用于治疗眼睛后段疾病的包含羟苯磺酸的眼科局部组合物
阅读说明：本技术 用于治疗眼睛后段疾病的包含羟苯磺酸的眼科局部组合物 (Ophthalmic topical compositions comprising oxybenzene sulfonic acid for the treatment of posterior segment diseases of the eye ) 是由 X·卡普德维拉·诺尔特斯 J·萨纳古斯廷·阿奎鲁 M·I·德尔加多·加南 于 2018-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于治疗和/或预防眼睛后段疾病、特别是视网膜和视神经病症的新治疗方法。提出了将羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯局部施用在眼睛表面。还公开了适合于进行眼睛后段疾病的治疗和/或预防的新组合物,其包含羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯。(The present invention relates to novel therapeutic methods for the treatment and/or prevention of diseases of the posterior segment of the eye, in particular retinal and optic neuropathies. It is proposed to topically apply to the surface of the eye a hydroxybenzenesulfonic acid and/or a pharmaceutically acceptable salt or an ester of any of said acids or salts. Also disclosed are novel compositions suitable for performing the treatment and/or prevention of a posterior segment eye disease, comprising a hydroxybenzenesulfonic acid and/or a pharmaceutically acceptable salt or an ester of any one of the acids or salts.)
本申请要求2017年12月4日递交的欧洲专利申请17382832.8的权益。
技术领域
本发明涉及用于治疗眼后房疾病的医疗方法领域，所述疾病包括视网膜病变以及视神经的病症。本发明还涉及眼科用组合物。
背景技术
眼睛是一个复杂的器官，具有不同的专门细胞和组织，其经调节以维持最佳的视觉功能。通过在眼睛的前段和后段存在紧密的屏障来实现此功能，这些屏障通过选择性控制流体和溶质的向内和/或向外移动而发挥关键作用。局部和全身性疾病可能会影响眼睛的不同区域，但是眼睛的解剖结构以及视网膜和视神经的复杂生理机能对有效药物的开发提出了挑战。
眼睛大致分为两个部分，分别称为前段(眼前部)和后段(眼后部)。眼的前段是指角膜、结膜、前巩膜(巩膜的一部分，其向前过渡成为角膜缘处的角膜)、虹膜、睫状体、房水和晶状体。眼睛后段(也称为眼睛后段)包括前玻璃体膜和在该膜后面的结构、后巩膜(巩膜的一部分，其向后过渡到视神经硬膜鞘)、玻璃体(包括玻璃体液和膜)、视网膜、黄斑、脉络膜和视神经。后段代表三分之二的眼睛。视力受损和不可逆性失明的主要原因是与眼睛后段有关的疾病。
眼部药物施用的侵入性最小的途径是局部制剂(例如滴眼剂)。局部施用是治疗前段疾病的主要方式。然而，避免病原体进入的眼屏障也阻碍了药物的递送，甚至是向前段的递送。另外，眨眼和泪膜周转旨在冲洗掉异物并保持光滑的透明前表面，这也限制了药物的停留时间。此外，紧密堆积的角膜上皮和具有不同亲脂性的基质阻碍了进入后段(参见Awwad等，“Principles of Pharmacology in the Eye”,British Journal ofPharmacology-2017，174卷，23期:4205-4223页)。此外，眼中水流方向(睫状体至前房角)与通过局部途径的药物递送方向相反。
尽管如此，如果药物最终可以到达眼睛后段，则其可能通过扩散进入前房或通过血视网膜屏障而被从玻璃体腔中去除。所有这些都使得通过在眼睛表面上进行局部施用对后段的疾病进行的任何眼治疗都是困难的，并且在日常使用中治疗眼后段的疾病的唯一局部方式是玻璃体内注射(IVT)或眼周注射。IVT注射可避开所有屏障，并实现最大的生物利用度。但是，IVT注射意味着虽小但严重的致盲并发症的风险、视网膜脱离和感染性内膜炎的风险。此外，这些注射代表了针对疾病初期的高度侵入性治疗模式。
另一方面，用于治疗眼后段疾病的全身性制剂必须克服血视网膜屏障(BRB)，其控制眼血管床之间的流体和分子运动，并防止大分子(例如白蛋白)和有害分子渗漏在视网膜中。由于BRB的外层和内层之故，任何药物向视网膜和玻璃体的流入都受到极大限制。这意味着许多制剂需要高剂量的药物并伴有不良副作用。
主要的后段眼科疾病包括诸如病理性新血管形成和异位增生、萎缩和神经细胞死亡、炎症和感染以及脱离等病况。通常与这些症状相关的疾病和病况包括黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜色素变性、黄斑水肿、青光眼、后葡萄膜炎、眼内炎、全身性疾病的眼部侵害和眼部表现(例如病毒感染、关节炎和红斑痤疮)。
已知口服羟苯磺酸钙一水合物(CDO)用作糖尿病性视网膜病变(DR)和静脉功能不全的治疗。(Laboratorios Dr.Esteve)是羟苯磺酸钙一水合物硬胶囊的商品名，其针对非增殖性糖尿病性视网膜病变施用。
CDO是羟苯磺酸(dobesilic acid)的钙盐的一水合物，也称为2,5-二羟基苯磺酸一水合物。羟苯磺酸钙的CAS编号为20123-80-2。CDO(CAS编号，117552-78-0)具有下式(I)：
众所周知，CDO是一种可容易氧化成3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-磺酸钙且因此高度不稳定的化合物。CDO的这种物理化学性质预示了局部施用的缺点，因为它会快速氧化。另外，CDO是一种极其亲水的分子，这对于眼部药物吸收是极大的障碍。众所周知，角膜上皮本质上是类脂的，对局部施用的亲水性药物的渗透具有显著的抗性，此外，结膜上皮紧密连接可以进一步延缓亲水性分子的被动运动(Gaudana等,“Ocular drug delivery”,American Association of Pharmaceutical Sci.2010Sep；12(3):348-360.doi:10.1208/s12248-010-9183-3.Epub 2010年5月1日)。角膜和结膜上皮是避免高亲水性分子如羟苯磺酸及其盐的渗透的生理屏障。此外，药物向后部眼组织的渗透主要受血液-视网膜屏障(BRB)的控制，其对于高疏水性分子可选择性渗透，而这对于高溶解性分子如CDO是另一个限制步骤。由于极性分子的生物利用度有限，故一些增强经巩膜视网膜递送眼部药物吸收的策略已专注于开发疏水性前药(Vadlapudi等,“Ocular Drug Delivery”,第10章:2019-263页)。
作为用于治疗黄斑下和玻璃体下出血的IVT注射剂的活性成分，专利申请EP2875811A1中已公开了CDO类似化合物，特别是羟苯磺酸的盐2,5-二羟基苯磺酸二乙胺(酚黄乙胺(Etamsylate)，Sanofi-Aventis)。专利EP2777699B1中还公开了的IVT注射剂，其用于治疗与年龄有关的黄斑变性。尽管未显示数据，但两个文献都提出使用眼部表面作为侵入性IVT注射的替代方案。这主要是因为由于眼睛前段所施加的上述屏障，药物不太可能到达眼睛后段。如果药物是高极性或亲水性药物则可能性更小，并且其必须通过该前段的不同组织的可变亲脂性。同样由于其溶解性，可溶性药物会被眼泪快速冲走。此外，如果考虑到该药物会被快速氧化，则局部IVT注射似乎是最佳选择。
由于所有这些原因，除了全身施用用于治疗DR的CDO以外，如今还提出了其他羟苯磺酸盐化合物用于这些IVT注射剂在眼后段疾病的治疗，但是没有用于这些化合物的局部眼施用的组合物(例如参见Cuevas等，“Single Intravitreal Injection ofEtamsylate for the Treatment of Geographic Atrophy Associated with SubmacularHemorrhage”,MOJ Clin Med Case-2017,7(1)期:00186；Cuevas等，“IntravitrealDobesilate Injection for Macular Oedema Secondary to Branch Retinal VeinOcclusion”,MOJ Clin Med Case–2016,4(1)期:00078)。
羟苯磺酸盐用于口服或注射施用治疗眼睛后段疾病，主要是由于其血管保护作用和血管防护作用。CDO至少对以下作用机制有效：(i)减少视网膜白蛋白渗漏和毛细血管渗透性，从而保护血-视网膜屏障(BRB)；(ii)抑制血小板聚集和血液粘度；(iii)由于一氧化氮合成的增加而上调内皮依赖性舒张；(iv)抑制血管中血管内皮细胞的凋亡；(v)抗氧化和抗自由基活性；(vi)保护抵抗活性氧物质；(vii)防止调节炎症和血管内皮生长因子的ICAM-1的上调；(viii)抗炎作用；或(ix)神经保护。众所周知，酚黄乙胺是一种止血剂(减少出血时间)，其可降低家兔的眼内压并抑制前列腺素的生物合成。
