阅读说明：本技术 盐酸丙美卡因及其衍生化合物在制备预防和/或治疗癫痫药物中的应用 (Application of proparacaine hydrochloride and derivative compound thereof in preparation of medicine for preventing and/or treating epilepsy ) 是由 周其冈 孟帆 韩峰 塔里布 周亚萍 朱明仪 张乔 张锦诚 于 2020-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了盐酸丙美卡因、其药学上可接受的盐、酯等衍生化合物或其前药在制备预防和/或治疗癫痫和/或癫痫并发症药物中的应用。本发明试验证明：造模小鼠给予盐酸丙美卡因(10mg/kg,腹腔注射),10分钟后癫痫波(epileptic spike)开始显著下降,并且自发性癫痫(spontaneous recurrent seizure)发作也被显著抑制；造模小鼠给予盐酸丙美卡因(10mg/kg,灌胃),癫痫小鼠的spike和SRS均被显著抑制；盐酸丙美卡因未造成显著的细胞损伤。(The invention discloses application of proparacaine hydrochloride, pharmaceutically acceptable salts, esters and other derivative compounds thereof or prodrugs thereof in preparing medicines for preventing and/or treating epilepsy and/or epilepsy complications. The test of the invention proves that: the procaine hydrochloride (10mg/kg, i.p.) administered to the model-making mice began to decrease significantly after 10 minutes (epileptic spike) and the spontaneous seizure (spontaneous seizure) was also significantly suppressed; when the procaine hydrochloride (10mg/kg, gavage) is given to the model-making mice, the spike and SRS of the epileptic mice are obviously inhibited; proparacaine hydrochloride caused no significant cellular damage.)

盐酸丙美卡因及其衍生化合物在制备预防和/或治疗癫痫药 物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种盐酸丙美卡因及其衍生化 合物在制备预防和/或治疗癫痫药物中的应用。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是一种由于大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大 脑功能障碍的慢性脑部疾病，会突然间毫无征兆地发作，且在任何年龄段的人 群均可发病，是最常见的神经系统疾病之一。癫痫发作导致了脑内神经环路和 活动的异常，使患者遭受认知、情绪和精神紊乱，不仅严重影响患者的正常工 作和生活，也缩短了患者的平均寿命。因此，癫痫一直是一个重要社会问题和 全球经济负担，癫痫的发病机制及治疗策略也是研究者的重点关注对象。

癫痫发作的临床表征主要为中枢神经系统局部或整个脑区神经元的异常 同步化放电。神经元间的电活动平衡主要由兴奋性和抑制性神经元的活动彼 此相互牵制形成，脑内兴奋性活动的增强或抑制性活动的减弱均会影响神经网 络环路的电平衡。离子通道是担负中枢神经系统兴奋性活动(即神经元动作电 位的传导)以及形成神经环路(即神经元间突触信号的传递)的核心构件，任 何离子通道的基因突变都有可能异化通道蛋白的正常功能，造成中枢神经系统 电活动的失衡，最终诱发异常同步化放电。电压门控钠通道在神经元中产生动 作电位，其功能失调可引起遗传性癫痫、慢性疼痛等过度兴奋性疾病。

目前盐酸丙美卡因主要作为表面麻醉剂用于粘膜和角膜表面如鼻腔、咽喉 部、食道、气管及尿道等粘膜，以及眼角膜上。在眼科中广泛用于眼科检查和 各种眼科手术，如白内障摘除；近视眼激光治疗；眼压计测量眼内压；手术缝 合及取异物；结膜及角膜刮片，前房角膜检查，三面镜检查等。

目前常用于临床的一大类抗癫痫药物，其机制即是选择性作用于钠通道， 阻断钠离子依赖性动作电位的快速发放，调节电压依赖性钠离子通道。此外， 这些药物还可以阻断钙离子通道，调节Na+-K+-ATP转化酶活性，从而达到抗 惊厥作用。亟待研发一种新的抗癫痫的药物。

发明内容

为此，本发明提供盐酸丙美卡因及其衍生化合物在制备预防和/或治疗癫 痫药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、酯或其前药在 制备预防和/或治疗癫痫和/或癫痫并发症药物中的应用

其中，R1,R2,R3为1～4个碳原子的烷基；n＝1，2或3。

上述式(I)所示的化合物如下应用，所示化合物、其药学上可接受的盐、 酯或其前药在制备预防和/或治疗癫痫和/或癫痫并发症的产品；制备抑制电压 门控性钠通道的产品；制备抑制神经元细胞内启动和传导脉冲所需的钠离子内 流的产品。

