阅读说明：本技术 一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类egfr抑制剂的应用及其制备方法 (Application of polysaccharide EGFR inhibitor for targeted inhibition of tumor metastasis and preparation method thereof ) 是由 钟春莲 卢余盛 贾力 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类EGFR抑制剂的应用及其制备。本发明提供的EGFR抑制剂提取于中国传统中药土牛膝,具有高效低毒的特点,可用于预防癌细胞转移。本发明提供的EGFR抑制剂能够有效抑制EGFR野生型细胞A549、突变敏感型细胞PC-9的转移。因此本发明EGFR抑制剂可以用于治疗EGFR野生型和突变敏感型肺癌患者,且具有较小的毒副作用。(The invention provides application and preparation of a polysaccharide EGFR inhibitor for targeted inhibition of tumor metastasis. The EGFR inhibitor provided by the invention is extracted from the traditional Chinese medicine achyranthes aspera, has the characteristics of high efficiency and low toxicity, and can be used for preventing cancer cell metastasis. The EGFR inhibitor provided by the invention can effectively inhibit the transfer of EGFR wild type cell A549 and mutation sensitive cell PC-9. Therefore, the EGFR inhibitor can be used for treating EGFR wild type and mutation sensitive lung cancer patients, and has small toxic and side effects.)

一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类EGFR抑制剂的应用及其制备 方法

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类EGFR抑制剂的应用及其制备方法。

背景技术

癌症是仅次于心血管疾病导致人类死亡的的第二大因素。据统计，2020年美国新发癌症病例约为180万，而死亡病例却高达60万，其中死于肺癌的患者占到了21％。在确诊的肺癌病例中约有57％的患者已经发生转移，导致患者5年生存期不足5％，这也是癌症死亡率居高不下的主要因素。近年来发展了多种针对癌症终末期的靶向药物，尽管早期临床效果显著，但随着基因的突变和不断增加的耐药性，靶向药物的发展到达了瓶颈期。目前临床上使用的靶向药物仅能延长患者几个月的生存期，而不能有效的阻断癌症的转移。手术切除和辅助治疗可以有效的控制局部原发肿瘤，而对于已经发生转移的肿瘤，由于其异质性和耐药性没有有效的治疗药物，因此，亟需研发针对肿瘤转移的靶向药物。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属于受体酪氨酸激酶家族。其结构包括胞外配体结合区域，跨膜区域和胞内信号转导区域。当与配体EGF或转化生长因子α(TGFα)结合后，EGFR的构象发生改变，产生同源或异源二聚化，引起胞内酪氨酸激酶激活，对细胞的生长、增殖、分化、血管生成、细胞运动等生理过程发挥重要的调节作用。细胞内EGFR激酶过度激活与肿瘤的发生发展密切相关。EGFR在乳腺癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中高表达，且与肿瘤的进展、耐药性、差的预后呈正相关。在20世纪90年代末期开发了针对EGFR的靶向药物，第一代靶向药物为针对EGFR的单克隆抗体，与EGF和TGFα等配体竞争性结合EGFR，抑制EGFR的激活。其中吉非替尼、厄洛替尼在临床试验中显示了明显的单药活性，而西妥昔单抗不论单药还是联用都没有任何疗效。在一项与最佳支持治疗比较的随机实验中，吉非替尼未能有效的提高患者的生存期。虽然第一代靶向药物临床效果不是很理想，但在EGFR19位外显子缺失的患者(约占20-30％)早期治疗中表现出良好的治疗效果，相比于化疗明显提高患者的生存期。然而随着用药时间的延长，在9-12月后患者表现出明显的耐药性，大部分患者出现转移。基于EGFR的不断突变和耐药性的增加，不断研发了第二代、第三代和第四代EGFR抑制剂。但随着EGFR抑制剂的不断研发，也出现了药物适用范围窄，对野生型EGFR抑制效果差、患者EGFR不断突变及药物毒性等诸多问题。此外，目前EGFR抑制剂主要通过阻断胞内酪氨酸激酶的激活发挥抑制细胞增殖的作用，而不能从胞外直接阻断EGFR的二聚化，从而抑制EGFR的活化。本发明的多糖类EGFR抑制剂提取于中国传统中药材土牛膝的根部，体内体外实验均未表现明显的细胞毒性，具有用药安全性。此外本发明中的多糖作为小分子，容易被细胞吸收，其可通过与EGF竞争性结合EGFR的胞外域阻断其二聚化，抑制胞内激酶的激活，从胞外直接发挥抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类EGFR抑制剂的应用及其制备方法，本发明提供的多糖可以以配体的形式与EGFR结合，完全阻断EGF对EGFR的激活作用，且该多糖具有易获取、低毒性等优点。