这些作用机理基于羟苯磺酸(所述酸或盐的盐或酯)的性质，如上所述，羟苯磺酸是一种具有高抗氧化性的化合物(主要是因为其首先氧化)。同样由于其会迅速氧化的事实，在先前提到的试验中羟苯磺酸的盐2,5-二羟基苯磺酸二乙胺(酚黄乙胺，Sanofi-Aventis)被注射到玻璃体内。根据现有技术，任何其它局部眼部施用都是不明智的，主要是因为其经局部施用后的极性高、预期吸收低且停留时间受限之故。
根据Simó等(“Mechanisms of retinal neuroprotection of calciumdobesilate:therapeutic implications”Neural Regen Res-2017,12(10)期,1620-1622页)的教导，在任何情况下，本领域技术人员都会建议将羟苯磺酸作为口服药物(全身性)。尽管如此，Simó等也指出，旨在阻断糖尿病性视网膜病变病理所涉及的主要途径的全身性治疗(其中提出了羟苯磺酸)几乎不能以药理学浓度到达视网膜和视神经。
此外，科学上明确认可的是，局部滴眼剂施用仅可用于治疗眼前段疾病，而眼后段的治疗是尚未满足医疗需求的重要治疗靶标(del Amo等，“Current and futureophthalmic drug delivery systems.A shift to the posterior segment”,DrugDiscovery Today-2008,13(3/4)期,135-143页)。
因此，仍然需要用于预防性和治疗性治疗后段眼科疾病的局部眼用组合物的非侵入性替代施用途径，所述组合物能够将治疗有效量的活性成分递送至后段。还需要后段眼科疾病的预防性和治疗性治疗方法。
发明内容
发明人意识到，羟苯磺酸药学上可接受的盐(特别是CDO和酚黄乙胺盐)可在眼表面上局部施用，其能够快速通过眼前段的所有屏障，并到达视网膜和视神经(眼底)。因此，当局部施用时，它们穿过角膜、结膜和巩膜，而且克服了虹膜和晶状体的屏障。这一发现是令人惊讶且出乎意料的，因为高度亲水的分子如CDO显示出较差的角膜渗透性，几乎不能到达眼睛的后房。此外，高水溶性可能涉及活性成分在泪液中的快速溶解或稀释以及快速冲洗和清除，从而降低了眼部局部施用后药物的吸收和生物利用度。出众的是，尽管羟苯磺酸盐具有抗氧化活性和高反应活性，但其在从眼睛表面层到眼内组织如视网膜和/或视神经的扩散途径中并未降解。此外，CDO在眼后段的几个结构中保留的时间足以发挥其作用。
因此，尽管它们由于氧化过程而可能不稳定，并且尽管是高度极性的且可溶于极性溶剂，但是羟苯磺酸和/或其盐(例如CDO和酚黄乙胺)以及所述酸或盐的酯到达眼睛后段，并由于其作为抗血管生成剂的作用等性质而留在那里充当血管保护剂和神经保护剂。
这些发现是高度有利的，因为揭示了在眼睛表面上施用CDO允许有效的施用途径来治疗眼睛后段的疾病，这些疾病是尚未满足医疗需求的重要的治疗靶标。
另外，如在实施例中所示，局部施用的CDO在眼睛后段具有高生物利用度，高于单次口服剂量的生物利用度。这是非常令人惊讶的，因为人们普遍认为由于到达后段要克服若干障碍，眼科局部施用后，药物在玻璃体液和视网膜中的生物利用度很低，因此“局部滴眼液无法将药物有效地递送至视网膜和脉络膜”(Ranta等.,“Barrier analysis ofperiocular drug delivery to the posterior segment”,Journal of ControlledRelease-2010,148卷，42-48页)。或者，如Awwad等，“Principles of Pharmacology in theEye”,British Journal of Pharmacology-2017,174卷，23期，4205-4223页所指出，在到达玻璃体时，以常规局部方式施用的药物被稀释了250,000至1,000,000倍。因此，如果特定药物一旦在局部施用后能够到达玻璃体液，其量在药理学上也是无效的。
同样令人惊讶的是，在局部施用后最多6小时，在眼睛表面(角膜、结膜、前巩膜、虹膜和睫状体)局部施用的低浓度羟苯磺酸盐(例如1％w/v的CDO或酚黄乙胺)可在视网膜和视神经中给予一定量的药物。测定的浓度(1％和10％w/v)低于EP2875811A1和EP2777699B1中公开的针对酚黄乙胺的玻璃体内注射剂提出的浓度(12.5％的2,5-二羟基苯磺酸二乙胺)。
最后，数据还证明局部施用的CDO(100mg/ml)具有良好的耐受性。
因此，本发明的第一方面是用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐或者它们中任一种的酯，其中所述治疗包括在眼前表面上施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们的酯。
羟苯磺酸和/或其任意盐或者它们的酯的效果在于其具有作为血管保护剂、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂、神经保护剂和抗血管生成剂等的作用。因此，它们用于特别是治疗和/或预防与所提及的活动有关的任何眼睛后段疾病。
据发明人所知，这是首次提出通过在眼前表面上局部施用羟苯磺酸或其衍生物(盐，或者所述酸或盐的酯)来治疗或预防眼睛后段疾病。
这种新的治疗方法解决了与全身性给药相关的副作用问题，或当前应用的侵入性IVT注射的问题。
另外，治疗有效剂量范围为0.01mg/天至400mg/天，推定无毒剂量远低于被认为有效的剂量。因此，如上所述，眼部局部施用后药物在玻璃体液和视网膜中的生物利用度非常低，而且尽管不同施用途径之间的有效量无法比较，但如果希望将与玻璃体内注射相同的量的药物/天递送至后段，则任何局部用组合物相对于玻璃体内注射的组合物应包含至少250,000倍/天。这将使局部眼用药物组合物高度浓缩并对其他眼睛结构(例如眼睛前段的那些结构)有危险(即有毒)。
此第一方面可表达为羟苯磺酸和药学上可接受的盐或者所述盐或酸中任一种的酯(特别是以下盐：羟苯磺酸钙或酚黄乙胺(2,5-二羟基苯磺酸二乙胺))用于制造治疗和/或预防眼睛后段疾病的药物的用途，其中所述治疗包括在眼睛表面上施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者它们中任一种的酯。本发明还涉及治疗和/或预防眼睛后段疾病的方法，其包括在有需要的受试对象(包括人)眼睛表面(角膜、结膜、前巩膜、虹膜和睫状体)上局部施用治疗有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们的酯以及药学上局部可接受的赋形剂和/或载剂，其中所述治疗包括施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者它们的酯。
本发明的局部治疗和/或预防意指在眼睛表面(即，在角膜、前巩膜和前段的其它组织例如虹膜和睫状体或结膜穹窿中)上施用。这是因为，当局部施用到眼睛时，羟苯磺酸和/或盐或它们的酯事实上可到达视网膜和视神经以及眼睛后段的其他组织。这适用于本发明中公开的任意实施方式或实施方式的组合，以及包含所述羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者它们的酯的任意组合物。
本发明的第二方面是用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的药物局部眼用组合物，其包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或所述盐的酯，以及一种或多种药学上可接受的局部赋形剂和/或载剂；其中所述治疗包括施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者它们的酯。
开发了包含羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐(例如CDO或酚黄乙胺)的特定的局部眼用药物组合物，从而使得一旦其被施用在眼睛表面上则允许所述酸或药学上可接受的盐或它们的酯以有效的量到达视网膜和视神经。也到达了眼睛后段的其它结构(例如脉络膜、后巩膜、玻璃体液等)。
因此，本发明的第三方面是药物局部眼用组合物，其包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐的酯，以及一种或多种药学上可接受的局部眼用赋形剂和/或载剂，所述组合物配制用于将羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯释放2至30天。
持续释放活性成分的这些药物局部眼用组合物暗含以下优点，为在靶组织中获得有效量和所需时长的施用次数得以减少。
附图说明
图1是条形图，其显示了非糖尿病大鼠(对照)、通过链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠和通过用10mg/ml CDO处理的链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的视网膜匀浆中的氧化谷胱甘肽(GSSG)的浓度；局部滴注10μl/眼。
图2是条形图，其显示了非糖尿病大鼠(对照)、通过链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠和通过用10mg/ml CDO处理的链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的视网膜中的炎性细胞因子TNF-α的相对mRNA水平；局部滴注10μl/眼。相对于对照的倍数增量意指相对于对照的增加。
图3是HET-CAM眼刺激试验的照片。施加NaCl 0.9％(阴性对照)、NaOH 0.1％(阳性对照)、CDO(100mg/ml)、酚黄乙胺(100mg/ml)和羟苯磺酸钾(100mg/ml)后评估卵绒膜尿囊膜(CAM)中的裂解、出血或凝结过程。
具体实施方式
