阅读说明：本技术 一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法 (Method for preparing high-quality single cell suspension by remarkably improving plaque digestion ) 是由 朱尚明 吉训明 张永彪 石小峰 成军 裴葆青 谷涌泉 刘会生 于 2020-01-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种显著提升单细胞悬液质量的动脉斑块消化的方法,包括胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ、氯化钙、脱氧核糖核酸酶I、磷酸缓冲盐溶液、牛血清白蛋白溶液、RPMI 1640细胞培养液。本发明同时公开了其在消化斑块组织中的应用前景。本发明主要针对斑块组织进行消化处理而发明,通过几种酶的组合,可将斑块组织消化成为活性比例较高单细胞悬液,在单细胞基础上研究斑块组织的生物学反应,从而避免出现存在许多钙化细胞碎片、组织杂质等影响单细胞测序上机或后续数据分析结果的情况。(The invention discloses an arterial plaque digestion method for remarkably improving the quality of single cell suspension, which comprises collagen hydrolase I, collagen hydrolase II, collagen hydrolase IV, collagen hydrolase XI, calcium chloride, deoxyribonuclease I, phosphate buffer salt solution, bovine serum albumin solution and RPMI 1640 cell culture solution. The invention also discloses an application prospect of the polypeptide in digesting plaque tissues. The invention is invented mainly aiming at the digestion treatment of plaque tissues, and the plaque tissues can be digested into single cell suspension with higher activity ratio through the combination of several enzymes, and the biological reaction of the plaque tissues is researched on the basis of single cells, thereby avoiding the condition that a plurality of calcified cell fragments, tissue impurities and the like influence a single cell sequencing machine or the subsequent data analysis result.)

一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法

技术领域

本发明涉及斑块消化的方法领域，具体涉及斑块组织消化的方法以制备高质量单细胞悬液及其应用。

背景技术

《中国心血管病报告2018》显示，中国心脑血管疾病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，心脑血管疾病死亡在居民疾病死亡构成中居首位。目前，心脑血管疾病已成为重大的公共卫生问题，而动脉粥样硬化的控制与心脑血管疾病的防治息息相关。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础，高血压、吸烟和高同型半胱氨酸血症等危险因素均会引起机体产生动脉粥样硬化，甚至由于母体的高胆固醇血症，最早在胎儿主动脉中就能观察到动脉粥样硬化的初级状态“脂质条纹”，动脉粥样硬化的发病机制是多因素的，因此，要实现斑块逆转、延缓发病进程极为复杂。随着科学研究技术的不断更新，尤其在生命科学领域，新的研究方法迭代推陈出新，现在研究过程中需要将动脉斑块组织消化成单细胞悬液，以便通过单细胞测序的方法，分析斑块组织里细胞分类、细胞分群、细胞亚群、细胞表型转换、细胞迁移等，揭示动脉粥样硬化发生发展过程中的时空信息。在单个细胞群体水平上进行分析研究，可以更精准的阐释动脉粥样硬化的发病机理。

在处理斑块的过程中，机械法切碎和酶消化若没有处理好，会出现许多细胞碎片及大量死细胞，导致过滤细胞悬液时操作时间过长，以及在后续进行单细胞转录组测序上机的时候会出现管道堵塞的现象，造成精密仪器损坏。虽然现在市面上存有许多组织消化试剂盒，但是由于斑块的特殊性，消化不彻底，存在大量细胞碎片及死细胞，不能达到很好的消化效果，制备的单细胞悬液质量得不到保证。现在斑块组织彻底消化及消除钙化碎片、细胞碎片的问题没有很好的解决。

发明内容

本发明目的是提供一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种酶组合，所述酶组合包含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ；