本发明的具体内容如下：

一种靶向抑制肿瘤转移的多糖类EGFR抑制剂的应用，所述多糖类EGFR抑制剂的结构式为：

该结构式中，m,n＝0-19,m+n＝2-19，由D-β-葡萄糖和D-α-甘露糖组成；

所述多糖类EGFR抑制剂用于制备预防肿瘤转移的药物；

所述肿瘤由EGFR^WT或EGFR介导引起。

所述多糖来源于中药牛膝根，经水溶醇沉及去除蛋白质等杂志获得粗制多糖，粗多糖经纤维柱层析获得单一纯多糖。具体取中药牛膝根，粉碎得牛膝粉，取所述牛膝粉加入去离子水溶解，混合均匀后过滤提取3h，经乙醇分级沉淀得到多糖粗制品；将所述多糖粗制品加入sevage试剂去除蛋白质，经CM-Sephadex C50和Sephadex G50纤维柱层析，获得单一纯牛膝多糖。

进一步的，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备抑制EGFR野生型激酶活性的药物，所述EGFR野生型激酶参与EGFR的激活及下游细胞内的激酶通路。

进一步的，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备抑制EGFR突变型激酶活性的药物，所述EGFR突变型激酶参与EGFR的激活及下游细胞内的激酶通路；

所述EGFT突变型为19外显子缺失。

发明人通过Western blot实验检测EGFR的磷酸化水平，即EGFR激酶的激活情况。如表1所示，EGF刺激后明显促进EGFR的激活，正常情况下，EGFR激酶的活性为1，EGF刺激后，野生型和突变型(19位外显子缺失)EGFR激酶活性分别增加1.4±0.07倍(p<0.001)和3.8±0.2倍(p<0.001)，给予10μg/mL多糖预处理后，野生型EGFR激酶活性恢复到正常水平，其IC50为10μg/mL；给予50μg/mL的多糖预处理后，突变型EGFR激酶活性降为正常情况下的1.5±0.1倍(p<0.001)，其IC50为50μg/mL。验证了本发明所述多糖既能抑制由EGFR野生型介导引起的癌症，又能抑制由EGFR突变型(19位外显子缺失)介导引起的癌症，即可用于制备抑制野生型和19位外显子缺失的EGFR激酶激活的药物。

进一步的，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备与EGF竞争性结合EGFR野生型的药物，与EGFR的结合位点位于EGFR结构域I和III之间。

进一步的，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备与EGF竞争性结合EGFR突变型的药物，与EGFR的结合位点位于EGFR结构域I和III之间；所述EGFT突变型为19外显子缺失。

发明人还采用了分子对接分析寻找多糖和EGFR的结合位点，如图2所示，多糖与EGFR的结合位点位于结构域I和III之间，阻断EGFR与EGF的结合，其中最低亲和力为-9.08275。多糖以配体的形式占据了EGF的结合位点，从而阻断EGF与EGFR的结合，抑制EGFR的二聚化和胞内激酶的激活，这也解释了在多糖存在的情况下，为什么EGF失去了对EGFR的激活作用。

进一步的，所述肿瘤为肺癌，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备抑制肺癌细胞侵袭、转移的药物。