除非另有说明，否则本申请中在此使用的所有术语应以本领域已知的普通含义来理解。在本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下文所述，并且应当统一适用于整个说明书和权利要求书，除非另外明确阐释的定义提供了更宽的定义。
对于“视网膜和/或脉络膜病症”，应理解为影响视网膜和/或脉络膜的任何疾病或病症。在该定义下，包括具有不同结果和症状的疾病和病症。作为非限制性列表，实例包括视网膜血管病变、黄斑病变、遗传性眼底营养不良、特发性脉络膜视网膜病变、中央浆液性视网膜病变、泛发性脉络膜营养不良及其组合。在脉络膜病症的特定情况下，它们是指影响脉络膜的疾病，脉络膜是眼睛的血管层，含有结缔组织，位于视网膜和巩膜之间。具体疾病包括：炎性脉络膜视网膜炎，或仅脉络膜发炎的脉络膜炎；后葡萄膜炎，即葡萄膜的炎症，葡萄膜是位于内视网膜与由巩膜和角膜组成的外纤维层之间的色素层；和一般性脉络膜营养不良，包括无脉络膜症和脉络膜萎缩。
视网膜“血管病变”(涉及直接或间接冲洗视网膜的血管的病症)的具体实例包括公知的糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视盘病变、非糖尿病性视网膜病变(包括作为主要病症的由葡萄膜炎或视网膜血管疾病引起的黄斑水肿)、眼部缺血综合征、高血压性视网膜病变、地中海贫血性视网膜病变、Coats综合征、Eales综合征、放射性视网膜病变、日光性视网膜病变、远达性视网膜病变、息肉样脉络膜血管病变(PCV)、视网膜大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、白血病性视网膜病变、视网膜缺血(特别是由于视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞和早产儿视网膜病变)和慢性视网膜疾病(例如急性视网膜坏死综合征和Birdshot视网膜病变)。其中，“糖尿病性视网膜病变(DR)”是工作年龄成人失明的主要原因。在高达90％的长期胰岛素依赖型糖尿病患者(超过10年)中观察到了这一现象。最初，糖尿病患者常见的高血糖水平导致眼睛中糖基化蛋白质和生长因子水平的升高。如果不进行预防性治疗，这种称为“糖尿病前期视网膜病变阶段”的疾病可能导致视网膜病变。非增殖性或早期糖尿病性视网膜病，也称为“背景性糖尿病性视网膜病”，其特征在于眼底膜增厚、视网膜周细胞丢失、微血管异常、视网膜内微动脉瘤、视网膜出血(称为“斑点印迹”或“棉绒”斑点)、视网膜水肿、毛细血管闭合以及软和硬的渗出物。晚期或增殖性糖尿病性视网膜病变的特征在于新血管形成和纤维血管生长，即涉及神经胶质和纤维性元素的瘢痕形成，其来自视网膜或视网膜内表面或玻璃体腔的视神经。在本发明的意义上，DR包括非增殖性或早期糖尿病性视网膜病变，以及晚期或增殖性糖尿病性视网膜病变。另外，被称为糖尿病性黄斑水肿或糖尿病性黄斑病变和眼底糖尿病性视网膜病变的病症也涵盖在糖尿病性视网膜病变的含义中。
“黄斑病”(黄斑的病理状况，黄斑是视网膜中央区域，与高度敏感的、准确的视力有关)的具体实例包括老年性黄斑变性(ARMD)、出血性ARMD、视网膜血管瘤增生、息肉性脉络膜血管病变、常染色体显性放射状玻璃膜疣(malattia leventinese)、全层黄斑裂孔、黄斑前膜、黄斑毛细血管扩张、玻璃纸黄斑病变或黄斑皱褶、近视性黄斑病变、视网膜静脉血栓形成后的渗出性黄斑病变、急性黄斑神经视网膜病变、黄斑囊样黄斑水肿(macularcystoid macular edema)、视网膜血管样条纹、脉络膜褶和低眼压性黄斑病变等。“老年性黄斑变性(AMD或ARMD)”也称为“黄斑变性”，是一种可能导致视野中心模糊或无视力的医疗状况。早期通常没有任何症状。但是，随着时间的流逝，有些人的视力逐渐恶化，可能会影响一只或两只眼睛。虽然其不会导致完全失明，但失去中央视力可能会使人难以识别面部、驾驶、阅读或进行其他日常活动。有一种萎缩的形式(也称为干性AMD)，其中早期迹象包括在RPE和布鲁赫膜之间积累了称为玻璃疣的物质，这会削弱氧气从脉络膜循环中的扩散。晚期疾病的特征是RPE和感光细胞的死亡通常发生在周围视网膜的局部区域(地图样萎缩)，以及布鲁赫膜的改变阻止RPE细胞的增殖和重新附着。另一方面，存在湿性形式(湿性AMD)，其特征在于通常是两只眼睛都失去中央视力，这是由于视网膜色素上皮细胞(RPE)受损以及脉络膜毛细血管的未成熟血管侵入无血管外视网膜所致。侵入涉及构成血视网膜屏障的RPE细胞层的破坏。当侵入涉及黄斑时，患者会出现严重的视力受损。ARMD中新血管形成的自然过程是在黄斑上形成盘状疤痕和不可逆的失明。当在本发明中提及AMD时，其涵盖干性和湿性AMD的任何形式。
“遗传性眼底营养不良”涉及遗传性疾病，其包括：视网膜色素变性；非典型性视网膜色素变性，包括但不限于尤希尔氏综合征、白点状视网膜炎、Leber先天性黑蒙；视锥细胞营养不良；杆体营养不良；Bietti边缘结晶状角膜营养不良；少年性黄斑营养不良；所有类型的黄斑营养不良；斯特格氏病或眼底黄色斑点症；和尤希尔氏综合征。
对于“玻璃体液病症”，应将其理解为玻璃体结构的任何病症或疾病，包括玻璃体(在人和其他脊椎动物的眼球的晶状体与视网膜之间的凝胶填充空间)和玻璃膜。这些病症包括飞蚊症、飞蝇幻视，它们是血液、细胞或炎症的其他副产物进入玻璃体；星状玻璃体病变、黄斑下和玻璃体出血；和玻璃体脱离，其当从视网膜拉开玻璃体时发生；以及遗传性玻璃体视网膜病变，包括但不限于视网膜劈裂症、Stickler综合征或Wagner综合征。
“视神经病症”涉及许多原因引起的视神经病变，但会导致使视觉信息从视网膜递送到大脑的功能屏障。在这些病症中包括视神经萎缩；视神经炎(脱髓鞘、感染或非感染病因引起的视神经发炎)；神经视网膜炎；缺血性视神经病变(突然失去视神经乳头的血液供应和营养)；遗传性视神经病变(例如Leber遗传性视神经病变)；中毒性弱视或营养性视神经病变、高眼压、原发性青光眼(包括包括原发性开角型青光眼和原发性闭角型青光眼)；继发性青光眼，包括但不限于新生血管性青光眼、炎性青光眼或创伤性青光眼；与青光眼有关的虹膜角膜内皮综合征、视神经乳头玻璃疣或视盘玻璃疣；视乳头水肿；和创伤。此外，还包括由于最终影响视神经的其他眼部疾病(例如青光眼(由于压力也接收到神经而导致视力升高，从而损害视力))造成的损伤。而“青光眼”是以特定的失明模式为特征的一组疾病，其涉及对视神经的损害和视野丧失。眼内压升高是一个危险因素，并且会导致部分但不是全部的青光眼性眼中的视神经萎缩和视网膜细胞死亡。即使未表现出眼内压升高(IOP)，视网膜中也会发生青光眼性细胞死亡。当视神经轴突束与视网膜神经纤维层之间的间隔退化时，会发生视神经损伤。
“后巩膜病症”涉及巩膜炎，其是后眼节区域中的巩膜的炎症。后巩膜炎定义为累及直肌后的巩膜。后巩膜炎虽然很少见，但可表现为浆液性视网膜脱离和/或脉络膜褶。经常有视力丧失以及眼睛运动时疼痛。
在本发明的意义上，“眼睛后段的血管疾病”包括构成眼后段的任何组织和/或结构的任何疾病或正常功能的改变，所述疾病或改变至少部分地是由于向所述眼睛结构供应血液的血管系统受损所致。因此，该术语包括具有多种或不同病因(遗传易感性，创伤，其他代谢性疾病如糖尿病等)的疾病或病症，它们共同具有一种或多种冲洗眼睛的血管功能屏障(例如视网膜白蛋白渗漏和毛细血管渗透性、血小板凝集和血液粘稠度增加，内皮依赖性舒张功能受损等)；细胞的抗氧化和抗自由基活性受损；活性氧物质的存在；炎症和神经损伤。
如本文所用，表述“治疗上有效量”是指当化合物被施用时足以预防所针对的疾病的一种或多种症状或在某种程度上使其减轻的该化合物的量。显然，根据本发明施用的化合物的具体剂量将取决于病例周围的具体情况，包括施用的化合物、施用途径、所治疗的具体病症以及类似的考虑因素。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学和兽医学判断范围内，适合与受试对象(例如人或任何其它动物)的组织接触而无明显毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。从与药物组合物的其他成分相容的意义上讲，各载剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。其必须适合与人和动物的组织或器官接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。合适的载剂、赋形剂等可以在标准药学文献中找到，并且作为实例包括防腐剂、pH调节剂、调节渗透压的张力剂、螯合剂、渗透促进剂、生物粘附性聚合物、稳定剂、增粘剂和抗氧化剂。
术语“药学上可接受的赋形剂和/或载剂”或“药学上可接受的局部眼用赋形剂和/或载剂”(可互换使用)是指适用于制药技术的赋形剂或载剂，用于制备具有局部眼部医疗用途的组合物，即可以在没有明显毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的情况下施用于眼睛表面的赋形剂或载剂，与合理的收益/风险比相称。
术语“重量/体积百分比”是指每100ml组合物中的化合物的重量(以克为单位)，例如，在整个组合物与所述组合物中的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者其酯之间。其在说明书中以％w/v表示，或仅表示为％。
术语“pH”定义为适宜的、经正确标准化的电位计传感器和测量系统给出的值。传统上将测量系统称为“pH计”。组合物的pH通过药典的传统方法测量。
如上所述，本发明的第一方面涉及用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐的酯，其中所述治疗包括在眼睛表面上施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐或它们的酯。
在一个具体实施方式中，羟苯磺酸的药学上可接受的盐选自羟苯磺酸的碱金属盐、羟苯磺酸的碱土金属盐、羟苯磺酸与式(II)的胺的盐及其组合
其中，R1、R2和R3独立地选自H和/或-(C1-C8)-烷基。
