阅读说明：本技术 一种两亲性dna纳米胶束及其制备方法和应用 (Amphiphilic DNA nano micelle and preparation method and application thereof ) 是由 梁文斌 彭锌 卓颖 柴雅琴 袁若 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物荧光分析技术领域,具体涉及一种两亲性DNA纳米胶束及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：设计目标物miRNA的特异DNA发卡序列H1-5,在H3末端修饰疏水性的C12烷烃链,制备sp-H3冻干粉,再将获得的sp-H3冻干粉制成发夹结构的sp-H3分散液,最后将荧光染料加入分散液中,超声得到DNA纳米胶束。还提供了该DNA胶束纳米在无标记检测目标miRNA的应用。本发明构建的DNA胶束不仅能够快速组装成球形纳米结构,还具有较大的固载容量；同时具有选择性好,操作便捷等特点,对生物小分子的测定具有重要意义。(The invention belongs to the technical field of biological fluorescence analysis, and particularly relates to an amphiphilic DNA nano micelle and a preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: designing a specific DNA hairpin sequence H1-5 of a target miRNA, modifying a hydrophobic C12 alkane chain at the tail end of H3 to prepare sp-H3 freeze-dried powder, preparing the obtained sp-H3 freeze-dried powder into sp-H3 dispersion liquid with a hairpin structure, adding a fluorescent dye into the dispersion liquid, and performing ultrasonic treatment to obtain the DNA nano micelle. Also provides the application of the DNA micelle nano in label-free detection of target miRNA. The DNA micelle constructed by the invention not only can be rapidly assembled into a spherical nano structure, but also has larger solid-supported capacity; meanwhile, the method has the characteristics of good selectivity, convenience in operation and the like, and has important significance for measuring the biological small molecules.)

一种两亲性DNA纳米胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物荧光分析领域，具体涉及一种两亲性DNA纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术

DNA纳米结构作为纳米技术领域的一种高度可控的新兴材料而备受关注，在药物传递、疾病诊断、肿瘤标志物早期检测等方面具有较大的发展潜力。近年来，各种各样的DNA纳米结构，比如DNA四面体、DNA立方体等，被设计为纳米笼用于固载小分子，以应用于高灵敏分析检测。然而，用于组装纳米结构的DNA序列通常需要花大量时间来精心设计，同时由DNA长链组装成纳米结构的条件较为苛刻，且组装时间长，组装效率低等问题而限制了基于DNA组装的纳米材料的广泛应用。鉴于这些问题，构建一种碱基序列设计简单、组装效率高的DNA纳米结构显得尤为重要。

近年来，两亲性的嵌段共聚物被报道能够通过自组装形成纳米胶束，并可以在其胶束内部包裹大量的功能性小分子，从而作为构建药物传递系统，纳米反应器等领域的热门研究对象。然而，传统的两亲性共聚物胶束通过紫外或pH调节释放内分子，这些调节方式不仅不能直接实现对生物分子的特异性和定量检测，而且还可能通过长时间的紫外辐射或pH环境的变化影响反应体系的稳定性，在一定程度上限制了其应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种两亲性DNA纳米胶束。本发明目的之二在于提供一种两亲性DNA纳米胶束的制备方法，该制备方法能够使两亲性DNA快速组装成球形纳米结构，所形成的纳米胶束具有较大的固载容量。本发明目的之三在于提供一种两亲性DNA纳米胶束无标记检测目标miRNA的方法，此方法具有选择性好、操作便捷等特点。本发明目的之四在于提供一种两亲性DNA纳米胶束在肿瘤细胞内miRNA检测中的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种两亲性DNA纳米胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)设计目标物miRNA的特异DNA发卡序列H1-5，核苷酸序列如SEQ ID NO：1-5所示，所述目标物miRNA为miRNA-21，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，在所述H3发卡序列末端修饰疏水性的C12烷烃链，制备两亲性的DNA共聚物sp-H3冻干粉；

(2)以步骤(1)获得的sp-H3冻干粉制备具有发夹结构的sp-H3的分散液；

(3)将荧光染料加入步骤(2)中获得的分散液中，超声即可。

作为优先的技术方案之一：步骤(2)中，所述分散液按如下方法制备：将所述sp-H3冻干粉溶解在含有Mg²⁺的缓冲液中，在95±2℃下孵育5-10min，再以0.5℃/min的速度降至25℃后保持5-10min。

