阅读说明：本技术 甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法 (Application method of nafamostat mesylate in treatment of chlamydia genital tract infection ) 是由 陈建林 彭亮 张宏波 沈宏伟 唐玲丽 胡紫昊 赵宇婕 刘珊珊 鲁琼 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其为甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法,包括以下步骤：A、选定实验材料；B、制定实验方法；C、观察实验结果；D、得出实验结论。本发明提供甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的新用途,尤其涉及甲磺酸萘莫司他制备治疗衣原体生殖道感染的药物方面的应用,以及甲磺酸萘莫司他在制备预防由衣原体生殖道感染引起的输卵管梗阻、输卵管积水、输卵管性不孕的药物方面的应用,而且通过体外细胞实验、动物实验等多个方面证明了甲磺酸萘莫司他可有效地治疗衣原体生殖道感染,进而可用于防治输卵管性不孕疾病。(The invention relates to the technical field of biological medicines, in particular to an application method of nafamostat mesilate in treating chlamydia genital tract infection, which comprises the following steps: A. selecting an experimental material; B. making an experimental method; C. observing an experimental result; D. and (5) obtaining an experimental conclusion. The invention provides a new application of nafamostat mesilate in treating chlamydia genital tract infection, in particular to an application of nafamostat mesilate in preparing a medicament for treating chlamydia genital tract infection, and an application of nafamostat mesilate in preparing a medicament for preventing fallopian tube obstruction, hydrosalpinx and tubal infertility caused by chlamydia genital tract infection.)

甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法。

背景技术

衣原体(Chlamydia)是一组极小的，非运动性的，专在细胞内生长的微生物，由其导致的泌尿生殖道感染是全球范围内最常见性传播疾病，根据WHO的统计，全球每年新增患者约1.272亿人^[1]。由于衣原体感染的临床表现无特异性，特别是女性感染者中，无症状者约占总体的80％，因此在临床诊断中常易漏诊。患者如果未得到及时的诊断和治疗，则易发展为慢性、持续性感染，造成生殖道组织的损伤、粘连及瘢痕形成，继而引起如输卵管性***、***、异位妊娠等诸多并发症^[2-4]，严重影响女性生殖健康。除此之外，生殖道衣原体感染还增加了***与艾滋病的患病风险^[5,6]，给家庭和社会带来沉重负担。

目前，根据WHO推荐的衣原体生殖道感染诊治共识，阿奇霉素和多西环素是作为治疗衣原体生殖道感染的一线用药，虽然大多数衣原体生殖道感染可被抗生素疗法治愈，但近年来由于多重耐药型衣原体的出现，抗生素治疗失败的报道逐渐增加^[7,8]。由于广谱抗生素的广泛使用以及诊治过程中经验性治疗的普遍应用，未来可能出现更多的多重耐药型衣原体^[9]。因此，在有效的衣原体疫苗出现之前，寻找其他能够治疗衣原体生殖道感染、预防输卵管病理损伤发生的有效药物是当务之急。

甲磺酸萘莫司他(CAS：82956-11-4)是人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，已被FDA批准用于：胰腺炎急性症状的改善、弥散性血管内凝血(DIC)患者的治疗、出血性或有出血倾向的患者进行血液体外循环时的抗凝^[10,11]。药理研究显示，甲磺酸萘莫司他对胰蛋白酶、凝血酶、血管舒缓素、血纤维蛋白酶、纤维蛋白酶、活性凝血因子(XIIa、Xa、VIIa)以及补体系统经典途径的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶具有很强的选择性抑制作用。近年研究表明，该化合物还可用于治疗其他领域的疾病：该化合物可通过其抗炎作用减轻炎症因子诱导的肺损伤^[12]；可用于肾、脑等器官缺血再灌注损伤的治疗^[13]；可通过下调NF-κB通路抑制胰腺癌^[14]、结直肠癌^[15]的生长；可通过下调Smad2-TGFβ通路抑制三阴性乳腺癌的生长^[16]；可用于治疗由衣原体诱发的反应性关节炎^[17]。

目前关于甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染以及预防输卵管梗阻、输卵管积水、输卵管***等并发症的应用，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法，具备提供甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的新用途的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法，包括以下步骤：

A、选定实验材料；

B、制定实验方法；

C、观察实验结果；

D、得出实验结论。

优选的，所述步骤A中实验材料包括菌株、动物、细胞、主要试剂中的任意若干种。

优选的，所述步骤B中实验方法具体分为三种，

①甲磺酸萘莫司他对衣原体感染生殖道上皮细胞的抑制作用；

②甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠生殖道的影响；

③***灌注甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠上、下生殖道细胞因子的影响。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、首次将甲磺酸萘莫司他用于治疗衣原体生殖道感染；

2、由于传统抗生素的广泛使用，部分种系的衣原体产生突变耐药性，传统抗生素疗法存在治疗失败的风险，而本技术方案尚未作为抗生素在临床上使用，耐药性低，可代替传统抗生素方案来治疗衣原体急性期感染；

