一种top2a基因检测探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种top2a基因检测探针及其制备方法和应用 (TOP2A gene detection probe and preparation method and application thereof ) 是由 李怡 赵浩 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种TOP2A基因检测探针及其制备方法和应用。分别选择TOP2A基因区域与17号染色体着丝粒区域作为目标基因,根据目标基因设计并筛选得到目的探针,对目的探针进行扩增得到扩增产物,扩增产物经转录、反转录后得到单链DNA探针,单链DNA探针进行荧光标记得到针对TOP2A基因区域的TOP2A单链探针与针对17号染色体着丝粒区域的对照单链探针。制得的TOP2A单链探针与对照单链探针为线性的单链DNA,单链DNA能够减少探针自身的配对,可以在保证特异性的情况下更加快速的与靶向序列结合,缩短杂交时间。(The invention provides a TOP2A gene detection probe and a preparation method and application thereof. Respectively selecting a TOP2A gene region and a No.17 chromosome centromere region as target genes, designing and screening according to the target genes to obtain target probes, amplifying the target probes to obtain amplification products, transcribing and reversely transcribing the amplification products to obtain single-stranded DNA probes, and carrying out fluorescent labeling on the single-stranded DNA probes to obtain a TOP2A single-stranded probe aiming at the TOP2A gene region and a control single-stranded probe aiming at the No.17 chromosome centromere region. The prepared TOP2A single-stranded probe and the contrast single-stranded probe are linear single-stranded DNA, the single-stranded DNA can reduce the pairing of the probes, and can be combined with a target sequence more quickly under the condition of ensuring specificity, so that the hybridization time is shortened.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TOP2A基因检测探针及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是妇女中常见的恶性肿瘤之一，近年来，在我国的发病率呈直线上升的趋势。临床研究表明，TOP2A基因异常(包括TOP2A基因扩增或者TOP2A基因缺失的情况)的乳腺癌患者的无复发生存期(Recurrence-free survival，RFS)缩短，预后差，尤其是TOP2A基因缺失的乳腺癌患者预后更差。但是，TOP2A基因异常的患者接受蒽环类药物的化疗方案效果要优于TOP2A基因正常的患者。TOP2A基因扩增的患者使用环磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶(Cyclophosphamide+Epirubicin+Fluorouracil，CEF)方案进行治疗可降低61％的复发风险和51％的死亡风险，而TOP2A基因没有扩增的患者使用CEF方案只能降低6％的复发风险和10％的死亡风险。因此，检测乳腺癌患者中TOP2A基因的状态有助于判断预后以及指导临床合理用药，对于治疗乳腺癌具有显著帮助。
目前商业化的TOP2A基因荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)检测探针主要使用细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)或者PCR产物经过荧光分子标记后作为探针。由于BAC和PCR产物探针存在一些非特异性序列，使得荧光原位杂交探针的特异性不高，信号背景偏高，并且现有的荧光原位杂交探针的片段通常偏大，使其杂交效率偏低，杂交时间长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TOP2A基因检测探针及其制备方法和应用，制得的TOP2A基因检测探针可用于高特异性和高准确性检测TOP2A基因异常的情况。
为实现以上目的，本发明第一方面提供一种TOP2A基因检测探针的制备方法，所述TOP2A基因检测探针包括针对TOP2A基因区域的TOP2A单链探针与针对17号染色体着丝粒区域的对照单链探针；
所述TOP2A单链探针的制备方法包括如下步骤：
选择TOP2A基因区域作为TOP2A目标基因，针对所述TOP2A目标基因设计长度为100nt-300nt的单链片段作为TOP2A单链候选探针，去除与所述TOP2A目标基因非特异性杂交且重叠的TOP2A单链候选探针，得到TOP2A目的探针，对筛选得到的所述TOP2A目的探针的上下游设计TOP2A扩增引物片段；