发明人采用transwell侵袭实验检测多糖对野生型EGFR细胞系A549和突变型EGFR细胞系PC9细胞侵袭能力的抑制作用。如表2所示，多糖在浓度为10μg/mL时就可以明显抑制A549和PC9细胞的侵袭，给予EGF刺激明显促进A549和PC9细胞的侵袭，相比于正常组，侵袭率分别增加150±9.3％(p<0.001)和287.6±8.8％(p<0.001)，给予10μg/mL多糖处理后，A549和PC-9细胞的侵袭率分别降低了86.6±5.4％(p<0.001)和71.9±3.0％(p<0.001)。上述结果表明，低浓度的多糖可以明显抑制野生型EGFR细胞系A549和突变型EGFR细胞系PC-9的侵袭能力，阻断其跨细胞外基质迁移。

进一步的，所述肺癌细胞为A549细胞或PC-9细胞。

进一步的，所述多糖类EGFR抑制剂用于制备治疗肿瘤转移或与肿瘤相关疾病的药物组合物。

进一步的，所述药物加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂、膏剂或外用药液。

本发明有益效果：

1、本发明提供的多糖类EGFR抑制剂可用于制备预防肿瘤细胞侵袭、转移的药物，该多糖以配体的形式与EGFR结合，完全阻断EGF对EGFR的激活作用。

2、本发明所示多糖来源于中药牛膝根，具有来源广泛、易获取、低毒性、提取方法简单等特点，适于开发为临床药物。

附图说明

图1为HPLC图谱。

图2为多糖与EGFR的结合位点图示。

具体实施方式

下面的具体实施例的目的是使本领域的技术人员能更清楚地理解和实施本发明。它们不应该被认为是对本发明范围的限制，而只是本发明的示例性说明和典型代表。

实施例1.多糖的提取与分析

本发明中所用的牛膝多糖属本发明人于所在单位提取。取牛膝粉(牛膝产自河南)，加入去离子水溶解，混合均匀后过滤提取3h，经乙醇分级沉淀得到多糖粗制品。将多糖粗制品加入sevage试剂去除蛋白质，经CM-Sephadex C50和Sephadex G50纤维柱层析，获得单一纯牛膝多糖。斐林试剂反应结果为红色沉淀证明其含有糖类和苷类等成分，而Libermann-Burchard反应，沙尔科夫斯基反应，Hager反应和碘化铋钾反应均未发生明显的颜色改变，上述结果证明所提取牛膝多糖为纯多糖，不含固醇类、皂苷及生物碱杂质。

样品经完全酸水解后，通过HPLC方法：向多糖样品中加入1mol/L硫酸，搅拌加热至100℃，经完全水解后，中和去除沉淀，采用碳水化合物分析HPLC色谱柱(乙腈/水＝85:15)分析多糖组成，用峰面积计算糖基的摩尔比。

经HPLC分析得图1，结果表明该多糖由果糖和葡萄糖组成，摩尔比为8:1。

发明人还采用核磁共振NMR对多糖结构进行分析。质子核磁共振谱分析显示，葡萄糖的H-1的化学位移在δ5.2ppm，表明在多糖中葡萄糖为α构型。13C核磁共振谱在δ95.38,75.65,75.60,75.33,74.05,74.00ppm有比小的峰对应葡萄糖残基的13C信号；在δ107.05,107,106.92,106.19,106.09,105.99ppm有较大的聚集峰对应果糖残基的13C-2信号；在δ83.11ppm有一明显的峰，对应2,6连接的果糖残基的13C-5信号；在δ84.09,84.04ppm有2个明显的峰，对应1,2连接的果糖残基的13C-5信号。由此推测该多糖既有1,2连接的果糖残基，又有2,6连接的果糖残基。

实施例2.检测对EGFR野生型细胞系A549，EGFR突变敏感型细胞系PC-9的EGFR激活抑制作用

发明人通过Western blot实验检测EGFR的磷酸化水平，即EGFR激酶的激活情况。分别取对数生长期细胞A549和PC-9接种于6孔板中，待细胞生长至80％左右，给予不同浓度的多糖(0,10,50,100μg/mL)预处理24h，向6孔板中加入EGF(50ng/mL)刺激15min后，收集细胞。加入蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂，于冰上裂解30min，离心收集蛋白裂解液。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、孵育抗体、显色等步骤检测EGFR激酶活性(即p-EGFR表达水平)，得表1所示结果。

表1多糖对激酶活性的抑制作用分析

(注：激酶活性数值为相对值，与正常组相比，###表示p<0.001；与EGF刺激组相比，***表示p<0.001)