3、为治疗衣原体急性感染提供了一个新的用药途径，即***局部用药，该用药途径与传统的全身性抗生素治疗相比有以下几方面的优势：①***局部用药的方式提高了病灶局部的药物浓度，药物更加直接地作用于衣原体与被衣原体感染的靶细胞；②***局部用药的方式减少了药物对于其他器官的影响，减轻了肝、肾等器官的代谢负担；③***局部用药的方式还减少由于抗生素全身用药后菌群失调的发生。

附图说明

图1为本发明甲磺酸萘莫司他对衣原体包涵体生长情况的影响图；

(注：上图为明场和红色荧光的融合图像，明场中为HeLa229细胞，红色荧光为衣原体包涵体)

图2为本发明甲磺酸萘莫司他对衣原体包涵体数量的影响图；

(注：**P<0.01***P<0.001，共计3次独立实验，每次实验中不同浓度均设置复孔)

图3为本发明甲磺酸萘莫司他对衣原体包涵体直径的影响图；

(注：***P<0.001，共计3次独立实验，每次实验中不同浓度均设置复孔)

图4为本发明不同组小鼠感染衣原体后***载菌量随时间的变化图；

(注：*P<0.05**P<0.01***P<0.001，n＝5-7)

图5为本发明甲磺酸萘莫司他对感染后小鼠上、下生殖道细胞因子的影响图；

(注：*P<0.05n＝5)

图6为本发明甲磺酸萘莫司他的结构式；

图7为本发明方法流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-7，甲磺酸萘莫司他在治疗衣原体生殖道感染的应用方法，包括以下步骤：

A、选定实验材料；

B、制定实验方法；

C、观察实验结果；

D、得出实验结论。

所述步骤A中实验材料包括菌株、动物、细胞、主要试剂中的任意若干种。

所述步骤B中实验方法具体分为三种，

①甲磺酸萘莫司他对衣原体感染生殖道上皮细胞的抑制作用；

②甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠生殖道的影响；

③***灌注甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠上、下生殖道细胞因子的影响。

实施例一：

甲磺酸萘莫司他对衣原体感染生殖道上皮细胞的抑制作用

1.实验材料

菌株与细胞：鼠衣原体(Chlamydia muridarum，Cm)Cm-mCherry荧光株，由本实验室构建，常规传代、纯化、保存，该荧光株在野生型Cm的质粒中导入红色荧光蛋白mCherry基因，菌株自带荧光，无需固定和抗体孵育，感染细胞后可活体下进行荧光观察。HeLa229细胞购自美国菌种典藏中心(ATCC)，由本实验室常规传代、保存；

主要试剂：甲磺酸萘莫司他购自美国Abcam公司，高糖DMEM培养基、胰酶购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；放线菌酮、庆大霉素、DEAE-葡聚糖购自美国Sigma-Aldrich公司；蔗糖、KH₂PO₄、K₂HPO₄、L-谷氨酸购自中国国药集团化学试剂有限公司。蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液(SPG缓冲液)配置：将蔗糖37.31g，KH₂PO₄ 0.2558g，K₂HPO₄0.6185g，L-谷氨酸0.3605g溶于超纯水，定容至500mL，调节pH值至7.2-7.4，0.2μm滤嘴过滤后分装、封口，4℃保存。

2.实验方法

HeLa229细胞传代至状态良好时，种于96孔板内，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养12h；待96孔板内细胞融合度均达到90％左右时，吸弃培养基，PBS缓冲液洗细胞一次，每孔加入100μl含终浓度为30μg/ml DEAE-葡聚糖的DMEM培养基预处理细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中20min；鼠衣原体感染液按感染复数(MOI)为0.8，接种于HeLa229细胞，室温下以500g/min，离心60min；吸弃感染液，加入高糖DMEM培养基培养(含10％胎牛血清+10μg/ml庆大霉素+2μg/ml放线菌酮+不同浓度的甲磺酸萘莫司他)，置于37℃、5％CO₂的培养箱中24h后,使用PBS缓冲液洗涤细胞一次，置于倒置荧光显微镜下进行活体荧光观察，每孔以中倍镜(20×)随机计数3个视野，计算每孔中包涵体的数量，拍照保存后，使用ImageJ软件对包涵体大小进行测量。使用GraphPad Prism 8软件进行数据处理、统计分析与绘图。

3.实验结果

如图1所示，在未加入甲磺酸萘莫司他的对照组中，HeLa229细胞胞内可见丰满的衣原体包涵体，随着培养基中甲磺酸萘莫司他浓度的增加，衣原体包涵体的生长情况受到抑制，包涵体数量与直径逐渐减少，包涵体形态由饱满的圆形逐渐变为不规则，当药物浓度大于50μg/ml时，包涵体被完全清除。如图2所示，当药物浓度大于5μg/ml时，包涵体的数量与对照组相比显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)；如图3所示，当药物浓度大于2.5μg/ml后，包涵体的直径与对照组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)。