扩增所述TOP2A目的探针得到TOP2A扩增产物，所述TOP2A扩增产物构成TOP2A目的探针文库；
对所述TOP2A扩增产物进行体外转录制得与所述TOP2A目的探针文库对应的TOP2ARNA文库；
所述TOP2A RNA文库进行反转录制备得到TOP2A单链DNA探针，对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记得到荧光标记的TOP2A单链探针；
所述对照单链探针的制备方法包括如下步骤：
选择17号染色体着丝粒重复区域作为对照基因，针对所述对照基因设计长度为206nt的单链片段作为对照目的探针，对所述对照目的探针的上下游设计对照扩增引物片段；
扩增所述对照目的探针得到对照扩增产物，所述对照扩增产物构成对照探针；
对所述对照扩增产物进行体外转录制得与所述对照探针对应的对照探针RNA；
所述对照探针RNA进行反转录制备得到对照单链DNA探针，对所述对照单链DNA探针进行荧光标记得到荧光标记的对照单链探针。
作为上述技术方案的进一步改进，所述扩增所述TOP2A目的探针得到TOP2A扩增产物具体包括如下步骤：
使用PCR扩增的方法扩增所述TOP2A目的探针；
将扩增后的所述TOP2A目的探针连接至质粒；
以质粒为模板扩增得到所述TOP2A扩增产物；
所述扩增所述对照目的探针得到对照扩增产物具体包括如下步骤：
使用PCR扩增的方法扩增所述对照目的探针；
将扩增后的所述对照目的探针连接至质粒；
以质粒为模板扩增得到所述对照扩增产物。
作为上述技术方案的进一步改进，在所述TOP2A RNA文库进行反转录制备得到TOP2A单链DNA探针的步骤中，包括向反应体系中加入氨基dNTP进行探针标记的步骤，得到的TOP2A单链DNA探针标记有氨基；
在所述对照探针RNA进行反转录制备得到对照单链DNA探针时的步骤中，包括向反应体系中加入氨基dNTP进行探针标记的步骤，得到的对照单链DNA探针标记有氨基。
作为上述技术方案的进一步改进，所述TOP2A扩增引物片段包括TOP2A上下游扩增引物对，所述TOP2A上下游扩增引物对的序列包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的序列。
作为上述技术方案的进一步改进，所述对照扩增引物片段包括对照上下游扩增引物对，所述对照上下游扩增引物对的序列包括如SEQ ID NO.53所示的序列和如SEQ IDNO.54所示的序列。
作为上述技术方案的进一步改进，所述对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记得到TOP2A单链探针的步骤中，使用第一荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基标记的TOP2A单链DNA探针反应，从而对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记得到荧光标记的TOP2A单链探针。
作为上述技术方案的进一步改进，所述对所述对照单链DNA探针进行荧光标记得到对照单链探针的步骤中，使用第二荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基标记的对照单链DNA探针反应，从而对所述对照单链DNA探针进行荧光标记得到荧光标记的对照单链探针。
本发明第二方面提供一种TOP2A基因检测探针，使用如上所述的TOP2A基因检测探针的制备方法制备得到。
本发明第三方面提供一种TOP2A基因检测芯片，含有如上所述的TOP2A基因检测探针。
本发明第四方面提供一种TOP2A基因检测试剂盒，含有如上所述的TOP2A基因检测探针。
本发明的有益效果：
本发明提供一种TOP2A基因检测探针及其制备方法和应用。通过针对基因组非重复区设计探针序列并进行筛选得到目的探针，可以降低非特异性反应，减少背景信号干扰；对目的探针进行扩增、转录、反转录后得到单链DNA探针，单链DNA探针进行荧光标记制得的单链探针为线性的小片段单链DNA，小片段单链DNA能够减少探针自身的配对，可以在保证特异性的情况下更加快速的与靶向序列结合，缩短杂交时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为本发明实施例提供的TOP2A基因检测探针用于检测TOP2A基因异常的检测结果示意图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
本发明提供一种TOP2A基因检测探针的制备方法，制备得到的TOP2A基因检测探针包括针对TOP2A基因区域的TOP2A单链探针与针对17号染色体着丝粒区域的对照单链探针。
本发明的一个实施方式提供一种TOP2A单链探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：选择TOP2A基因区域作为TOP2A目标基因，根据TOP2A目标基因设计TOP2A单链候选探针，去除与TOP2A目标基因非特异性杂交且重叠的TOP2A单链候选探针得到TOP2A目的探针，对筛选得到的TOP2A目的探针的上下游设计TOP2A扩增引物片段。
在上述步骤1中，选择TOP2A基因区域作为TOP2A目标基因，根据TOP2A目标基因设计TOP2A单链候选探针的具体步骤为：选择TOP2A基因区域作为TOP2A目标基因，对TOP2A目标基因设计40个长度为100nt-300nt的单链片段作为TOP2A单链候选探针，每个TOP2A单链候选探针的长度例如可以是100nt、200nt、300nt等。
上述，通过间隔预设长度设计TOP2A单链候选探针，可以避免探针之间相互干扰，有利于提高检测结果的准确性。每个TOP2A单链候选探针的片段小，可以在保证特异性的情况下更加快速的与靶向序列结合，缩短杂交时间。