在整个说明书和权利要求书中，术语“-(C1-C8)-烷基”应被理解为是直链或支化的。其包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基(或1-甲基丙基)、异丁基(或2-甲基丙基)、叔丁基(或1,1-二甲基乙基)、正戊基、叔戊基(或2-甲基丁-2-基)、新戊基(或2,2-二甲基丙基)、异戊基(或3-甲基丁基)、仲戊基(或戊-2-基)、3-戊基(或戊3-基)、正己基、异己基(或4-甲基戊基)、叔己基、仲己基、正庚基、叔庚基、异庚基、仲庚基、正辛基、叔辛基、仲辛基和异辛基中的任一种。
在一个具体实施方式中，用于眼部治疗的化合物是羟苯磺酸的药学上可接受的盐，其选自羟苯磺酸的碱金属盐、羟苯磺酸的碱土金属盐及其组合。更具体的是羟苯磺酸的碱土金属盐。还更具体地，其为羟苯磺酸的钙盐，也称为羟苯磺酸钙。更具体地是CDO(羟苯磺酸钙一水合物)。因此，在随后的具体实施方式中，本发明涉及用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的羟苯磺酸钙或其水合物(例如一水合CDO)。羟苯磺酸的其他药学上可接受的盐包括镁盐、钾盐和钠盐。
羟苯磺酸的盐可以是游离溶剂化物或溶剂化物(例如水合物)的结晶形式，这两种形式均应当落在本发明的范围内。溶剂化方法是本领域公知的。如上所述，特定的溶剂化物包括水合盐，更具体是羟苯磺酸的一水合盐和二水合盐，以及所述盐的酯。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，羟苯磺酸的药学上可接受的盐是羟苯磺酸与式(II)的胺的盐，其中R1和R2相同且均为乙基，并且是R3是H。这种羟苯磺酸的盐也被称为酚黄乙胺或2,5-二羟基苯磺酸二乙胺。在另一个具体实施方式中，酚黄乙胺为无水形式。在另一个具体的实施方式中，酚黄乙胺为水合物形式，更具体地选自酚黄乙胺一水合物和酚黄乙胺二水合物。
“羟苯磺酸的酯或羟苯磺酸盐的酯”是指由药学上可接受的无毒有机酸形成的药学上可接受的的酯。对于酯没有限制，除了如果用于治疗目的，则它们必须是药学上可接受的。羟苯磺酸的酯可以由药学上可接受的无毒有机酸制备。这些酸包括乙酸、丁酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、琥珀酸和酒石酸等。酯基的实例包括乙酰基(acetyl)、乙酰基(ethanoyl)、丁酰基、丙酰基、乙酰氧基甲基、甲氧基甲基和琥珀酰基等，以及由本发明的2,5-二羟基苯磺酸化合物的C-2和C-5位处任意碳原子上的羟基与上述有机酸偶合得到的酯基。特别是，羟苯磺酸的酯的实例是2,5-二乙酰基苯磺酸和/或2,5-二乙酰基苯磺酸的盐。酯的其它具体实例是由2,5-二乙酰基苯磺酸的C-2和C-5位处任意碳原子上的羟基与具有通式COOH-(C1-C3)烷基的药学上可接受的无毒有机酸偶合形成的药学上可接受的酯，其中(C1-C3)烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和环丙基。
在一个具体实施方式中，其可选地与上文或下文的任意实施方式或方面组合，羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐或它们的酯用于局部用于治疗眼睛后段疾病，所述眼睛后段疾病选自视网膜和/或脉络膜病症、玻璃体液病症、后巩膜病症、视神经病症及其组合。
如上所述，羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐或它们的酯在视网膜、玻璃体液、脉络膜和视神经中的用途基于这些化合物是血管保护剂、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂、神经保护剂、止血剂和抗血管生成剂等的事实。因此，它们用于影响由于血管问题(例如血管收缩、血管阻塞、内皮依赖性松弛丧失、毛细血管高渗透性等)而受到损伤或功能受损的这些结构的病症，或与上述组织中的应激氧化状况、炎性过程或细胞凋亡有关的损害。
在本发明第一方面的具体实施方式及其上文或下文的任意实施方式的组合中，眼睛后段疾病是选自视网膜血管病变、黄斑病变、遗传性眼底营养不良、特发性脉络膜视网膜病变、中央浆液性视网膜病变、泛发性脉络膜营养不良及其组合的视网膜病症和/或脉络膜病症。
在更具体的实施方式中，视网膜血管病变选自糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视盘病变、非糖尿病性视网膜病变、眼部缺血综合征、高血压性视网膜病变、地中海贫血性视网膜病变、Coats综合征、Eales综合征、放射性视网膜病变、日光性视网膜病变、远达性视网膜病变、息肉样脉络膜血管病变(PCV)、视网膜大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、白血病性视网膜病变、视网膜缺血、慢性视网膜疾病及其组合。更具体地用于糖尿病性视网膜病变，包括增殖性糖尿病性视网膜病变、非增殖性糖尿病性视网膜病变，其都伴有任何伴随病症，特别是糖尿病性黄斑水肿和/或眼底糖尿病性视网膜病变。更具体地，其用于糖尿病性视网膜病变的早期阶段(当神经退行性变开始并产生功能异常时，例如甚至在眼科检查中检测到微血管病变之前的颜色辨别力和对比度敏感性的丧失)。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式及其与上文或下文的任意实施方式的组合中，视网膜和/或脉络膜病症是黄斑病变，其选自老年性黄斑变性(ARMD)，包括干和湿ARMD；出血性ARMD；视网膜血管瘤增生；息肉性脉络膜血管病变；常染色体显性放射状玻璃膜疣(malattia leventinese)；全层黄斑裂孔；黄斑前膜；黄斑毛细血管扩张；玻璃纸黄斑病变或黄斑皱褶；近视性黄斑病变；视网膜静脉血栓形成后的渗出性黄斑病变；急性黄斑神经视网膜病变；黄斑囊样黄斑水肿；视网膜血管样条纹；脉络膜褶、低眼压性黄斑病变及其组合。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中及其与上文或下文的任意实施方式的组合中，视网膜和/或脉络膜病症是遗传性眼底营养不良，其选自由以下组成的组：视网膜色素变性；非典型性视网膜色素变性，包括但不限于尤希尔氏综合征、白点状视网膜炎、Leber先天性黑蒙；视锥细胞营养不良；杆体营养不良；Bietti边缘结晶状角膜营养不良；少年性黄斑营养不良；所有类型的黄斑营养不良；斯特格氏病或眼底黄色斑点症；和尤希尔氏综合征。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中及其与上文或下文的任意实施方式的组合中，羟苯磺酸和/或其药学上可接受的盐或它们的酯用于通过在眼睛表面上施用这些化合物来治疗玻璃体液病症，该玻璃体液病症选自由以下组成的组：黄斑下和玻璃体出血；星状玻璃体病变；玻璃体脱离；飞蚊症或飞蝇幻视；遗传性玻璃体视网膜病变，包括但不限于视网膜劈裂症、Stickler综合征或Wagner综合征，以及所有这些的组合。
本发明第一方面的另一个具体实施方式是羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们中任一种的酯用于眼睛后段疾病的用途，该眼睛后段疾病是选自由以下组成的组的视神经病症：视神经萎缩；视神经炎，包括脱髓鞘、感染或非感染性的视神经炎；神经视网膜炎；缺血性神经病变；遗传性视神经病变(例如Leber遗传性视神经病变)；中毒性弱视或营养性视神经病变；高眼压；原发性青光眼；继发性青光眼，包括但不限于新生血管性青光眼、炎性青光眼或创伤性青光眼；与青光眼有关的虹膜角膜内皮综合征；视神经乳头玻璃疣或视盘玻璃疣；视乳头水肿(或视盘水肿)及其组合。
在更具体的实施方式中，眼睛后段疾病选自视网膜和/或脉络膜病症、视神经病症、巩膜及其组合，因为一旦羟苯磺酸和/或其盐被局部施用于眼睛表面上就会在这些眼睛后段的组织中被大量检测到。
如下文实施例中将描述的，局部施用在家兔或大鼠眼睛表面上的CDO和酚黄乙胺能够到达后巩膜、玻璃体液、脉络膜、视网膜和视神经。因此，本发明的具体实施方式涉及用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的羟苯磺酸钙或酚黄乙胺，该眼睛后段疾病选自脉络膜病症、玻璃体液、视网膜病症、视神经病症及其组合，其中所述治疗包括在眼睛表面上施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们的酯。
CDO以及另一种羟苯磺酸的药学上可接受的盐或酯出乎意料地渗透到眼睛后段，并在那里停留很长时间以发挥其作用。如前文段落中所述，羟苯磺酸钙或者另一种羟苯磺酸的药学上可接受的盐或酯由于其作为血管保护剂的作用而促进了所有这些疾病的预防和/或治疗，特别是通过以下方式：减少视网膜白蛋白渗漏和毛细血管渗透性，其保护血液-视网膜屏障(BRB)；由于一氧化氮合成的增加而上调内皮依赖性舒张；抑制血管中血管内皮细胞的凋亡；抗氧化和抗自由基活性；保护抵抗活性氧(ROS)；抗炎活性、止血或防止ICAM-1和血管内皮生长因子的上调。另外，所有这些生化作用都转化到了对视网膜和视神经中神经元的神经保护中。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们中任一种的酯用于哺乳动物、更特别是人的眼睛后段疾病。
在第一方面的又一个具体实施方式中，羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们中任一种的酯的局部剂量为0.01mg/天至300mg/天，更具体地为0.1mg/天至300mg/天。更具体地为0.1mg/天至100mg/天。在另一个具体实施方式中，其为0.01mg/天至50mg/天。在又一个具体实施方式中，其为0.01mg/天至25mg/天。在另一个实施方式中，其为0.01mg/天至20mg/天。更具体地为0.01mg/天至18mg/天，还更具体地为0.1mg/天至18mg/天。在另一个具体实施方式中，其为0.01mg/天至13mg/天，更具体地为0.1mg/天至13mg/天。