所述癫痫并发症包括生殖功能低下、神经内分泌功能紊乱和神经精神障 碍。

上述所述的化合物、其药学上可接受的盐或其前药有效剂量组成的药物 组合物，其中含有一个或多个药学上可接受的药物载体。

上述所述的药物组合物，其中，所述药物载体包括：稀释剂、赋形剂、 粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂。

上述所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、 口服液、注射剂、粉剂、膏剂或外用药液。

本发明中，盐酸丙美卡因的分子式为C₁₆H₂₆N₂O₃·HCl，分子量为330.86， 溶解度为：DMSO:10mg/mL(30.2mM)，Water:61mg/mL(184.4mM)，Ethanol: <1mg/mL，(<1mg/mlrefers to the product slightly soluble or insoluble)，化学 式如下所示：

盐酸丙美卡因是丙哌卡因的盐酸盐形式，它是一种具有局部麻醉性质的苯 甲酸衍生物。盐酸丙美卡因通过结合和抑制电压门控性钠通道来稳定神经元 膜，从而抑制神经元细胞内启动和传导脉冲所需的钠离子内流，并导致感觉丧 失。

本发明的一个实施例中，其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、口 服液、注射剂、粉剂、膏剂或外用药液。

本发明中，术语“前药”是指一种作为药物前体的化合物，该化合物在被 服用后，在体内通过代谢或化学过程(例如，被置于生理pH条件下或通过酶的 活性)发生化学转化，释放活性药物。本发明的“前药”也可包括本发明化 合物的代谢前体，该类前药在对主体给药时可能不具有活性，但可在体内转化 为本发明的式(I)化合物或其盐和/或溶剂化物。前药也可以是天然存在或 者化学合成的化合物。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或 所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在 生理上与受体相兼容。

术语“盐”和“可药用的盐”是指式(I)所示的化合物或其立体异构体， 或其前药与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐 (内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离 和纯化中直接得到。也可以是通过将式(I)所示化合物，或其立体异构体， 或其前药，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些 盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或 在水介质中反应后冷冻干燥制得。

本发明的化合物所述治疗的肿瘤不是所有肿瘤，而是特定的肿瘤，如通 过特定机制而能够凋亡的肿瘤。根据试验结果，式(I)化合物的体外抗肿瘤 细胞增殖作用是通过抑制IKKβ所导致的。式(I)化合物(D6)可以直接结 合于IKKβ，并抑制其磷酸化下游底物，继而减少所调控基因(Bcl-2)的表 达，并激活Caspase家族特异性切割底物PARP，从而显著诱导肿瘤细胞凋 亡。在细胞实验中，式(I)化合物对多种特定肿瘤细胞的增殖抑制活性皆能 达到单微摩尔级别。

本发明中，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例 如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生 物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸 钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载 体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还 可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方 式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如 片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂 如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性 悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。 例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明具有如下优点：

本发明试验证明：造模小鼠给予盐酸丙美卡因(10mg/kg，腹腔注射)， 10分钟后spike开始显著下降，并且SRS也被显著抑制；造模小鼠给予盐酸 丙美卡因(10mg/kg，灌胃)，癫痫小鼠的spike和SRS均被显著抑制；盐酸 丙美卡因未造成显著的细胞损伤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见 地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在 不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附 图。

图1为本发明实施例提供的首次急性腹腔注射10mg/kg体重的盐酸丙美 卡因小鼠的脑电波效果图；

图2为本发明实施例提供的给药前及给药后模型小鼠的癫痫波数量；

图3为本发明实施例提供的给药前和给药后模型小鼠总癫痫波的数量和 癫痫发作次数统计示意图；

图4为本发明实施例提供的给药后24小时内的模型小鼠总癫痫波的数量 和癫痫发作次数统计示意图；

图5为本发明实施例提供的盐酸丙美卡因细胞毒性试验结果示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可 由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描 述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、酯或其前药在制备预防和/ 或治疗癫痫和/或癫痫并发症药物中的应用

其中，R1，R2，R3为1～4个碳原子的烷基；n＝1，2或3。

具体的，本实施例提供的盐酸丙美卡因的分子式为C₁₆H₂₆N₂O₃·HCl，分子 量为330.86，其化学式如下式(II)所示：

本发明试验表明盐酸丙美卡因腹腔注射和口服灌胃均具有较好的抗癫痫 效果，且无明显的毒副作用。盐酸丙美卡因是丙哌卡因的盐酸盐形式，它是一 种具有局部麻醉性质的苯甲酸衍生物。盐酸丙美卡因通过结合和抑制电压门控 性钠通道来稳定神经元膜，从而抑制神经元细胞内启动和传导脉冲所需的钠离 子内流，并导致感觉丧失。