去除与TOP2A目标基因非特异性杂交且重叠的TOP2A单链候选探针得到TOP2A目的探针的具体步骤为：通过BLAST比对，去除位于TOP2A基因重复区域的TOP2A单链候选探针，通过打分去除非特异Tm值在75-85℃之间的TOP2A单链候选探针，并选择非重叠的TOP2A单链候选探针作为TOP2A目的探针，最终得到26个TOP2A目的探针。
对筛选得到的TOP2A目的探针的上下游设计TOP2A扩增引物片段的步骤中，所述TOP2A扩增引物片段包括TOP2A上下游扩增引物对，其中上游扩增引物设计有T7启动子序列，下游扩增引物设计有特异的RT引物结合序列。
所述TOP2A上下游扩增引物对的序列包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的序列。
步骤2.扩增所述TOP2A目的探针得到TOP2A扩增产物，所述TOP2A扩增产物构成TOP2A目的探针文库。
具体的，本实施方式具体包括如下步骤：
使用PCR扩增的方法扩增TOP2A目的探针；
将扩增后的所述TOP2A目的探针连接至质粒；
以质粒为模板扩增得到TOP2A扩增产物，TOP2A扩增产物构成TOP2A目的探针文库。
在本实施方式中，对TOP2A目的探针首先经过PCR扩增，经PCR扩增后的TOP2A目的探针经T-A克隆连接至质粒，再以质粒为模板扩增得到TOP2A扩增产物，TOP2A扩增产物构成TOP2A目的探针文库。通过上述方式能够避免存在非特异性的扩增，得到的TOP2A扩增产物纯度高。
步骤3.对所述TOP2A扩增产物进行体外转录制得与所述TOP2A目的探针文库对应的TOP2A RNA文库；
所述TOP2A RNA文库进行反转录制备得到TOP2A单链DNA探针，对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记得到TOP2A单链探针。
上述，在对所述TOP2A RNA文库进行反转录，制备TOP2A单链DNA探针时，包括向反应体系中加入氨基(Amino)dNTP进行探针标记的步骤，得到的TOP2A单链DNA探针标记有氨基。在一个具体的实施例中，是使用氨基dUTP(Amino-dUTP)进行探针标记，在其他实施例中，不限于使用氨基dUTP进行标记，也可以使用氨基dCTP、氨基dGTP等进行标记。
对应的，在对制备的TOP2A单链DNA探针进行荧光标记时，使用第一荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS ester)与氨基标记的TOP2A单链DNA探针反应，从而对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记。在本实施方式中，第一荧光染料选用绿色荧光染料AlexaFluor 488。当然，在其他实施方式中，也可选用其他颜色的荧光染料。
Alexa Fluor 488能发出明亮的绿色荧光，光谱与荧光素相似，在pH4至pH10之间稳定。可被488nm光激发产生信号稳定的荧光，常作为一种细胞标记物偶联到抗体、多肽、蛋白、示踪剂和其他底物上，广泛用于细胞成像和检测。Alexa Fluor 488NHS Ester，即含N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基团的Alexa Fluor 488，可直接与生化分子上的氨基(-NH2)反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺，可用于标记任何含伯胺的蛋白、多肽、氨基修饰的寡核苷酸或者其他含氨基的生物分子。
可以理解的是，上述通过反转录掺入氨基-dNTP，然后偶联标记有N-羟基琥珀酰亚胺酯的第一荧光染料，可以增加每个TOP2A单链探针标记的荧光数目，从而增加荧光原位杂交时的荧光强度，提高检测结果的准确性和可靠性。
上述，对所述TOP2A目的探针首先经过PCR扩增，经PCR扩增后的TOP2A目的探针经T-A克隆连接至质粒，再以质粒为模板扩增得到TOP2A扩增产物，TOP2A扩增产物转录构建TOP2A RNA文库，再由TOP2A RNA文库反转录得到TOP2A单链DNA探针，TOP2A单链DNA探针进行荧光标记后得到TOP2A单链探针，相比于传统的直接使用BAC(Bacterial ArtificialChromosome)或者PCR扩增得到的双链DNA作为探针，通过本实施方式制得的TOP2A单链探针为线性的单链DNA，单链DNA能够减少探针自身的配对，且可以更加快速的与靶向序列结合，减少杂交时间。
本发明的另一个实施方式提供一种对照单链探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤1’.针对17号染色体着丝粒重复区域，对所述对照基因设计一个长度为206nt的单链片段作为对照目的探针，对所述对照目的探针的上下游设计对照扩增引物片段。
上述，所述对照扩增引物片段包括对照上下游扩增引物对，在一个具体实施例中，上游扩增引物设计有T7启动子序列，下游扩增引物设计有特异的RT引物结合序列，所述对照上下游扩增引物对的序列包括如SEQ ID NO.53所示的序列和SEQ ID NO.54所示的序列，其中SEQ ID NO.53所示的序列为上游扩增引物的序列，SEQ ID NO.54所示的序列为下游扩增引物的序列。
步骤2’.扩增所述对照目的探针得到对照扩增产物，对照扩增产物构成对照探针。
具体的，本实施方式具体包括如下步骤：
使用PCR扩增的方法扩增所述对照目的探针；
将扩增后的所述对照目的探针经T-A克隆连接至质粒；
以质粒为模板扩增得到所述对照扩增产物，对照扩增产物构成对照探针。
步骤3’.对所述对照扩增产物进行体外转录制得与所述对照探针对应的对照探针RNA；
所述对照探针RNA进行反转录制备得到对照单链DNA探针，对所述对照单链DNA探针进行荧光标记得到对照单链探针。