羟苯磺酸或任意药学上可接受的盐以及所述酸或盐中任一种的任意酯可以是不同类型的药物局部眼用组合物的活性成分。因此，在第二方面，本发明还涉及用于治疗和/或预防眼睛后段疾病的药物局部眼用组合物，其包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或所述盐中任一种的酯，以及一种或多种药学上可接受的局部赋形剂和/或载剂；并且其中所述治疗包括施用0.01mg/天至400mg/天的局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们中任一种的酯。
在如上所述使用的药物局部眼用组合物的具体实施方式中，所述组合物包含0.02至20％w/v的重量/体积百分比的羟苯磺酸和/或羟苯磺酸的药学上可接受的盐或者所述酸或盐的酯。更具体地，该重量/体积百分比为0.05％至15％w/v。更具体地，其选自0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％和15％w/v。更具体地，其为0.05％至10％w/v。在更具体的实施方式中，羟苯磺酸和/或羟苯磺酸的药学上可接受的盐或者所述酸或盐的酯的百分比为11％至20％w/v。
在具体实施方式中，如上所述使用的组合物包含羟苯磺酸的药学上可接受的盐，更具体地是羟苯磺酸的碱金属或碱土金属盐。还更具体地，其包含羟苯磺酸钙。更具体地是CDO(羟苯磺酸钙一水合物)。羟苯磺酸的其他药学上可接受的盐包括镁盐、钾盐和钠盐。
在本发明第二方面的另一个具体实施方式中，羟苯磺酸的药学上可接受的盐是羟苯磺酸与式(II)的胺的盐，其中R1和R2相同且为乙基，并且R3是H。这种羟苯磺酸的盐也被称为酚黄乙胺或2,5-二羟基苯磺酸二乙胺。酚黄乙胺的水合盐也涵盖在内。
在另一个具体实施方式中，如上所述使用的药物局部眼用组合物经配制用于通过在眼睛表面上局部施用而提供0.01mg/天至400mg/天的剂量。递送有效成分的能力可以通过伴随它的赋形剂和/或载剂来调节。赋形剂必须选自不会降解活性成分的赋形剂，以便将可局部眼上施用的药物组合物制备来用于本发明的预期用途。合适的载剂、赋形剂等可以在标准药物文献中找到，并且作为实例包括防腐剂、pH调节剂、调节渗透压的张力剂、螯合剂、渗透促进剂、表面活性剂(tensioactive)、生物粘附性聚合物、稳定剂、增粘剂和抗氧化剂。
在又一个具体实施方式中，如上公开使用的药物局部眼用组合物包含抗氧化剂化合物。
抗氧化剂化合物选自由以下组成的组：丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚、叔丁基对苯二酚、硫代丙酸二月桂酯、乙氧喹、没食子酸丙酯、2,4,5-三羟基丁苯酮、硫代二丙酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、亚硫酸氢钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、碘化钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、琥珀酸钠六水合物、亚硫酸钠、酒石酸钠、硫代硫酸钠、山梨酸、柠檬酸三钠二水合物及其混合物。
根据本发明使用的药物组合物的局部眼用剂型是适于使活性成分稳定并局部施用于眼睛(角膜、结膜、前巩膜、虹膜或睫状体)表面的那些剂型。在具体实施方式中，用于通过局部施用羟苯磺酸或其盐中任一种(或它们中任一种的酯)来治疗眼睛后段疾病的组合物的形式选自由以下组成的组：溶液、胶束溶液、凝胶、乳液、软膏、脂质体、悬浮液、乳剂、纳米乳剂、微乳剂和乳膏。
为了使这种组合物易于由患者施用，并且还为了在施用该组合物时尽可能地避免干扰视力，因此根据本发明使用的组合物在具体实施方式中为滴眼剂溶液的形式。还更具体地为滴眼剂透明溶液。
如下文实施例中描述的，以滴眼剂液体溶液施用的CDO和酚黄乙胺能够穿过角膜、巩膜和/或结膜，避免被眼泪洗掉，并最终到达视网膜和视神经，在其中可以发现大量的药物。这具有很大的相关性，因为即使使用简单的药物组合物(清澈透明并因此保持视力)，活性成分也可以到达靶组织。
实际上，如下文所示，包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或其另一种盐以及所述酸或盐的酯、pH调节剂、可选的抗氧化剂化合物和水(均经适当灭菌(例如通过UV手段或灭菌过滤))的液体药物组合物可用于治疗和/或预防眼睛后段疾病，其中所述治疗包括施用局部剂量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐的酯。
在另一个具体实施方式及其可选的与上文或下文的任意实施方式的组合中，通过在眼睛表面上局部施用一定剂量的活性成分而用于治疗眼睛后段疾病的组合物还包含赋形剂，所述赋形剂选自防腐剂、pH调节剂、调节渗透压的张力剂、螯合剂、渗透促进剂、生物粘附性聚合物、稳定剂、增粘剂、表面活性剂、抗氧化剂及其混合物。
用作pH调节剂的赋形剂是能使pH为3.8至8.6、更具体为4.5至8.0、还更具体为4.8至7.5、优选为5.0至7.3、还更具体为5.5至6.9的那些赋形剂。pH调节剂的实例包括柠檬酸盐(柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂)、磷酸盐(磷酸/磷酸盐缓冲剂)、硼酸盐(硼酸/硼酸盐缓冲剂)及其混合物，所有盐都是药学上可接受的。pH缓冲剂可额外包含氨基酸(特别是精氨酸、赖氨酸)和胺衍生的化合物(选自甲基葡糖胺和氨丁三醇)以及其混合物。
因此，在本发明第二方面的具体实施方式中，如上公开使用的药物局部组合物的pH为3.8至8.6，更具体为4.5至8.0，还更具体为4.8至7.5，优选为5.0至7.3，还更具体为5.5至6.9。
术语“pH调节剂”是指可用于将成品的pH调节至所需水平而不影响组合物的稳定性的酸或碱或它们的混合物。在一个实施方式中，根据本发明使用的组合物还包含pH调节剂，其选自由以下组成的组：乳酸及其盐(例如乳酸钠、乳酸钾和乳酸钙)、柠檬酸及其盐(例如柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、柠檬酸锂、柠檬酸三钠和柠檬酸氢二钠)、酒石酸及其盐(例如酒石酸钠、酒石酸钾、酒石酸钙和酒石酸锂)、乙酸及其盐(例如乙酸钠、乙酸钾和乙酸钙)、盐酸、硼酸及其盐(硼酸钠)、硫酸及其盐(例如硫酸钠和硫酸钾)、硝酸、盐酸、磷酸及其盐(例如磷酸二氢钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、磷酸锂、磷酸钾和磷酸钙)、碳酸及其盐(例如碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢钾)、马来酸及其盐(马来酸锂、马来酸钠、马来酸钾和马来酸钙)、琥珀酸及其盐(琥珀酸锂、琥珀酸钠、琥珀酸钾和琥珀酸钙)、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺、二异丙醇胺、氨、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐及其混合物。在一个实施方式中，pH调节剂选自由三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠及其混合物组成的组。
在另一个实施方式中，组合物包含选自由以下组成的组的pH调节剂：乙酸、硼酸、山梨酸、柠檬酸、磷酸、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾及其盐、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、碳酸氢钠、硼酸钠、乙酸钠、亚硫酸氢钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠及其混合物。
在具体实施方式中，根据本发明使用的局部眼睛(眼用)组合物中的其它成分包括表面活性剂、溶剂(有机和无机溶剂；即，水)、粘性剂(也称为增粘剂)、张力剂、粘膜粘附性聚合物、螯合剂和有效成分(即羟苯磺酸和/或其盐或酯)的增强剂。
在表面活性剂中，非离子表面活性剂包括但不限于(C30-C40)烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的嵌段共聚物(商业上称为泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、(C8-C14)烷基聚葡糖苷(包括辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(包括鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、脱水山梨醇酯及其衍生物，或者山梨醇酯乙氧基化物及其衍生物。
具体地，粘性剂为聚乙烯醇、来源于纤维素的化合物(例如甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素)、卡波姆、聚乙烯醇、多元醇、壳聚糖、透明质酸及其混合物。
适合于本发明的防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、西他氯铵、氯化苄索铵、洗必泰、苄醇、氯丁醇、2-苯基乙醇、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙酸苯汞、硼酸苯汞、脱氢乙酸钠、山梨酸硝酸苯汞、十六烷基氯化吡啶鎓、西曲溴铵、苄溴、过硼酸钠、硫柳汞及其混合物。