试验实施例1、本发明的盐酸丙美卡因对模型小鼠的腹腔注射试验

1、实验动物：C57BL/6J小鼠(8-10周)购自上海斯莱克实验动物有限责 任公司，所有小鼠的饲养根据标准规章制度进行，所有针对动物的实验程序按 照南京医科大学实验动物福利伦理委员会的指导原则执行。

试剂与耗材：毛果芸香碱盐酸盐(Pilocarpine hydrochloride,Pilocarpine) 购自Sigma，货号P6503；东良宕碱甲基硝酸(Scopolamine methyl nitrate, Scopolarmine)购自Tcichemicals，货号S0230；阿托品甲基硝酸酯(Atropine methyl nitrate,Atropine)购自Sigma，货号SML0732；特布他林半硫酸盐 (Terbutaline hemisulfate salt,Terbutulin)购自Sigma，货号T2528；地西泮购自 医院。

本实施例中，用到的设备EEG脑电波检测仪购自Nihon Kohden，型号 EEG1200C；螺钉电极购自PlasticOne，货号E363-96-2.4-SPC，长度6.5mm； 直电极购自PlasticOne，货号E363T-2-SPC，长度7.5mm；电极底座购自 PlasticOne，货号MS363；电极转换器购自PlasticOne，货号SL6C；电极连接器 电缆购自PlasticOne，货号363-441/6，长度3m。

2、试验过程

步骤一、毛果芸香碱(Pilocarpine)皮下注射构建小鼠自发性癫痫模型

Pilocarpine为胆碱能肌肉激动剂，全身给药可引起癫痫发作，Pilocarpine 模型是目前应用最多的癫痫持续状态模型及自发发作模型。它发生发展过程与 人类颞叶癫痫高度相似，具有相同的病理学基础，对大部分抗癫痫药物耐药， 是研究颞叶癫痫的理想工具。

癫痫模型发作等级评判小鼠癫痫发作等级评分采用Racine等级评判标准： 0级：奔跑正常，无任何其他非应激性反应；一级：面部肌肉阵挛、颤动，如 眨眼、胡须跳动、节律性咀嚼等；二级：一级发作加呈节律性点头、前肢阵挛； 三级：二级发作加前肢肌阵挛但没有后肢直立动作；四级：三级加后肢直立动 作，伴有斜行双侧、摔倒；五级：全身强直，摔倒，失平衡，翻滚并失去体位， 四肢抽搐。三级及以上判定为重度发作，为成功的癫痫模型，用于后续实验。

称量小鼠体重，小鼠的体重很关键，22-28g小鼠最合适，全部使用雄性小 鼠。腹腔注射Scopolarmine、Atropine、Terbutulin，剂量是2mk/kg体重，需要 记录注射时间，30分钟后注射pilocarpine。皮下注射Pilocarpine，剂量是280 mg/kg体重，然后密切观察2-3小时期间小鼠抖动情况，评判癫痫发作等级。

3h后，给予小鼠腹腔注射地西泮终止痫性发作，剂量是0.01mg/只，选取 三级及以上的小鼠继续饲养并用于EEG电极植入和检测。

步骤二、癫痫模型小鼠头部植入EEG电极

EEG(Electroencephalogram)，脑电波监测是研究癫痫小鼠脑部电活动的 有效方式之一，Pilocarpine造模后75天左右开始EEG记录与分析。

在脑电记录前一周，在小鼠麻醉状态下，用脑立体定位仪定向将五个记录 电极：左右皮层各1个，前额皮层1个，左右海马各1个，植入小鼠颅内。然后， 将电极连接到连接器底座，该底座用牙科水泥固定在颅骨上。在进一步的操作 和长时间的脑电图监测开始之前，让小鼠在24-72小时内不受限制，以便从手 术中恢复。

将小鼠头顶连接器底座通过转换器、连接器电缆连接到EEG脑电波检测 仪，使用EEG2100软件进行数字脑电图记录与分析。首先记录给药前持续3 天内每只模型小鼠的脑电图，全身自发性癫痫发作定义为持续在所有电极上超 过3秒的重复性癫痫样发作活动(>3Hz)，选取出现自发性癫痫发作脑电波的 小鼠作为成功的癫痫模型。然后，每天一次、连续3天腹腔注射本发明的抗癫 痫效果的盐酸丙美卡因，剂量是10mg/kg体重，并持续记录小鼠的连续脑电 图。最后，记录给药后小鼠脑电图。在记录过程中，小鼠自由活动，可以随意 获取食物和水。