优选地，胶原蛋白水解酶Ⅰ、胶原蛋白水解酶Ⅱ、胶原蛋白水解酶Ⅳ、胶原蛋白水解酶Ⅺ的浓度比例是1：1：1：1；

更优选地，所述酶组合包含脱氧核糖核酸酶Ⅰ。

本发明提供了一种消化液，包含前面所述的酶组合。

进一步，所述消化液包含RPMI 1640细胞培养液。

进一步，所述消化液的酶组合中胶原蛋白酶浓度均为1mg/mL，脱氧核糖核酸I酶浓度为200U/mL。

更进一步，所述消化液包含氯化钙。

在本发明的具体实施方案中，所述消化液中氯化钙终浓度为10mM。

本发明提供了一种消化颈动脉斑块的方法，所述方法包括使用前面所述的酶组合或使用前面所述的消化液。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)收集组织：选取病例样本，斑块手术剥脱离体后，置于4℃MACS组织保存液中；

(2)分离样品：将斑块样品，置于PBS中清洗血凝块，剔除钙化块，并分离；

(3)组织消化：将样品转移到消化液中，剪碎，进行消化；

(4)终止消化：消化1h后，用微型移液枪将消化体系反复吹打混匀，室温静置1min。在200g，4℃，5min条件下离心；

(5)过筛离心：消化体系液体离心后，弃去上清液，用15ml PBS重悬，然后过40μm细胞筛；

(6)优化处理：红细胞裂解，美天旎去死细胞kit，美天旎去碎片kit等滤除杂质；

(7)活性检测：使用Countstar仪器ID:WIN-7RFTLHV6T5L检测。

本发明提供了前面所述的酶组合在制备前面所述的消化液中的应用。

本发明提供了前面所述的酶组合或前面所述的消化液在制备消化颈动脉斑块的试剂中的应用。

进一步地，所述颈动脉斑块为人颈动脉斑块组织。

本发明的有益效果：

本发明方法主要针对斑块组织进行完全消化处理而发明，通过几种酶的组合，并结合机械法，可将斑块组织彻底消化成为单细胞悬液，在单个细胞水平研究斑块的病理生理机制，通过各种优化方案处理可将单细胞悬液里的红细胞、细胞碎片、杂质等去掉而不影响单细胞的活性、浓度，从而避免出现钙化细胞碎片、杂质、细胞结团等影响后续单细胞上机测序、测序数据库分析以及后续流式细胞术、细胞培养验证不易的情况。

附图说明

图1为处理对照组1的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；

图2为处理对照组2的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；

图3为处理实验组的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息；

图4为斑块组织消化后细胞活性统计图。

具体实施方式

下面结合实验组和附图对本发明做更进一步地解释。下列实例仅用于说明本发明，但并不限定本发明的实施范围。

实施例斑块组织消化

一、实验材料

以下实验组和对照组1、对照组2涉及的酶，胶原蛋白水解酶(Collagenase Ⅰ，sigma，C0130-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅱ(Collagenase Ⅱ，sigma，C6885-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅲ(Collagenase Ⅲ，Solarbio，C8490-100mg)，胶原蛋白水解酶Ⅳ(CollagenaseⅣ，sigma，C5138-100MG)，胶原蛋白水解酶Ⅺ(Collagenase Ⅺ，sigma，C7657-100MG)，浓度均为1mg/ml。胰蛋白酶 (0.25％Trypsin-EDTA(1×)，Gibco-25200072-500ml)，透明质酸酶(Hyaluronidase， sigma，H3506-50MG)。

氯化钙(CaCl₂，sigma，C1016-500g)。

脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ，neb，M0303S)。

磷酸缓冲盐溶液(PBS，Hycone，SH30256.01B)。

牛血清白蛋白溶液(BSA，美天旎，130-091-376)。

1640培养液(RPMI 1640，life，11875093)。

胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅺ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为1mg/ml。对照组1中，胶原蛋白水解酶Ⅳ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml。对照组2中，胰蛋白酶，胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml。

PBS含1％BSA

DNase Ⅰ酶：用1640细胞培养液溶解至终浓度为200U/ml。

二、步骤

实验前准备，将灭菌消毒的实验器械，耗材等置入超净台中，紫外线照射1 小时，并在超净台中将实验所需的酶配置好，制成斑块消化的混合酶体系，内含：胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅺ(各1mg/ml)、氯化钙(10mM)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(200U/ml)。并分装0.5ml混合酶到2ml的EP管中。