作为优先的技术方案之一：步骤(3)中，所述荧光染料与所述分散液中具有发夹结构的sp-H3的摩尔比为10:1。

作为优先的技术方案之一：所述荧光染料为疏水性荧光染料，所述疏水性荧光染料为但不限于苝、菁、油红或尼罗红。

作为优先的技术方案之一：超声功率为30-60W，时间5-10min。

2、一种两亲性DNA纳米胶束。

3、一种两亲性DNA纳米胶束无标记检测目标miRNA的方法，所述方法如下：

将所述两亲性DNA纳米胶束加入H1、H2、H4和H5的混合液中形成反应溶液，再将待测目标物miRNA加入所述反应溶液中孵育，最后检测荧光响应强度。

作为优先的技术方案之一：所述孵育温度为35-40℃，时间为90-120min。

作为优先的技术方案之一：所述反应溶液中两亲性DNA纳米胶束、H1、H2、H4和H5的摩尔比为1:1:1:1:1。

4、一种两亲性DNA纳米胶束在肿瘤细胞内miRNA检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)所构建的DNA纳米胶束结构能够通过非共价作用快速组装，大大地缩短了DNA纳米结构的组装时间；

(2)所构建的DNA胶束作为新型的纳米载体，能够快速包裹大量相关的小分子，并提高固载容量；

(3)DNA纳米胶束中发夹结构的sp-H3赋予了其优良的特异性、精确性、以及可编码性，为实现对目标物的定性定量分析提供了潜在的基础；

(4)DNA纳米胶束对目标物miRNA的检测具有较高的灵敏度、优异的选择性和良好的重现性。

附图说明

图1为DNA纳米胶束无标记检测目标miRNA的原理示意图；

图2(A)为DNA纳米胶束对不同浓度的miRNA-21标准溶液的荧光响应曲线图，(B)为荧光信号响应强度值与miRNA-21浓度的对数的标准曲线图；

图3(A)为两亲性DNA纳米胶束对miRNA-21的响应敏感性结果图，(B)为细胞中miRNA-21的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

制备两亲性DNA纳米胶束

该实施例目标miRNA为miRNA-21

1)设计目标物miRNA-21的特异DNA发卡序列H1-H5(SEQ ID NO：1-5)，在H3发卡序列末端通过特异性化学偶联技术修饰疏水性的C12烷烃链(Spacer C12)₁₀，得到两亲性的DNA共聚物sp-H3；通过三价磷化学技术合成得到H1、H2、H4、H5和sp-H3的冻干粉。

2)具有发夹结构的两亲性DNA共聚物sp-H3分散液的制备，具体步骤如下：

首先将sp-H3冻干粉12000r/min条件下离心10min，然后将其溶解在含有Mg²⁺的TE缓冲液中，使其均匀分散，得到浓度为5nM的sp-H3溶液。再将sp-H3溶液分装到100μL的EP管中，置于PCR仪器中95℃下孵育10min，然后以0.5℃/min的速度降至25℃，保持10min，即可得到具有发夹结构的sp-H3的分散液。

3)两亲性DNA纳米胶束的制备：将苝加入获得的分散液中，苝与分散液中具有发夹结构的sp-H3的摩尔比为10:1，在功率为50W下超声5min，得到两亲性DNA纳米胶束。

实施例2

两亲性DNA纳米胶束对miRNA-21的无标记检测

DNA纳米胶束无标记检测miRNA-21(SEQ ID NO：6)的原理如图1所示，通过在亲水性的DNA末端修饰疏水性的C12烷烃链，得到两亲性的DNA共聚物sp-H3，将sp-H3形成发夹结构用于包裹脂溶性的染料苝，通过两者之间亲、疏水作用组装成稳定的DNA纳米胶束。在目标物miRNA-21存在下，引发DNA发夹H1和H2之间的催化发夹自组装反应(CHA)从而实现对微量目标物的循环利用，同时输出大量的H1-H中间体；该中间体又可以打开DNA纳米胶束上的sp-H3，裸露出sp-H3的粘性末端。进一步，sp-H3的粘性末端又可以引发H4和H5之间的杂交链式反应(HCR)，从而增强了DNA共聚物sp-H3的亲水性，导致DNA纳米胶束的稳定性被破坏，将胶束内部的荧光染料苝释放到有机相中，使水相中的荧光信号降低。在均相反应体系中，水溶液中荧光信号降低的强度与目标物miRNA-21浓度的对数值成正比。

