死亡；发明人发现在Huh7肝癌细胞系中，Ferrostatin-1能明显抑制金诺芬导致的铁死亡。通过小鼠模型证实，Ferrostatin-1能明显抑制金诺芬导致的铁死亡和肝脏损伤。该研究结果为Ferrostatin-1缓解金诺芬毒性副作用提供了理论依据，特别是对临床过程中金诺芬与铁死亡抑制剂联合用药提供了基础。

在发明过程中，发现采用Ferrostatin-1腹腔给药的方式对上文中所述的抗肿瘤的化疗药、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂等导致的肝毒性均不能起到有效的治疗作用。

铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在治疗金诺芬毒性时，其用法和用量为：每天肌肉注射或静脉滴注ferrostatin-1(1mg/kg体重)，3周为一疗程。

金诺芬是临床治疗类风湿关节炎的药物，但存在肝损伤等副作用，因此限制了目前临床上对金诺芬的使用。本发明采用实验证明了ferrostatin-1能有效防止金诺芬的肝毒性副作用(图2)。

综上所述，本发明提供了铁死亡抑制剂在治疗金诺芬肝毒性中的应用，具体的，所述铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可用于制备治疗/缓解金诺芬肝毒性的药物，或者与金诺芬联合用药预防铁死亡肝毒性的补充剂。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了Ferrostatin-1在抑制金诺芬导致的铁死亡过程的证据，为以铁死亡为靶点的金诺芬肝损伤的治疗提供了理论依据，特别是对临床过程中金诺芬与铁死亡抑制剂联合用药提供了基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

作进一步详细说明。

图1为Ferrostatin-1体外抑制金诺芬引发的铁死亡；

A：空白处理(Con)、金诺芬(2.5μM)加二甲基亚砜(DMSO)、金诺芬(2.5μM)加Ferrostatin-1(2μM)，金诺芬(2.5μM)加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)加坏死抑制剂Necrostatin-1(10μg/mL)共处理小鼠肝原代细胞24小时，对细胞活力的挽救效果。

B：空白处理(Con)、金诺芬(2.5μM)加二甲基亚砜(DMSO)、金诺芬(2.5μM)加Ferrostatin-1(2μM)，金诺芬(2.5μM)加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)加坏死抑制剂Necrostatin-1(10μg/mL)共处理小鼠肝原代细胞12小时，对细胞脂质过氧化的抑制效果；

C：空白处理(Con)、金诺芬(2.5μM)加二甲基亚砜(DMSO)、金诺芬(2.5μM)加Ferrostatin-1(2μM)，金诺芬(2.5μM)加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)加坏死抑制剂Necrostatin-1(10μg/mL)共处理小鼠肝原代细胞12小时，对细胞Ptgs2 mRNA表达的抑制效果；

图2为Ferrostatin-1腹腔给药能抑制血色病小鼠中的铁死亡并改善肝损伤；

A:Ferrostatin-1(Ferr-1，每天1mg/kg体重)腹腔注射6周，雌雄Hfe^-/-小鼠致死曲线；

说明：右图中，AF+Ferr1与control完全重叠了，表明二者效果相同；

B:Ferrostatin-1(Ferr-1，每天1mg/kg体重)腹腔注射3周，雄性Hfe^-/-小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量；

C:Ferrostatin-1(Ferr-1，每天1mg/kg体重)腹腔注射3周，雄性Hfe^-/-小鼠肝脏Ptgs2 mRNA表达水平；

D:Ferrostatin-1(Ferr-1，每天1mg/kg体重)腹腔注射3周，雄性Hfe^-/-小鼠肝脏天狼星红染色。

AF代表金诺芬。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.材料和方法：

1.1实验原料制备：

化合物单体金诺芬购自MedChemExpress公司，Ferrostatin-1、Z-VAD-FMK和Necrostatin-1购自SIGMA公司，均溶于无菌二甲基亚砜DMSO中，配置成所需浓度。

1.2 Huh7肝癌细胞系：

Huh7肝癌细胞系培养条件：含10％FBS(GIBCO)的DMEM高糖型培养基(GIBCO)，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱。待细胞贴壁后，在培养基中分别加入DMSO，金诺芬(2.5μM，终浓度，下同)+DMSO，金诺芬(2.5μM)+凋亡抑制剂(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)+坏死抑制剂(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)+Ferrostatin-1(2μM)。处理24小时后通过MTT检测细胞活力(见1.3)。处理12小时后，收集细胞，进行Real-time PCR(见1.4)和细胞膜脂质过氧化水平测定(见1.5)。

所述凋亡抑制剂为Z-VAD-FMK；所述坏死抑制剂为Necrostatin-1。

1.3细胞活力测定(MTT)：

加药处理24小时的Huh7细胞通过MTT比色法检测细胞活力，MTT试剂盒购自碧云天。

1.4 RNA提取和Real-time PCR：

Trizol(Life Technologies)法提取细胞和组织的RNA，具体操作按说明书进行。Nanodrop1000Spectrophotometer上检测RNA纯度(OD260/OD280≈1.9-2.1)及RNA浓度(ng/μl)，调整RNA浓度到1μg/μl。

2.0μg RNA经DNase(Promega)处理后，M-MLV反转录酶(Promega)和Oligo(dT)18primer(Takara Bio Inc.)进行反转录。CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)中进行Realtime PCR，试剂采用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，反应体系为10μl，包括SYBGREEN 5μl、cDNA 1μl、引物2μl、ddH₂O 2μl。Real-Time程序为95℃预变性3分钟，40个循环(每个循环95℃10秒，60℃15秒过程中检测荧光)，检测溶解曲线。引物序列如下：