上述，在对所述对照探针RNA进行反转录，制备对照单链DNA探针时，包括向反应体系中加入氨基(Amino)dNTP进行探针标记的步骤，得到的对照单链DNA探针标记有氨基。在一个具体的实施例中，是使用氨基dUTP(Amino-dUTP)进行探针标记，在其他实施例中，不限于使用氨基dUTP进行标记，也可以使用氨基dCTP、氨基dGTP等进行标记。
对应的，在对制备的对照单链DNA探针进行荧光标记时，使用标记有N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS ester)的第二荧光染料与氨基标记的对照单链DNA探针反应，从而对所述对照单链DNA探针进行荧光标记。在本实施方式中，第二荧光染料选用红色荧光染料AlexaFluor 594。当然，在其他实施方式中，所述第二荧光染料也可选用其他颜色且与第一荧光染料颜色不同的荧光染料。
通过上述制备方法制备得到的TOP2A基因检测探针包括针对TOP2A基因区域的TOP2A单链探针与针对17号染色体着丝粒区域的对照单链探针。
制备得到的TOP2A单链探针与对照单链探针均为线性的小片段单链DNA，可以在保证特异性的情况下更加快速的与靶向序列结合，缩短杂交时间。
将制备得到的TOP2A基因检测探针用于检测TOP2A基因异常时，原理为：由于每条17号染色体均有两个姐妹染色单体，每个姐妹染色单体上都有一个TOP2A基因，在两个姐妹染色单体没有分离的情况下，TOP2A基因与17号染色体着丝粒的比值为2，在两个姐妹染色单体完全分离的情况下，TOP2A基因与17号染色体着丝粒的比值为1，因此可通过TOP2A基因与17号染色体着丝粒的比值来判断TOP2A基因的扩增和缺失情况。对照单链探针可以作为TOP2A单链探针的对照探针，用于判断17号染色体的扩增情况；对照单链探针用于判断TOP2A基因的扩增情况。
由于TOP2A单链探针带有绿色荧光基团，对照单链探针带有红色荧光基团，因此可通过绿色荧光信号与红色荧光信号的比值来判断TOP2A基因的扩增和缺失情况，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值大于2时，表明TOP2A基因发生了扩增，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值小于1时，表明TOP2A基因发生了缺失，当绿色荧光信号与红色荧光信号的比值在1-2之间时，表示TOP2A基因正常。
此外，本发明还提供一种TOP2A基因检测探针，包括TOP2A单链探针与对照单链探针，所述TOP2A单链探针与所述对照单链探针使用如上所述的TOP2A基因检测探针的制备方法制备得到。
本发明进一步提供一种TOP2A基因检测芯片，含有如上所述的TOP2A基因检测探针。
更进一步的，本发明还提供一种TOP2A基因检测试剂盒，含有如上所述的TOP2A基因检测探针。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
选择TOP2A基因区域作为TOP2A目标基因，每隔3bp设计一个TOP2A单链候选探针，每个TOP2A单链候选探针的长度为200nt，设计得到40个TOP2A单链候选探针；通过BLAST比对，去除位于TOP2A基因重复区域的TOP2A单链候选探针，通过打分去除非特异Tm值在75-85℃之间的TOP2A单链候选探针，并选择非重叠的TOP2A单链候选探针作为TOP2A目的探针，共得到26个TOP2A目的探针，26个TOP2A目的探针的序列如SEQ ID NO.55-80所示。对筛选得到的26个TOP2A目的探针的上下游设计TOP2A扩增引物片段。TOP2A扩增引物片段的序列如SEQID NO.1-52所示。TOP2A扩增引物片段与对应的TOP2A目的探针具体见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示上游引物片段与下游引物片段，其他以此类推)。
表1.TOP2A扩增引物片段与对应的TOP2A目的探针
使用PCR对所述TOP2A目的探针进行扩增得到PCR产物。
建立PCR反应：
纯化PCR产物：合并PCR产物，加入1ml丁醇，混匀；再加入400μl Orange-DX，混匀；离心2min，除去上层有机相，水相过柱子结合。经过洗液洗涤三次后，使用100μl洗提液洗提。使用Nanodrop定量PCR产物。
分别将26个PCR产物DNA片段经T-A克隆链接至pFB-19T质粒载体。测序确认。
然后以pFB-19T质粒为模板再经PCR扩增得到TOP2A扩增产物。建立PCR反应：
纯化PCR产物：合并PCR产物，加入1ml丁醇，混匀；再加入400μl Orange-DX，混匀；离心2min，除去上层有机相，水相过柱子结合。经过洗液洗涤三次后，使用100μl洗提液洗提。使用Nanodrop定量PCR产物。
每个TOP2A扩增产物的片段按相同摩尔数构成TOP2A目的探针文库。
建立以下体外转录反应体系，进行体外转录制得与所述TOP2A目的探针文库对应的TOP2A RNA文库：
在PCR仪上进行反应，反应温度为37℃，反应4h后结束得到RNA。使用QiagenRNeasy Mini试剂盒纯化RNA，获得42μg RNA用于下一步反应。
对上述制备得到的42μg RNA进行反转录制备得到TOP2A单链DNA探针；
在冰上准备以下反应：
混匀，置于PCR仪上进行65℃变性5min，迅速放置冰上。
准备以下反应混合液：
50℃反应2h，补加入2.5μl SuperScript III RT，继续反应2h。加入11μlExonuclease I buffer和2μl Exonuclease I，混悬5s，离心5s。37℃消化15min。加入12μl0.5M EDTA，混匀。85℃5min灭活反转录酶。反应置于冰上。
消化RNA：加入4μl 5U/μl的RNaseH和4μl 10mg/ml的RNaseA，按照以下程序进行反应：
使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应得到50μlTOP2A单链DNA探针。