1.取材：获取病人颈动脉斑块剥脱手术离体时的颈动脉斑块组织标本，于 MACS组织保存液(MACS Tissue Storage Solution，货号：130-100-008)中置于4℃保存运送处理。

2.冲洗：将组织从保存液中倒入六孔板其中的一个孔，先在保存液中清洗血液并剔除严重钙化部分，然后在剩余的装有1640培养基的5个孔中逐次冲洗，清除保存液、血渍、钙化片等。

3.测量：在最后清洗的六孔板中将斑块组织分离成约1cm×1cm的样品。

4.剪碎组织：在超净台内无菌操作，镊子、眼科剪刀在酒精灯上灼烧后后擦拭干净，将样品用镊子移至分装好的EP管中，用眼科剪刀机械法将斑块组织剪碎至1mm×1mm大小，再加入1ml混合酶体系，配制成1.5ml反应体系。耗时不超过10分钟，开始准备消化。

5.消化准备：将配制好反应体系(共1.5ml)2mlEP管在37℃的水浴锅中边摇晃边复温2分钟，然后转入37℃培养箱中，于HS垂直混合仪上边摇转边消化 1小时。

6.终止消化：消化1h后，用微型移液枪将消化体系反复吹打混匀，室温静置1min；转移消化体系液到15ml离心管中加入PBS(含1％BSA)至15ml，在 200g，4℃，5min条件下离心。

7.滤网过筛：消化体系液体离心后，弃去上清液，用15ml PBS重悬。再次用微型移液枪头反复温柔吹打，然后过40um细胞筛，移液时绕滤网四周进行过滤。

8.红细胞裂解：将消化的单细胞悬液合并后，弃去上清，加入红细胞裂解液 4ml静置10min后，200g，4℃，5min条件下离心，1ml的1640重悬。

9.美天旎去死细胞kit：将上述体系进行死细胞去除，500ml 1640+BSA重悬，200g，4℃，5min条件下离心。

10.美天旎去碎片kit：接步骤9在300g，4℃，5min条件下离心，离心后，弃上清，PBS重悬，按说明书操作制备体系，3000g，4℃，10min离心，1000g， 4℃，10min离心。

11.密度梯度离心kit：接步骤10，按美天旎试剂操作说明制备操作体系进行梯度离心。

12.细胞活性检测计数：使用Countstar仪器ID:WIN-7RFTLHV6T5L检测。

对照组1：混合酶体系含，胶原蛋白水解酶Ⅳ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml，

DNase Ⅰ酶：用1640细胞培养液溶解至终浓度为200U/ml。

在实施例中步骤4中将混合酶体系换为胶原蛋白水解酶Ⅳ2mg/ml和DNase Ⅰ酶200U/ml，其他同实验组。

对照组2：混合酶体系含，分为两步处理，先用胰蛋白酶处理37℃30min，然后用混合酶体系含，胶原蛋白水解酶Ⅰ、Ⅲ：用1640细胞培养液溶解至终浓度为2mg/ml。

具体在实施例中步骤4中换为先用胰蛋白酶消化37℃30min，离心去除胰酶，然后用胶原酶Ⅰ、Ⅲ和透明质酸酶2ml体系，37℃，30min消化，其他同实验组。

三、实验结果

处理对照组1、对照组2、实验组(实施例)的斑块组织经细胞活性检测仪器Countstar的检测图片信息分别如图1-3所示。

分析结果如表1和图1所示。

表1 Countstar检测斑块单细胞悬液的结果

表1显示，相比对照组，实验组(实施例)的细胞活性显著升高。

本发明经测试，可以实现将经机械切碎处理的斑块组织彻底消化成单细胞悬液的目的，且单细胞悬液的活细胞数量和活性，均有显著提升。

说明书附图

图注：图1对照组1；图2对照组2；图3实验组；图4对照组、实验组对比

A：BR明场；B：FL1绿色荧光；C：FL2红色荧光；D：融合；E：直径分布图；F：FL1荧光强度分布图；G：FL2荧光强度分布图。