试验结果：Pilocarpine造模后2.5个月，小鼠发展出稳定的癫痫脑电波 (spike)和自发性癫痫发作脑电波(spontaneous recurrent spikes，SRS)，造模 小鼠给予盐酸丙美卡因(简写D-5，10mg/kg，腹腔注射)，10分钟后spike 开始显著下降，并且SRS也被显著抑制，如图1至图3所示。具体的，如图1 所示，与癫痫波在开始给药时相比，给药10分钟后、给药20分钟后、给药 30分钟后，癫痫波的频率和幅度显著下降。如图2所示，统计给药后24小时 内的总癫痫波的数量，表明给药后显著抑制24小时内的癫痫波数量。如图3 所示，统计给药后24小时内的癫痫发作的次数，给药后显著抑制24小时内的 癫痫发作次数。

试验实施例2、本发明的盐酸丙美卡因对模型小鼠的口服灌胃试验

步骤一、毛果芸香碱(Pilocarpine)皮下注射构建小鼠自发性癫痫模型

Pilocarpine为胆碱能肌肉激动剂，全身给药可引起癫痫发作，Pilocarpine 模型是目前应用最多的癫痫持续状态模型及自发发作模型。它发生发展过程与 人类颞叶癫痫高度相似，具有相同的病理学基础，对大部分抗癫痫药物耐药， 是研究颞叶癫痫的理想工具。

癫痫模型发作等级评判小鼠癫痫发作等级评分采用Racine等级评判标准： 0级：奔跑正常，无任何其他非应激性反应；一级：面部肌肉阵挛、颤动，如 眨眼、胡须跳动、节律性咀嚼等；二级：一级发作加呈节律性点头、前肢阵挛； 三级：二级发作加前肢肌阵挛但没有后肢直立动作；四级：三级加后肢直立动 作，伴有斜行双侧、摔倒；五级：全身强直，摔倒，失平衡，翻滚并失去体位， 四肢抽搐。三级及以上判定为重度发作，为成功的癫痫模型，用于后续实验。

称量小鼠体重，小鼠的体重很关键，22-28g小鼠最合适，全部使用雄性小 鼠。腹腔注射Scopolarmine、Atropine、Terbutulin，剂量是2mg/kg体重，需要 记录注射时间，30分钟后注射pilocarpine。皮下注射Pilocarpine，剂量是280 mg/kg体重，然后密切观察2-3小时期间小鼠抖动情况，评判癫痫发作等级。

3h后，给予小鼠腹腔注射地西泮终止痫性发作，剂量是0.01mg/只，选取 三级及以上的小鼠继续饲养并用于EEG电极植入和检测。

步骤二、癫痫模型小鼠头部植入EEG电极

EEG(Electroencephalogram)，脑电波监测是研究癫痫小鼠脑部电活动的 有效方式之一，Pilocarpine造模后75天左右开始EEG记录与分析。

在脑电记录前一周，在小鼠麻醉状态下，用脑立体定位仪定向将五个记录 电极：左右皮层各1个，前额皮层1个，左右海马各1个，植入小鼠颅内。然后， 将电极连接到连接器底座，该底座用牙科水泥固定在颅骨上。在进一步的操作 和长时间的脑电图监测开始之前，让小鼠在24-72小时内不受限制，以便从 手术中恢复。

将小鼠头顶连接器底座通过转换器、连接器电缆连接到EEG脑电波检测 仪，使用EEG2100软件进行数字脑电图记录与分析。首先记录给药前 (pre-drug)持续3天内每只模型小鼠的脑电图，全身自发性癫痫发作定义为 持续在所有电极上超过3秒的重复性癫痫样发作活动(>3Hz)，选取出现自发 性癫痫发作脑电波的小鼠作为成功的癫痫模型。然后，每天一次、连续3天本 发明的抗癫痫效果的盐酸丙美卡因灌胃，剂量是10mg/kg体重，并持续记录 小鼠的连续脑电图。最后，记录给药后小鼠脑电图。在记录过程中，小鼠自由 活动，可以随意获取食物和水。

Pilocarpine癫痫造模后2.5个月，小鼠发展出稳定的癫痫脑电波(spike) 和自发性癫痫发作脑电波(spontaneous recurrent spikes，SRS)，造模小鼠给 予盐酸丙美卡因(简写D-5，10mg/kg，灌胃)，癫痫小鼠的spike和SRS均被 显著抑制。如图4所示，统计给药后24小时内的总癫痫波的数量和癫痫发作 次数，表明给药后显著抑制24小时内的癫痫波数量和癫痫发作次数。

试验实施例3、细胞毒性试验

本实施例中，通过培养PC12细胞，进行Cell Counting Kit-8(简称CCK-8) 细胞毒性测试，制备细胞悬液，接种到96孔板中，37℃培养箱中贴壁培养， 孵育药物不同浓度(0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml)24小时后，加 入10μl CCK-8培养4小时后，测定450nm吸光度。盐酸丙美卡因和参照药 物左乙拉西坦均未造成显著的细胞损伤，如图5所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。