4.实验结论

本实验使用女性生殖道上皮细胞系，通过体外实验模拟衣原体感染的过程。在感染衣原体后，使用不同浓度的甲磺酸萘莫司他对细胞进行干预。实验结果显示，甲磺酸萘莫司他可抑制衣原体在细胞内的生长，且抑制效果与剂量正相关，药物浓度大于50μg/ml时，衣原体包涵体被完全清除，且细胞状态良好，提示我们甲磺酸萘莫司他可用于治疗衣原体女性生殖道感染。

实施例二：

甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠生殖道的影响

1.实验材料

动物：C57BL/6小鼠，SPF级，6周龄，雌性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004；

细胞、主要试剂同实施例1。

2.实验方法

动物分组：腹腔对照组5只，***对照组5只，腹腔给药组6只，***给药组7只。

感染模型建立：感染衣原体前5天(-5d)，每只小鼠皮下预注射2.5mg的安宫***，使小鼠发情周期同步，便于衣原体感染。感染当天(0d)，每只小鼠***接种感染5×10⁵衣原体包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFUs)的Cm，根据5×10⁵IFUs Cm/只小鼠的接种剂量，将Cm母液稀释并重悬于预冷的SPG缓冲液中，调节加样枪以10μL/只小鼠取样后，将枪头缓慢而轻柔的伸入小鼠***内，在加样枪按钮打下第一档遇到阻滞感后继续加压，直至第二档以便将感染液全部打出，保持加样枪档位不变稍稍停滞待感染液被纳入后，轻缓地将枪头从小鼠***中退出。

给药方法：在感染后4小时，给药组每只小鼠按10mg/kg的剂量给予甲磺酸萘莫司他干预，每日给药一次，累计给药21天。腹腔给药组实施腹腔内注射药物，腹腔对照组以生理盐水代替甲磺酸萘莫司他；***给药组实施***灌药，***对照组以生理盐水代替甲磺酸萘莫司他。

下生殖道载菌量测试：分别于感染后第3、7、10、14、21、28天，检测每只小鼠下生殖道分泌物的衣原体载菌量。以无菌棉拭子取生殖道(***和宫颈体)分泌物重悬于500μL预备玻璃珠的SPG缓冲液中，使用涡旋震荡仪振荡，将分泌物中的衣原体释放至混合液中；取合适稀释度的混合液感染单层HeLa229细胞，于CO₂培养箱中培养24h后，置于倒置荧光显微镜下活体观察，并进行包涵体计数，每孔以中倍镜(20×)随机计数3个视野，根据包涵体计数、感染液稀释倍数、镜下视野面积、96孔板底面积等参数，计算每只小鼠下生殖道分泌物的衣原体载菌量。

3.实验结果

本实验中，分别以腹腔注射给药与***灌注给药两种方式，探究甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠生殖道的影响。如图4所示，与腹腔对照组相比，腹腔给药组小鼠不同时间段的***载菌量未有显著差异；与***对照组相比，***给药组小鼠的***载菌量在感染后第3、7、10天显著下降(P<0.01)；两种给药方式相比，***给药组对于***载菌量的抑制效果在感染后第3、10、14天显著优于腹腔给药组(P<0.05)。在感染后第21天，***给药组小鼠的***载菌量未能检出，早于其他3组小鼠。

4.实验结论

***灌注甲磺酸萘莫司他可抑制衣原体在生殖道中的生长与繁殖，并加快机体对于衣原体的清除。提示我们***灌注甲磺酸萘莫司他可用于治疗生殖道急性衣原体感染。

实施例三：

***灌注甲磺酸萘莫司他对衣原体感染小鼠上、下生殖道细胞因子的影响

1.实验材料

动物、细胞、主要试剂同实施例2。

2.实验方法

动物分组：***对照组10只，***给药组10只；

感染模型建立、给药方式同实施例2。

上、下生殖道细胞因子测定：分别于感染后第7、14天随机处死各组中5只小鼠，小心分离上、下生殖道。在匀浆器中分别加入上、下生殖道组织与500μl SPG缓冲液，冰上研磨，收集匀浆，以4℃、500g，离心5分钟，收取上清液。使用BD^TM Cytometric Bead Array试剂盒(BD CBA mouse inflammation kit,cat#552364)，分别对各小鼠上、下生殖道组织匀浆上清液中的IL-6,IL-10,MCP-1,IFN-γ,TNF-α,IL-12p70因子水平进行检测。

3.实验结果

如图5所示，在感染后第14天小鼠的下生殖道中，***给药组小鼠的TNF-α水平显著降低(P<0.05)，其余因子水平在组间无统计学差异。

4.实验结论

TNF-α主要由单核-巨噬细胞产生，是重要的炎性介质，根据既往研究报道，衣原体感染可显著增加TNF-α水平，高水平的TNF-α是衣原体感染后炎症反应的体现。在感染后第14天，***灌注甲磺酸萘莫司他的治疗方案有效地降低了下生殖道的TNF-α水平，减轻了下生殖道感染后的炎症反应，间接反映了治疗组下生殖道衣原体感染已被基本控制。该实验结果提示我们***灌注甲磺酸萘莫司他可用于治疗生殖道急性衣原体感染。

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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。