对所述TOP2A单链DNA探针进行荧光标记得到TOP2A单链探针:
50μl纯化后的TOP2A单链DNA探针加入5μl 3M NaAc，混匀，加入130μl 100％乙醇，混匀，置于-20℃过夜。
乙醇沉淀：4℃离心30min，去除上清，使用70％乙醇洗涤一次。
探针荧光偶联反应：干燥沉淀DNA，溶解在5μl水中。
室温避光反应2h。
加入40μl纯水，使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应得到针对TOP2A基因区域的TOP2A单链探针。
使用Nanodrop检测TOP2A单链探针浓度和荧光。分装备用。
实施例2
选择17号染色体着丝粒区域作为对照基因，对所述对照基因设计一个长度为206nt的单链片段作为对照目的探针，对所述对照目的探针的上下游设计对照扩增引物片段。
对照扩增引物片段的序列如SEQ ID NO.53-54所示，其中SEQ ID NO.53所示的序列为上游扩增引物，SEQ ID NO.54所示的序列为下游扩增引物。对照目的探针的序列如SEQID NO.81所示。
使用PCR对所述对照目的探针进行扩增得到PCR产物。
建立PCR反应：
纯化PCR产物：合并PCR产物，加入1ml丁醇，混匀；再加入400μl Orange-DX，混匀；离心2min，除去上层有机相，水相过柱子结合。经过洗液洗涤三次后，使用100μl洗提液洗提。使用Nanodrop定量PCR产物。
将PCR产物DNA片段经T-A克隆链接至pFB-19T质粒载体。测序确认。
然后以pFB-19T质粒为模板再经PCR扩增得到对照扩增产物。建立PCR反应：
纯化PCR产物：合并PCR产物，加入1ml丁醇，混匀；再加入400μl Orange-DX，混匀；离心2min，除去上层有机相，水相过柱子结合。经过洗液洗涤三次后，使用100μl洗提液洗提。使用Nanodrop定量PCR产物。
对照扩增产物构成对照探针。
建立以下体外转录反应体系，进行体外转录制得与所述对照探针对应的对照探针RNA：
在PCR仪上进行反应，反应温度为37℃，反应4h后结束得到RNA。使用QiagenRNeasy Mini试剂盒纯化RNA，获得42μg RNA用于下一步反应。
对上述制备得到的42μg RNA进行反转录制备得到对照单链DNA探针；
在冰上准备以下反应：
混匀，置于PCR仪上进行65℃变性5min，迅速放置冰上。
准备以下反应混合液：
50℃反应2h，补加入2.5μl SuperScript III RT，继续反应2h。加入11μlExonuclease I buffer和2μl Exonuclease I，混悬5s，离心5s。37℃消化15min。加入12μl0.5M EDTA，混匀。85℃5min灭活反转录酶。反应置于冰上。
消化RNA：加入4μl 5U/μl的RNaseH和4μl 10mg/ml的RNaseA，按照以下程序进行反应：
使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应得到50μl对照单链DNA探针。
对所述对照单链DNA探针进行荧光标记得到对照单链探针：
50μl纯化后的对照单链DNA探针加入5μl 3M NaAc，混匀，加入130μl 100％乙醇，混匀，置于-20℃过夜。
乙醇沉淀：4℃离心30min，去除上清，使用70％乙醇洗涤一次。
探针荧光偶联反应：干燥沉淀DNA，溶解在5μl水中。
室温避光反应2h。
加入40μl纯水，使用Zymo Quick-RNA Miniprep试剂盒纯化反应得到针对TOP2A基因区域的对照单链探针。
使用Nanodrop检测对照单链探针浓度和荧光。分装备用。
验证实验
FISH检测：
准备工作：准备盖玻片和载玻片，并用75％酒精擦拭盖玻片和载玻片；金属块85度预热；水浴锅50℃预热；准备37℃烘箱；准备金属材质且不透光的湿盒；配制150ml 2×柠檬酸钠缓冲液，1ml 4×柠檬酸钠缓冲液，50ml 0.4×柠檬酸钠缓冲液。整个实验过程都需要注意避光。
待检测样品预处理：待检测样品为HL60细胞系，使用PBS缓冲液制备成细胞悬浮液，用移液器吸取10μl细胞悬浮液滴加在载玻片上，室温晾至标本边缘已干但是中间还没有干透时滴加固定剂25μl，固定剂干之后得到切片用于后续实验。
混合探针：取通过上述实施例1的制备方法制得的26个TOP2A单链探针，其序列如SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.80所示，混合后溶解于纯水中，浓度为200ng/μl；取通过上述实施例2的制备方法制得的对照单链探针，其序列如SEQ ID NO.81所示，探针溶解于纯水中，浓度为200ng/μl。将15μl杂交液、0.5μl 26个TOP2A单链探针和0.5μl对照单链探针进行混合，充分混匀，避免气泡产生，混匀后离心。所述杂交液为2×柠檬酸钠缓冲液。
其中，所述TOP2A单链探针连接的荧光基团为绿色荧光基团，所述对照单链探针连接的荧光基团为红色荧光基团。
变性杂交：取15μl混合探针的杂交液轻轻滴加到样品上，枪头不要接触玻片，避免产生气泡，如有较大气泡需用枪吸走，小气泡无影响，盖玻片轻轻从一侧缓慢盖住杂交液。待杂交液均分铺开后用封片胶封片，玻片周围需全部封住，勿遗留缺口，如有未封住的缺口则继续补加封片胶。待封片胶干燥呈完全透明状态后，将玻片置于85℃金属块上8min，加盖避光。
玻片洗涤：在湿盒内垫5层吸水纸，用去离子水湿润，吸水纸上放入一塑料盒，用于隔开玻片与吸水纸。在一个片缸中加入30-40ml 2×柠檬酸钠缓冲液，放入50℃水浴锅预热。在另一个片缸中加入常温30-40ml 2×柠檬酸钠缓冲液。
8min变性完毕后迅速将玻片放入湿盒，并将湿盒放入37℃烘箱孵育2h，然后取出玻片，揭开封片胶。在玻片周围滴加200μl 4×柠檬酸钠缓冲液，等待3min后，轻轻揭去盖玻片，揭片过程避免左右滑动损伤细胞。倒掉玻片上的4×柠檬酸钠缓冲液，将玻片***水浴锅50℃预热的片缸中放置5min。5min后将玻片转移至常温片缸中放置5min。5min后再将玻片转移至常温片缸中放置5min。