张力剂选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠、碳酸钙、乳酸钠、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、葡萄糖、聚乙二醇、丙二醇、右旋糖酐及其混合物；优选甘油。
增强吸收的试剂也称为活性成分的“增强剂”，其是表面活性剂，例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯20脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯20脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯5脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯20脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯9月桂基醚、聚氧乙烯23月桂基醚、聚氧乙烯20十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚乙二醇十八烷基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、棕榈酰肉碱、癸酸钠、硬脂胺、十二烷基硫酸钠、胆汁酸(例如脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸和牛磺去氧胆酸)、脂肪酸(例如癸酸、辛酸和油酸)、月桂基氯化铵、苯扎氯铵、西他氯铵，西曲溴铵、二葡萄糖洗必泰、苄醇、氯丁醇、2-苯基乙醇、对羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯、EDTA、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(Azone)、六亚甲基月桂酰胺、六亚甲基辛酰胺、癸基甲基亚砜、皂苷、环糊精、pz肽、α-氨基酸、十六烷基氯化吡啶鎓、细胞松弛素、离子载体或其混合物。
粘膜粘附性聚合物也称为“生物粘附性聚合物”，是指可以增加本发明组合物的停留时间的物质。适合于本发明的生物粘附性聚合物的实例包括：聚乙烯基吡咯烷酮，例如聚维酮K17、聚维酮K 25、聚维酮K 30和聚维酮K 90F；聚乙烯醇；黄原胶；瓜尔胶；韦兰胶；结冷胶；黄蓍胶；角豆胶；琼脂；甲基纤维素；乙基纤维素；羟乙基纤维素；羟乙基甲基纤维素；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；羧甲基纤维素钠；羧甲基纤维素钙；聚乙二醇；甘油；角叉菜胶；海藻酸；海藻酸钠；海藻酸钾；海藻酸丙二醇酯；透明质酸；透明质酸钠；聚(丙烯酸)衍生物，例如卡波姆和聚卡波醇(polycarbol)；泊洛沙姆；壳聚糖和壳聚糖衍生物；乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物；麦芽糊精；聚己内酯；以及它们的混合物。
术语“螯合试剂(chelating agent)”和“螯合剂(chelant)”具有相同含义并且可互换地使用。它们是指能够络合离子的化合物。螯合剂的实例是柠檬酸(特别是柠檬酸一水合物)、EDTA(乙二胺四乙酸)及其盐(例如EDTA二钾、EDTA二钠、EDTA钙二钠、EDTA钠和EDTA三钠)、富马酸、苹果酸和麦芽酚。在一个实施方式中，螯合剂选自由依地酸钠、柠檬酸以及其盐和混合物组成的组。
本发明的局部眼用组合物可以根据现有技术中公知的方法来制备。合适的赋形剂和/或载剂以及任何pH调节剂及其量可以由本领域技术人员根据所制备的制剂类型容易地确定。
在如上公开使用的药物局部眼用组合物的具体实施方式中，所述组合物用于立即释放羟苯磺酸和/或药物上可接受的盐或者它们中任一种的酯。这些类型的制剂可使活性成分快速释放，以便快速作用于其最终到达的眼睛后段的不同组织。
在备选的另一个实施方式中，如上定义使用的药物局部眼用组合物是用于控制活性成分随时间释放的组合物，也称为缓释(modified-release)组合物或剂型。具体地，其用于在2至30天中释放活性成分。这些组合物可以减少施用时间，并有助于更简单的剂量方案。在一段时间内释放活性成分的这些非立即释放组合物的实例包括持续释放组合物和延长释放组合物。持续释放剂型是设计成以预定速率释放(放出)药物的剂型，以便在特定时间段内保持恒定的药物浓度且副作用最小。这可以通过多种制剂来实现，包括药物-聚合物缀合物。延长释放组合物是其中药物在一段时间内递送(通常以恒定速率持续释放)或递送至体内的特定靶标(靶向释放剂量)的组合物。
对于“释放2至30天”，应理解当涉及本发明的任意方面或实施方式时，羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或所述盐中任一种的酯的释放以如下方式实现：从施用日起至对于该制剂指定的任何一天(例如2、5、10、20或30)，至少释放了制剂中85％的活性成分。也就是，配制用于释放2天活性成分的药物局部眼用组合物意味着在第2天时已释放了活性成分的至少85％，更具体为90％，还更具体为100％。同样地，释放30天意味着在第30天时已释放了活性成分的至少85％，更具体为90％，还更具体为100％。局部眼用组合物领域的技术人员将知道用于确定活性成分的释放百分比的标准方案。
在本发明第二方面的另一个具体实施方式中，如上公开施用的药物局部眼用组合物经配制用于一个月一次地施用至受试对象，特别是哺乳动物，更特别是人。
在更具体的实施方式中，配制用于缓释施用的药物局部眼用组合物包含1mg至700mg的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者它们中任一种的酯。
在本发明第二方面的另一个具体实施方式中，如上公开使用的药物局部眼用组合物经配制用于每2、4、6、8、12或24小时一次地施用至受试对象，特别是哺乳动物，更特别是人。该具体实施方式更常见为液体组合物、悬浮液或溶液(例如滴眼剂溶液)形式的用于所提出用途的局部眼用组合物，其中常见的剂量方案包括以预定的时间间隔施用一滴到几滴(例如每6小时两滴滴眼剂)。
如对于活性成分所述的，如上公开使用的药物局部眼用组合物用于预防和/或治疗选自视网膜病症、玻璃体液病症、脉络膜病症、视神经病症、后巩膜病症、视神经病症及其组合的疾病。
实际上，包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯的药物局部组合物用于其中后段的任何组织的血管系统都受损的眼睛后段疾病。特别是视网膜中的血管系统(衍生自视网膜中央动脉，也是眼动脉的一个分支，但与视神经一起行进)和称为葡萄膜循环的血管系统(包括睫状体和虹膜，脉络膜)。
在具体实施方式中，当提及羟苯磺酸和/或盐或者它们的酯时，药物局部组合物根据本发明用于治疗和/或预防上面列出的疾病。
在第三方面，本发明涉及一种药物局部眼用组合物，其包含治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯，以及一种或多种药学上可接受的局部眼用赋形剂和/或载剂，其中所述组合物配制用于将羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或所述盐中任一种的酯释放2至30天。
第三方面的这些药物局部眼用组合物是选自持续释放组合物和延长释放组合物的缓释组合物。
在此第三方面的具体实施方式中，该组合物包含1mg至700mg的治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯。在又一个更具体的实施方式中，该组合物包含10mg至500mg的治疗上有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯，并且其配制用于将羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯释放30天。
在本发明的此第三方面的组合物的又一个具体实施方式中，其包含羟苯磺酸的药学上可接受的盐，更具体地是羟苯磺酸的碱金属或碱土金属盐。还更具体地，其包含羟苯磺酸钙。更具体地是CDO(羟苯磺酸钙一水合物)。在另一个具体实施方式中，羟苯磺酸的其他药学上可接受的盐选自镁盐、钾盐、钠盐及其混合物。
在本发明第三方面的另一个具体实施方式中，羟苯磺酸的药学上可接受的盐是羟苯磺酸与式(II)的胺的盐，其中R1和R2相同且为乙基，且R3是H。这种羟苯磺酸的盐也被称为酚黄乙胺或2,5-二羟基苯磺酸二乙胺。酚黄乙胺的水合盐也用作第三方面的局部眼用组合物中的成分。
在本发明的第三方面的另一个具体实施方式中，该组合物还包含赋形剂，所述赋形剂选自防腐剂、pH调节剂、调节渗透压的张力剂、螯合剂、渗透促进剂、生物粘附性聚合物、稳定剂、增粘剂、表面活性剂、抗氧化剂及其混合物。在上文提到根据本发明第二方面使用的组合物时所公开和列出的具体赋形剂和/或载剂也是适用于本发明第三方面的药物局部眼用组合物的赋形剂和/或载剂。
在本发明第三方面的更具体的实施方式中，药物局部眼用组合物的pH为3.8至8.6，更具体为4.5至8.0，还更具体为4.8至7.5，优选为5.0至7.3，还更具体为5.5至6.9。此pH通过合适的pH调节剂实现，在具体实施方式中，所述pH调节剂选自由以下组成的组：乙酸、硼酸、山梨酸、柠檬酸、磷酸、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾及其盐、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、碳酸氢钠、硼酸钠、乙酸钠、亚硫酸氢钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠及其混合物。