1)miRNA-21标准曲线制作

将实施例1中制备的两亲性DNA纳米胶束加入H1，H2，H4和H5的混合液中形成反应溶液，反应溶液中两亲性DNA纳米胶束、H1、H2、H4和H5的摩尔比为1:1:1:1:1。通过基因合成技术获得miRNA-21冻干粉，将其配成浓度为1μM的母液，向反应溶液中分别加入该母液，使miRNA-21终浓度分别为0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、20nM，均在35℃下，孵育90min，待反应完成后，分别用移液枪吸取50μL水相溶液到石英比色皿中，用F-7000荧光分光光度计检测溶液中的荧光信号。荧光仪的激发波长为440nm，收集的发射光谱波长范围为465nm至615nm，狭缝宽度为10nm。结果如图2中A所示，随着目标物miRNA-21的浓度从0.02nM增加至20nM，溶液中的荧光信号逐渐降低；图2中B所示，荧光信号响应与miRNA-21浓度的对数有良好的线性相关性，其线性回归方程为：I＝-0.2032lg c_miRNA-21-0.4098，线性相关系数r＝0.9955；其中I＝(F-F₀)/F₀，F和F₀分别代表的是实验组和空白组的荧光响应强度。线性范围为20pM至20nM，检测限为6.9pM。

2)两亲性DNA胶束纳米对miRNA-21的响应敏感性

按照步骤1)的方法制得两亲性DNA纳米胶束、H1、H2、H4和H5混合的反应溶液，通过基因合成技术获得miRNA-155(SEQ ID NO：7)、miRNA-122(SEQ ID NO：8)、miRNA-182-5p(SEQ ID NO：9)、miRNA-141(SEQ ID NO：10)和miRNA-21的冻干粉，以miRNA-155、miRNA-122、miRNA-182-5p和miRNA-141作干扰miRNA，miRNA-21为检测目标miRNA，分别向反应溶液中加入上述miRNA的冻干粉，使得各种干扰miRNA的浓度为20nM，检测目标miRNA的浓度为2nM，再向另一反应溶液中同时加入以上所有miRNA冻干粉，其中各干扰miRNA浓度均为20nM，miRNA-21浓度为2nM，按照步骤1)中的条件进行孵育以及荧光信号检测。结果如图3中A所示，浓度均为20nM的干扰miRNA孵育后溶液的荧光响应不明显；而浓度为2nM的目标物miRNA-21孵育后溶液的荧光响应明显增强。同时，浓度均为20nM的干扰miRNA与浓度为2nM的miRNA-21共同孵育后，溶液的荧光响应强度与浓度为2nM miRNA-21孵育后溶液的荧光响应强度相比，变化不明显。这些结果证明了构建的两亲性DNA纳米胶束对目标物miRNA具有良好的响应敏感性。

3)两亲性DNA纳米胶束检测细胞中miRNA-21含量

按照步骤1)的方法制得两亲性DNA纳米胶束、H1、H2、H4和H5混合的反应溶液。培养MCF-7细胞和Hela细胞后，收集细胞并计数，细胞数为1×10⁶～1×10⁷个。用细胞RNA提取试剂盒(货号：RC101)分别提取细胞RNA，得到MCF-7和Hela细胞的RNA溶液。将两种RNA溶液按照细胞个数稀释为1×10³个/50μL、5×10³个/50μL、1×10⁴个/50μL、、5×10⁴个/50μL、和1×10⁵个/50μL，然后分别取10μL加入100μL反应溶液中，按照步骤1)的条件进行孵育以及荧光信号检测。结果如图3中B所示，随着MCF-7的细胞个数从1×10³增加1×10⁵，其荧光信号响应变化明显；然而随着Hela的细胞个数逐渐增加，其荧光信号响应变化较为缓慢，且整体响应的变化强度较低；从而表明miRNA-21在MCF-7细胞中的表达量相对于Hela细胞较高。该结果表明，所构建的两亲性DNA纳米胶束可以用于细胞裂解液中miRNA-21的检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种两亲性DNA纳米胶束及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaacatcag tctgataagc tacattggat gctctagctt atcagactg 49

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taagctagag catccaatgt agcttatcag actgcattgg atgctcacga cg 52

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgctcacga cctggacacg tcgtgagcat ccaatgtttt t 41

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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catagctgtc caggtcgtat gctcacgacc tggaca 36

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<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

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uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 7

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<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

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uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

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<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

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uggaguguga caaugguguu ug 22

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<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

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uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

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<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

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uaacacuguc ugguaaagau gg 22