取出玻片在0.4×柠檬酸钠缓冲液中轻轻荡洗6s，取出玻片，直立于吸水纸上，除去0.4×柠檬酸钠缓冲液，擦镜纸轻轻擦除细胞周围的0.4×柠檬酸钠缓冲液，并用75％酒精擦洗盖玻片，擦干。
复染：向玻片上的杂交区域滴加一滴复染液，轻轻从一侧盖住盖玻片，切忌反复移动盖玻片。等待2min后，待复染液均匀铺开，用指甲油封片，先封住四角，常温放置1h后封住余下部分。
FISH结果观察：封片20min后使用荧光显微镜对玻片上的杂交区域进行观察。
结果如图1所示，从图1中可看出，本发明的检测TOP2A基因异常的探针可以与目的序列稳定结合并产生荧光信号，图1中，绿色荧光信号与红色荧光信号的数量比值为1，即TOP2A基因没有发生扩增或缺失的情况。检测结果可靠准确，特异性高，检测时间大大缩短，为后期临床应用提供可能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州简册生物技术有限公司
<120> 一种TOP2A基因检测探针及其制备方法和应用
<130> 2019
<160> 81
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 48
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<213> 人工合成
<400> 1
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cgtggtcgcg tctcacaatc ccagcacttt gggaggcta 39
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cgtggtcgcg tctcacactt gaggccagga gttctgg 37
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cgtggtcgcg tctcatacag gcgtgagcca ctacg 35
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cgtggtcgcg tctcactcat gacgttgtga tctgcccga 39
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gtaatacgac tcactatagg gagaagatac tggcatctag tggca 45
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cgtggtcgcg tctcatgact gggatgacag ctgaa 35
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cgtggtcgcg tctcatcccg gtatacaggc aagtc 35
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cgtggtcgcg tctcaagctc acagcaacat ctgcctc 37
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cgtggtcgcg tctcaacttc tgccttctgg gttcaagca 39
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cgtggtcgcg tctcatgctg ggattatagg tgtgagcca 39
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cgtggtcgcg tctcacaagg tcaggagttt gagaccagc 39
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cgtggtcgcg tctcatgctg ggattacagg cataagc 37
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cgtggtcgcg tctcacatgg tggtgcgtgc ctgta 35
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cgtggtcgcg tctcagcacc tagcaaagta cctggca 37
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cgtggtcgcg tctcaaaggc caactcttcc attgcccaa 39
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cgtggtcgcg tctcaacttg gcacataaga ggctgagtg 39
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ggaggccgga gaattgtaat acgactcact atagggagac actctgtggc cttcgttc 58
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cgtggtcgcg tctcagcagt tatcccgttt ccaac 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
aaacgaagct aaggctccca ttcccctcgc taacaacgtc agaacagagg acagttttta 60
gatttcaggg atcttaaata gattggcagt tcctggagaa taaacatcct ttgcttttct 120