如表1所示，EGF刺激后明显促进EGFR的激活，正常情况下，EGFR激酶的活性为1，EGF刺激后，野生型和突变型(19位外显子缺失)EGFR激酶活性分别增加1.4±0.07倍(p<0.001)和3.8±0.2倍(p<0.001),给予10μg/mL多糖预处理后，野生型EGFR激酶活性恢复到正常水平，其IC50为10μg/mL；给予50μg/mL的多糖预处理后，突变型EGFR激酶活性降为正常情况下的1.5±0.1倍(p<0.001)，其IC50为50μg/mL。表1验证了本发明多糖可以明显抑制EGF对EGFR激酶的激活。因此，本发明所述多糖既能抑制由EGFR野生型介导引起的癌症，又能抑制由EGFR突变型(19位外显子缺失)介导引起的癌症。

实施例3分子对接预测多糖与EGFR的结合位点

采用计算机模型分析多糖与EGFR的结合位点，EGFR结构(1IVO)来源于蛋白数据库。经计算机模拟对接，显示多糖与EGFR的结合位点在EGFR的结构域I和III之间。

分子对接分析寻找多糖和EGFR的结合位点，如图2所示，多糖与EGFR的结合位点位于结构域I和III之间，阻断EGFR与EGF的结合，其中最低亲和力为-9.08275。多糖以配体的形式占据了EGF的结合位点，从而阻断EGF与EGFR的结合，抑制EGFR的二聚化和胞内激酶的激活，这也解释了在多糖存在的情况下，为什么EGF失去了对EGFR的激活作用。

实施例4检测多糖对EGFR野生型细胞系A549，EGFR突变敏感型细胞系PC-9侵袭、转移的抑制作用

本发明的发明人采用transwell侵袭实验检测多糖对野生型EGFR细胞系A549和突变型EGFR细胞系PC9细胞侵袭能力的抑制作用。于24孔板中加入500μL含不同药物处理(空白，EGF刺激，EGF+10μg/mL多糖,EGF+50μg/mL多糖,EGF+100μg/mL多糖)的培养基。分别取对数生长期的A549和PC9细胞，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴/mL，取200μL含有不同药物处理(空白，EGF刺激，EGF+10μg/mL多糖,EGF+50μg/mL多糖,EGF+100μg/mL多糖)的无血清细胞悬液加入含有基质胶的transwell小室，将小室轻轻放入24孔板中，避免产生气泡。于37℃培养箱培养24h，取出小室，去掉未侵袭细胞，穿过transwell小室的细胞结晶紫染色，统计侵袭细胞数，得表2。

表2多糖对肺癌细胞侵袭能力的影响

(注：与正常组相比，#表示p<0.05，###表示p<0.001；与EGF刺激组相比，**表示p<0.01，***表示p<0.001)

如表2所示，多糖在浓度为10μg/mL时就可以明显抑制A549和PC9细胞的侵袭，给予EGF刺激明显促进A549和PC9细胞的侵袭，相比于正常组，侵袭率分别增加150±9.3％(p<0.001)和287.6±8.8％(p<0.001)，给予10μg/mL多糖处理后，A549和PC-9细胞的侵袭率分别降低了86.6±5.4％(p<0.001)和71.9±3.0％(p<0.001)。表2验证了多糖可以明显抑制由EGF激活EGFR引起的A549和PC9细胞跨基质胶侵袭，且具有浓度依赖性，随着多糖浓度的增加，侵袭抑制效果越显著。

上述结果表明，低浓度的多糖可以明显抑制野生型EGFR细胞系A549和突变型EGFR细胞系PC-9的侵袭能力，阻断其跨细胞外基质迁移。

本发明人所发明的针对肿瘤转移的靶向EGFR的多糖药物，可与EGF竞争性的结合EGFR，阻断下游激酶的活化，且结合位点与EGF具有相似性，位于EGFR结构域I和III之间。本发明的多糖类EGFR的抑制剂因其提取于中国传统中药材牛膝，具有来源广泛、易获取、低毒性等特点，适于开发为临床药物。