在本发明第三方面的又一个具体实施方式中，可选地与上述或下述的任意实施方式组合，所述组合物还包含螯合剂，特别是选自由以下组成的组：柠檬酸(特别是柠檬酸一水合物)、EDTA及其盐(例如EDTA二钾、EDTA二钠、EDTA钙二钠、EDTA钠和EDTA三钠)、富马酸、苹果酸和麦芽酚。在一个实施方式中，螯合剂选自由依地酸钠、柠檬酸以及其盐和混合物组成的组。
在本发明第三方面的又一个具体实施方式及其可选地与上文或下文的任意实施方式的组合中，所述组合物还包含有效量的生物粘附性聚合物。在具体实施方式中，生物粘附性聚合物选自由以下组成的组：聚乙烯基吡咯烷酮，例如聚维酮K 17、聚维酮K 25、聚维酮K 30和聚维酮K 90F；聚乙烯醇；黄原胶；瓜尔胶；韦兰胶；结冷胶；黄蓍胶；角豆胶；琼脂；甲基纤维素；乙基纤维素；羟乙基纤维素；羟乙基甲基纤维素；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；羧甲基纤维素钠；羧甲基纤维素钙；聚乙二醇；甘油；角叉菜胶；海藻酸；海藻酸钠；海藻酸钾；海藻酸丙二醇酯；透明质酸；透明质酸钠；聚(丙烯酸)衍生物，例如卡波姆和聚卡波醇；泊洛沙姆；壳聚糖和壳聚糖衍生物；乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物；麦芽糊精；聚己内酯；以及它们的混合物。
在又一个具体实施方式中，本发明第三方面的药物局部眼用组合物还包含有效量的抗氧化剂，特别是选自由以下组成的组的抗氧化剂：丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚、叔丁基对苯二酚、硫代丙酸二月桂酯、乙氧喹、没食子酸丙酯、2,4,5-三羟基丁苯酮、硫代二丙酸、α-生育酚、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、抗坏血酸钠、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、碘化钠、琥珀酸钠六水合物、亚硫酸钠、酒石酸钠、硫代硫酸钠、山梨酸、柠檬酸三钠二水合物及其混合物。
可选地，本发明第三方面的组合物包含药学上可接受的递送系统，该药学上可接受的递送系统是一种化合物或化合物的混合物，其保持组合物中羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或它们的酯的活性形式，并允许羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯释放从而以活性形式和有效的量到达眼睛后段。
这些递送系统的实例包括使活性成分稳定和/或增加在靶组织中的停留时间并减少被血-视网膜屏障清除的化合物。
本发明的其它药物局部眼用组合物包括：
-治疗有效量的羟苯磺酸和/或药学上可接受的盐或者所述酸或盐中任一种的酯；和
-一种或多种药学上可接受的局部眼用赋形剂和/或载剂，所述赋形剂和/或载剂包含pH调节剂。
具有pH调节剂的组合物的具体实施方式包括在该试剂范畴内的选自以上针对本发明第二方面所提出的列表的化合物。在更具体的实施方式中，局部眼用组合物包含pH调节剂，其选自由以下组成的组：乙酸、硼酸、山梨酸、柠檬酸、磷酸、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾及其盐、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、碳酸氢钠、硼酸钠、乙酸钠、亚硫酸氢钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠及其混合物。
在包含pH调节剂的这些组合物的更具体的实施方式中，它们还包含螯合剂。具体的螯合剂是针对本发明第二方面列出的那些。更具体地，其选自由以下组成的组：柠檬酸(特别是柠檬酸一水合物)、EDTA及其盐(例如EDTA二钾、EDTA二钠、EDTA钙二钠、EDTA钠和EDTA三钠)、富马酸、苹果酸和麦芽酚。在一个实施方式中，螯合剂选自由依地酸钠、柠檬酸以及其盐和混合物组成的组。
在另一个具体实施方式中，包含pH调节剂的这些组合物还包含有效量的生物粘附性聚合物。在具体实施方式中，生物粘附性聚合物选自由以下组成的组：聚乙烯基吡咯烷酮，例如聚维酮K17、聚维酮K 25、聚维酮K 30和聚维酮K 90F；聚乙烯醇；黄原胶；瓜尔胶；韦兰胶；结冷胶；黄蓍胶；角豆胶；琼脂；甲基纤维素；乙基纤维素；羟乙基纤维素；羟乙基甲基纤维素；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；羧甲基纤维素钠；羧甲基纤维素钙；聚乙二醇；甘油；角叉菜胶；海藻酸；海藻酸钠；海藻酸钾；海藻酸丙二醇酯；透明质酸；透明质酸钠；聚(丙烯酸)衍生物，例如卡波姆和聚卡波醇；泊洛沙姆；壳聚糖和壳聚糖衍生物；乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物；麦芽糊精；聚己内酯；以及它们的混合物。
在又一个具体实施方式中，具有本发明的pH调节剂的药物局部眼用组合物还包含有效量的抗氧化剂，特别是选自由以下组成的组的抗氧化剂：丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚、叔丁基对苯二酚、硫代丙酸二月桂酯、乙氧喹、没食子酸丙酯、2,4,5-三羟基丁苯酮、硫代二丙酸、α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸钠、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、碘化钠、琥珀酸钠六水合物、亚硫酸钠、酒石酸钠、硫代硫酸钠、山梨酸、柠檬酸三钠二水合物及其混合物。
如对于第三方面的组合物所述的，在另一个实施方式中，包含pH调节剂的药物局部眼用组合物还包含对于本发明第三方面的组合物定义的药学上可接受的递送系统。
本发明还涉及羟苯磺酸的碱金属和碱土金属盐(即羟苯磺酸钙、羟苯磺酸钾、羟苯磺酸钠、羟苯磺酸镁)，其直接或在药物组合物中用于治疗和/或预防眼睛后段疾病。特别是用于治疗和/或预防选自视网膜和/或脉络膜病症、玻璃体液病症、视神经病症、后巩膜病症及其组合的眼睛后段疾病，其中所述治疗包括在眼睛表面上使用局部剂量的羟苯磺酸的碱金属和碱土金属盐或酯。具体地，其用于治疗和/或预防对于上述任意类别列出的任何疾病。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的变体并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。此外，词语“包括”涵盖“由……组成”的情况。通过阅读说明书，本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员将变得显而易见，或者可以通过实施本发明而获悉。通过举例的方式提供以下实施例，它们不意图限制本发明。此外，本发明涵盖本文描述的特定和优选实施例的所有可能的组合。
实施例
实施例1.组合物
在合适的容器中称取适量的CDO或酚黄乙胺，并加入表1提及的蒸馏水。
在缓慢搅拌下将CDO或酚黄乙胺溶解在水中。
表1
q.s.加至足量
实施例2.大鼠和家兔中CDO的眼部分布(局部眼用与口服单剂量施用)
方法
在大鼠和家兔动物模型中确定CDO的眼部分布以比较口服施用和眼滴注后的生物利用度。
大鼠中CDO的眼部分布(局部眼部与口服施用)
在重约200g的Sprague Dawley(SD)大鼠中通过局部滴眼(10μl/眼)以10mg/ml(实施例1的组合物2)、100mg/ml(实施例1的组合物5)或通过口服饲管以50mg/kg、200mg/kg或750mg/kg的水溶液(分别为实施例1的组合物1、3和4)施用CDO。施用后15、60、180和360分钟，对动物实施安乐死，并收集血浆和眼组织(包括巩膜、角膜、视网膜、玻璃体液/晶状体和视神经)。
基于人体当量剂量(HED)计算，大鼠中的50mg/kg(10mg)口服剂量相当于人体中的1个500mg胶囊200mg/kg(40mg)相当于4个500mg胶囊 剂量，且750mg/kg(150mg)相当于15个500mg胶囊(Guidance for Industry Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers,U.S.Department of Health and Human Services Food andDrug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)July2005,Pharmacology and Toxicology)。
500mg CDO(人体重量60kg)＝8.3mg CDO/kg人
HED(大鼠/人)＝6.2
8.3×6.2＝51.5mg/kg大鼠(大鼠重量0.2kg)＝10mg(大鼠中的剂量当量)
家兔中CDO的眼部分布(局部眼部与口服施用)
在重量约1.8kg的新西兰白兔中通过局部滴眼(33μl/眼)以10mg/ml(实施例1的组合物2)、100mg/ml(实施例1的组合物5)或通过口服饲管以25mg/kg的水溶液(实施例1的组合物1)施用CDO。施用后15、60、180和360分钟，对动物实施安乐死，并收集血浆和眼组织(包括视网膜/脉络膜和视神经)。
基于HED计算，家兔中的25mg/kg(45mg)口服剂量对应于人体中的1个500mg胶囊
500mg CDO(人重量60kg)＝8.3mg CDO/kg人
HED(家兔/人)＝3.1
8.3×3.1＝25.7mg/kg家兔(家兔重量1.75kg)＝45mg(家兔中的剂量当量)
分析条件
根据基质的类型进行CDO的生物分析。在血浆的情况下，使用甲醇沉淀蛋白质。对于组织，将样品在使用锆珠和作为溶剂的甲醇/水(1:1)(v/v)的微型珠磨机中研磨。离心后，通过UPLC-MS/MS分析样品。