cctgcacact tttgcctcag gccacccctt cccgcttcca aagcccatct cttccaagct 180
ttccgcacga gaaaacaagt gagc 204
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 56
agtccgttgg tcccgtagtg gatccatgtt acagcggccc gggtgcgacg ttattgagtc 60
gcgcgtacag atgctttccc ctcctgcccg ctgcttgaaa acggtcttga atgtccccga 120
tcttggaaag ggcagagcct agcacagtgt ttctctggag cagctggcca gcttacaaaa 180
gcgccccctt cctgagttca caacgctcag gtggccaa 218
<210> 57
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
gggtttacga tgaagatgtt ggcattaact atagggaagt cacttttgtt cctggtttgt 60
acaaaatctt tgatgagatt ctaggtgagt aaatccttta atataaagat ctggtcaaat 120
ctttcataag aagtatcatt ccaaataaaa atttaaaaaa gataaaagta aaaacaaaaa 180
gtatcatttc taccaaacct gctgtagcca gg 212
<210> 58
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
tgcagtggca tgatctcggc tcaccgcaac atccacctcc tgggttcaag caattctcct 60
gcctcagcct ccagagtagc tgggattaca ggcgcacacc accacacctg gctaattttg 120
tatttttttt agtagagatg gggtttctgc atgttggtca ggctggtctc gaactcctga 180
cctcaagtga tctgcctgcc ttagcctccc aaagtgctgg gattg 225
<210> 59
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
cccaggagta gtttgagacc agcctgggcc atatagtgag accctcatct ctacaaaaaa 60
tttaaaaatt agccaggtgt ggtgatggac acctgtagtc ccagctattc aggaggctga 120
agtgggagga ttgcttgagc ccaggaggtc aagactgcag taagctgtga tcctgccatt 180
acactgcagc ctgggtgaca gagcgagatg ctgtctca 218
<210> 60
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
aagcatggtg ggaaatgttc ctgctgaatt tcagaaggta tatatgaaaa gtgccaaaaa 60
aattgagggc tgggtatggt ggctcacatc tataacccca acactttgag cagttctcct 120
gcttcagcct cccaagtagc tggaatcaca ggcatgcgct accatgcctg gctaattttt 180
tttattttta gtagagacgg tttcaacatg ttggccagaa ctcctggcct caagtg 236
<210> 61
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 61
tgagacagag tctcacactg ttgcccgggc tggagtgcag tggcacgatc tcggctcacc 60
gcaacctcca cctcccaggt tcacgcaatt ctcctgcctc agcctcccaa gtagctggga 120
ttacaggtgc ctgccaccac acctggctaa ttttttgtat ttttagtaga gacaggtttc 180
actatgttgg ccaggctggt ctcgaacacc agacctcatg a 221
<210> 62
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 62
agcacatcag gtatgtgctt ttggcagttt tctttttcta aagtcaagga agaagagaaa 60
ggctataaat aaagcatgag tacattttta gtggcttaat atcaacttct attgcaggtg 120
aaaaatcaca tgtggatttt tgtaaatgcc ttaattgaaa acccaacctt tgactctcag 180
acaaaagaaa acatgacttt acaacccaag agctttggat caacatgcc 229
<210> 63
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 63
tgacttccac tcagggaaag tccaaattcc ataatttggc caacaagaaa gatctgctgt 60
aatctaatta cacctacttc tccaactcat ctcagtgcca gtttttcgta tattgtcctg 120