Mouse Actb(β-actin):

forward：AAATCGTGCGTGACATCAAAGA

reverse：GCCATCTCCTGCTCGAAGTC

mouse Ptgs2:

forward：CTGCGCCTTTTCAAGGATGG

reverse：GGGGATACACCTCTCCACCA。

1.5细胞膜脂质过氧化水平测定：

加药处理12小时后的Huh7细胞用胰酶消化成单细胞悬液。C11-BODIPY(10μM)室温避光孵育30分钟，PBS洗3次，流式细胞仪检测。C11-BODIPY购自Invitrogen。

小鼠肝脏组织用PBS匀浆，通过比色法检测脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。MAD试剂盒购自碧云天。

1.6实验动物：

Hfe敲除(Hfe-/-)小鼠为经典血色病动物模型，其表型与HFE-HH患者症状相似，表现为铁调素表达异常下降，全身铁过载。Hfe-/-小鼠没有肝损伤和铁死亡的症状及关联性。

Hfe^-/-小鼠于SPF环境饲养至8周龄，按体重随机分为三组，每组雌雄各8只。根据实验设计，三组分别给予每天腹腔注射生理盐水，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)+Ferrostatin-1(1mg/kg体重)，共处理6周，记录小鼠致死曲线。

Hfe^-/-小鼠于SPF环境饲养至8周龄，按体重随机分为三组，每组6只雄性。根据实验设计，三组分别给予每天腹腔注射生理盐水，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)+Ferrostatin-1(1mg/kg体重)，共处理3周。5％水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，分离血清，并收集肝脾肾组织(液氮保存)，检测肝脏脂质过氧化水平(方法同1.5)、纤维化指标(见1.7)和肝脏Ptgs2表达量(方法同1.4)。

1.7肝损伤指标的检测：

临床上常用肝脏纤维化来衡量肝损伤水平。肝脏纤维化通过对肝脏石蜡切片进行天狼星红染色，红染区域为肝脏纤维化产物——胶原，天狼星红染料购自Sigma，染色方法依照说明书。

1.8统计方法

所用统计采用R软件分析，实验数据以Mean±SEM表示。细胞和动物实验的组间比较采用Tukey’s检验(ANOVA)，两组间比较以Student's t-test检验，以P<0.05认为有统计学意义，字母不同表示P<0.05。

2.结果

2.1 Ferrostatin-1在Huh7肝癌细胞中抑制金诺芬导致的铁死亡

Huh7细胞体外培养，在培养基中分别加入DMSO，金诺芬(2.5μM，终浓度，下同)+DMSO，金诺芬(2.5μM)+凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)+坏死抑制剂Necrostatin-1(10μg/mL)，金诺芬(2.5μM)+Ferrostatin-1(2μM)。24小时后检测细胞活力。12小时后，检测铁死亡指标，包括细胞膜脂质过氧化、Ptgs2 mRNA水平。每个处理设3个复孔，实验重复三次。

如图1所示，实验结果发现，与Control相比，金诺芬+DMSO刺激能显著杀死细胞(图1A)；上调铁死亡指标，包括细胞膜脂质过氧化水平(图1B)和Ptgs2 mRNA表达(图1C)；说明体外细胞水平金诺芬会引发铁死亡。与金诺芬+DMSO相比，金诺芬+Ferrostatin-1处理能明显挽救细胞活力(图1A)，抑制金诺芬对脂质过氧化(图1B)和Ptgs2表达量(图1C)的上调；而金诺芬+凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和金诺芬+坏死抑制剂Necrostatin-1较金诺芬+DMSO处理则对细胞活力(图1A)、脂质过氧化(图1B)和Ptgs2表达量没有作用(图1C)。这说明金诺芬导致的细胞死亡方式为铁死亡，而非调凋亡或坏死。Ferrostatin-1在体外水平能抑制金诺芬导致的铁死亡。

2.2 Ferrostatin-1抑制金诺芬毒性

8周龄Hfe^-/-小鼠随机分为三组(每组雌雄各8只)，分别给予每天腹腔注射生理盐水，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)，腹腔注射金诺芬(25mg/kg体重)+Ferrostatin-1(1mg/kg体重)。处理6周记录小鼠致死曲线；处理3周检测肝脏MDA含量、Ptgs2 mRNA水平、肝脏纤维化。

图2A结果显示，无论雄性小鼠还是雌性小鼠，金诺芬处理组小鼠在注射后5周内全部100％死亡，而Ferrostatin-1+金诺芬联合处理则明显推迟并降低小鼠死亡(图2A)。铁死亡生理生化指标方面，金诺芬注射3周后小鼠肝脏MDA含量(图2B)、Ptgs2 mRNA水平(图2C)、肝脏纤维化水平(图2D)较生理盐水组(control)显著上升，说明金诺芬体内处理会导致铁死亡。与金诺芬单独处理组相比，金诺芬+Ferrostatin-1联合处理能明显恢复肝脏MDA含量(图2B)、Ptgs2 mRNA水平(图2C)、肝脏纤维化水平(图2D)，说明Ferrostatin-1在体内水平能抑制金诺芬导致的铁死亡，并改善铁死亡导致的肝损伤。

基于此，Ferrostatin-1抑制铁死亡是治疗金诺芬肝毒性的治疗方法。因此，以铁死亡为靶点，通过铁死亡抑制剂靶向抑制金诺芬引发的铁死亡，对金诺芬肝毒性的治疗和金诺芬安全用药具有重要意义。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 铁死亡抑制剂在制备治疗金诺芬肝毒性的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaatcgtgcg tgacatcaaa ga 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccatctcct gctcgaagtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcgccttt tcaaggatgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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