使用Acquity CSH氟苯基色谱柱(1.7μm,50×2.1mm)进行色谱分离。流动相由以下组成：在4.5分钟内以0.6ml/min的流速使用0.1％甲酸水溶液和乙腈从5％到45％的梯度。
关于质谱检测，电喷雾电离源用于记录负离子。进行了去质子化的分子离子的多重反应监测(MRM)采集模式。CDO监测的跃迁为m/z 189.0→80.1，锥电压为45V，碰撞能量为25eV。
结果
大鼠中CDO的眼部分布(局部眼部与口服施用)
下表2示出了不同测试时间时的组织的CDO浓度，单位μg/g：
表2
--：未检出
n.v：未测量
缩写Admin.表示施用
数据表明，在大鼠中的局部眼部施用导致低血浆水平，这很可能意味着眼睛前段的微血管和后段的BRB避免了通过眼后扩散至全身循环。
将CDO局部施用到眼睛表面时，吸收和分布很快。
大鼠中的1％w/v的单剂量(10μl滴眼剂)局部眼部施用(实施例1的组合物2)允许检测视神经中的CDO。
眼科局部途径具有更好的生物利用度，因为滴注于眼表面的1mg CDO在视网膜中显示出与口服施用40mg至150mg CDO相当的水平。
家兔中CDO的眼部分布(局部眼部与口服施用)
下表3示出了不同测试时间时的组织的CDO浓度，单位μg/g：
表3
数据表明，在家兔中局部眼部施用(单次低剂量0.3mg)在靶组织中的CDO值与单次口服剂量(45mg)相当。如果将更高量的单剂量(CDO 3.3mg)局部应用于眼睛，则与单次口服剂量后相比，检测到更高水平的药物。再次证明，局部应用于眼睛表面的CDO显示出高生物利用度。
此外，在两种动物模型中，局部眼部施用后6小时，可以在靶组织(特别是视神经和视网膜脉络膜)中检测到CDO量。
实施例3.大鼠中局部眼部单剂量施用后酚黄乙胺的眼部分布
方法
测定酚黄乙胺的眼部分布，以确定眼睛后段中药物的吸收。
在重约200g的Sprague Dawley(SD)大鼠中通过局部滴眼(10μl/眼)施用酚黄乙胺(实施例1的组合物6和7)。在施用后15、60和180分钟，对动物实施安乐死，并收集眼组织(包括视网膜和视神经)。
分析条件
如实施例2所述。
结果
下表4示出了实验结果：
表4
确认了另一种羟苯磺酸盐(酚黄乙胺)的吸收。当将活性成分局部施用到眼睛表面(将滴眼液滴到角膜和结膜上)时，它们会到达眼睛的后段，特别是视网膜和视神经。
综合这些数据可得出结论，盐形式的羟苯磺酸被吸收并迅速(不依赖于该盐)被运送到眼睛后段结构中。
实施例4.大鼠中局部眼部重复剂量施用后CDO的眼部分布
方法
在糖尿病大鼠中进行了28天的重复剂量研究，以评估稳态下视网膜中CDO的水平。通过局部滴眼(10μl/眼)TID 28天施用实施例1的CDO组合物2和5。在第29天，一次性滴注CDO，并在施用后15分钟收集视网膜。
分析条件
如实施例2所述。
结果
下表5示出了在28天重复剂量研究后测得的和在第29天于CDO单剂量施用后15分钟测得的视网膜组织的CDO浓度(μg/g)。
表5
以上总结的数据确认了局部眼部施用后CDO的正确吸收和分布以及视网膜组织中药物浓度的升高。在稳态研究中，在视网膜中CDO的剂量与浓度之间也观察到良好的相关性。重复剂量强化了单剂量施用后获得的数据。
实施例5.CDO在链脲佐菌素诱导的糖尿病性视网膜病变模型中的功效
方法
在雄性SD大鼠中，通过在柠檬酸盐缓冲剂(pH 4.5)中以60mg/kg体重单次腹膜内注射链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病。在STZ施用后7天，测量血糖，将250mg/dl的水平视为考虑糖尿病诱导的阈值。一旦确认了高血糖症，便开始以10mg/ml的CDO进行眼科治疗，每天3次持续28天(TID)。将大鼠随机分为3组：I.对照(非糖尿病的)；II.未治疗的糖尿病小鼠；III.利用10mg/ml的CDO的糖尿病小鼠。
在第29天，在III组中以10mg/ml滴注一次CDO，施用后15分钟将大鼠安乐死并收集视网膜。
视网膜血管形成
基于静脉注射后EB结合血清白蛋白的能力，通过伊文思蓝(EB)染色观察到视网膜血管形成。因此，在第29天安乐死前60分钟，以1ml/kg的剂量通过尾静脉注射3％的伊文思蓝。眼球固定在4％的低聚甲醛中。解剖后立即将视网膜安装在载玻片上，并通过荧光显微镜观察。
抗氧化能力
通过确定视网膜匀浆中的谷胱甘肽二硫化物(GSSG)或氧化型谷胱甘肽的浓度来评估其抗氧化能力。在第29天收集组织，并在含有1mM EDTA的PBS(pH 6-7)中匀浆。以10000rpm离心后，将上清液等分试样用0.1％甲酸稀释并通过UPLC-MS/MS分析。
使用Acquity HSST3色谱柱(1.8μm,50×2.1mm)进行色谱分离。用0.1％甲酸和甲醇(99:1)的混合物作为流动相，以0.6ml/min的流速进行等度洗脱。
关于质谱检测，电喷雾电离源用于记录负离子。进行了去质子化的分子离子的多重反应监测采集模式。GSSG监测的跃迁为m/z 611.2→306.2，锥电压为45V，碰撞能量为25eV。
抗炎活性
使用商业试剂盒SV Total RNA Isolation System(Promega)从各视网膜中分离RNA，并在-80℃保存直至使用。使用MX3000(Stratagene)定量PCR系统对相对mRNA水平进行定量。使用一步法qRT-PCR SYBR Green PCR Master Mix结合基因的靶特异性引物进行逆转录和cDNA扩增。热循环仪的参数为：在50℃进行15分钟并在95℃进行2分钟的循环1次，然后在95℃进行30秒、在55℃进行30秒并在68℃进行30秒的循环40次，最后在95℃进行60秒、在55℃进行30秒并在95℃进行30秒的循环1次。
引物序列如下：
β-肌动蛋白：(正向引物，5’-GTCGTACCACTGGCATTGTG-3’(SEQ ID NO:1)；反向引物，5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’(SEQ ID NO:2))。
TNF-α：(正向引物，5’-ATCTACTCCAGGTCCTCTTC-3’(SEQ ID NO:3)；反向引物，5’-GATGCGGCTGATGGTGTG-3’(SEQ ID NO:4))。
qPCR系统检测到SYBR发出的荧光，它的增加对应于PCR产物的指数增加。该软件计算阈值循环(Ct)，其中荧光超过背景信号。基因表达的相对变化使用ΔCt方法计算。将基因表达量标准化为β-肌动蛋白作为管家基因。测试样品中mRNA的相对表达作为与对照样品(非糖尿病性)相比的倍数增量测定。
结果
视网膜血管生成
通过荧光显微镜评估视网膜。在糖尿病大鼠(未治疗组II)中，视网膜血管生成明显受损，并且观察到微血管病变与糖尿病性视网膜病变的早期相一致。观察到来自毛细血管的渗透性增加以及明显的视网膜血管渗漏。在该糖尿病未治疗组II中观察到不严重的血管生成过程。用10mg/ml CDO处理的糖尿病大鼠的视网膜保存完好，血管清晰，没有血管损伤的迹象。视网膜的整体外观更接近于非糖尿病对照组I。
抗氧化能力
图1显示了在糖尿病大鼠(未治疗组II和治疗组III)以及对照组I的视网膜匀浆中测定的GSSG浓度。糖尿病大鼠(未治疗)的GSSG的视网膜浓度高于对照组(P<0.05，采用Bonferroni校正的单向ANOVA)。然而，用10mg/ml CDO处理的糖尿病大鼠能够返回与对照组相同水平的GSSG浓度(P<0.01，组II相比组III，采用Bonferroni校正的单向ANOVA)，证明了该大鼠糖尿病性视网膜模型中CDO的抗氧化能力。这些结果证实了CDO在靶组织中的活性，并显著避免了与高血糖水平引起的氧化应激过程有关的活性氧物质的产生。
抗炎活性
图2显示了糖尿病大鼠(未治疗组II和治疗组III)以及对照组I(非糖尿病)的视网膜中的TNF-αmRNA的相对表达。观察到糖尿病组II的视网膜中炎性细胞因子TNF-α水平升高。用10mg/ml CDO治疗能够显著降低TNF-α水平(P<0.01，组II相比组III，采用Bonferroni校正的单向ANOVA)，此外，未治疗组的表达略低于对照组，证明了CDO在此大鼠糖尿病性视网膜病变模型中的抗炎效果。
实施例6.眼部刺激测定(HET-CAM)
方法
HET-CAM是Draize家兔眼试验的替代方法，该方法可模拟绒膜尿囊膜(眼结膜的类似物)中的血管变化，其用于确定测试物质的潜在刺激性。此方法基于“鸡蛋测试-绒膜尿囊膜(HET-CAM)测试方法”(ICCVAM-Recommended Test Method Protocol,NIH 10-7553号公报–2010出版)中描述的方法。
将受精的白色SPF(不含特殊病原体)White Leghorn鸡蛋在37℃和60％湿度下孵育直至第10天。确定了胚胎的存活力后，直接从壳上的气室上取下了一个矩形窗口，将鸡蛋膜小心地用2-3ml的0.9％盐水润湿。返回培养箱30分钟后，取出内膜，用移液管将测试物质涂在CAM膜上。持续观察鸡蛋5分钟，观察其是否出现裂解、出血和/或凝结现象，并根据ICCVAM推荐的测试方法规程(NIH 10-7553号公报，2010年出版)指南确定刺激评分(IS)。
结果
进行了HET-CAM眼刺激测定，并在图3中显示了0.9％的NaCl(阴性对照)、0.1％的NaOH(阳性对照)、酚黄乙胺(100mg/ml)、羟苯磺酸钾(100mg/ml)和CDO(100mg/ml)的代表性图像。受测活性成分未触发任何裂解、出血或凝结过程，因此被表征为无刺激性。IS是刺激分数。
实施例7.大鼠中CDO的眼耐受性
方法
每天3次用实施例1的CDO组合物2和5对糖尿病SD雄性大鼠治疗28天(局部滴注10μl/眼)。在整个研究过程中进行眼睛外观的临床评估。
结果
经治疗的大鼠的临床眼评估未显示刺激症状，表明受测组合物具有良好耐受性。
引用列表
专利文献
-EP2875811
-EP2777699
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