ttgcttttaa attactgaaa agcacagtgc tcttcccctc ctcagagttt attcacatgc 180
taatccctct gcatgaaata catccttttc acctggctac tttaggtctt gtcc 234
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
acctggctac tttaggtctt gtcctttcct caggaaagcc tttactttct acccttcccc 60
ccacctaagt tggttccaat ataatattga acatacctta ttagcaaact ttttgcttat 120
ccataacact tataacactg taacttattt tatttctgtc ttttttttta ggcagagtct 180
cgctctgtcg cccaggctgg aatgcagtgg cacgatc 217
<210> 65
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 65
ttggcctcct aaagtgctgg gattataggc gtgagccacc gtgcctggtc taatttgttt 60
taaccactat atctccaaca agtagctcag tgctagcaca atataattat atagtaaata 120
tttattgaac gaatgaacca aaaggagcag ctccctcagt ggtgataacc tgacatggga 180
agatgtgcca cc 192
<210> 66
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 66
ccagtaagca tatcccagag aaggaatcag atattttaga aaattttgat ttttggctgg 60
gcttggtggc tcatgcctat aattctagga ctttgggagg ccaaggcagg tggatcacct 120
gagatcaaga gttggagacc aacctgtcca acatggtgaa accccctctc tactaaaaat 180
acgaaaattg gccgagcgta gtggctcacg cctgta 216
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 67
tagtcccagc tacttgggaa gctgaggcag gagaatcgct tgaacccgag aggcagaggt 60
tgcagtgagc cgagatcagg ccactgctct ccagcctggg caacagagtg agactccatc 120
tcaaaaaaaa aggaaaaagg ccaggcgtgg tggctcacgc ctgtaatgcc agtactttgg 180
aaggctaagt cgggcagatc acaacgtcat gag 213
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 68
agatactggc atctagtggc agaggccagg ggtgaggctt atacaggaaa gcccccccat 60
aacaattatc cagtgcaaca tgtcaattat gctaaggttg agaaatcctg atgtagagct 120
tgggactgag taaaggagac tttgattctt cctaaatatc acaattgaaa ttttactcct 180
ttacaagcct atggaaagta tattatgaat ggtcaatttt cagctgtcat cccagtca 238
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 69
gagatgatgt ttccttgact gagcatcttg agaaatcaag atttagttga caattagaca 60
tgaggagaat agagagctag aagaccttgc ataaactgat tgaccaagag aatagataca 120
ctaatcatgt ctacaggaac agaaaataaa agagacagag aagagataat aaatctgatg 180
gtaaaaaaaa aaaaaggcag gaagattacg aatggcttc 219
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gcctgtaatc tcagcacttg agctggggag gtcaaggctg cagtgagcct aggtagtgcc 60
actgcactcc agcctggaca caagagtgag agagaccctg tctccaaaaa aaaatgattt 120
gatcatatat gatttgactg cccccttgtg gtaatttaca tttgtcaatg gtttagggag 180
acttgcctgt ataccggga 199
<210> 71
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 71
acaatcccag cactttggga ggccgaagca ggcagatcac ctgaggttgg gagttcgaga 60
ccagcctgac caacatggag aaaccctgtc tctactaaaa ttgcaaaatt agccaggcgt 120
agtggcacat gcctgtaatc ccagctactt gggaggctga ggcaggagaa tcacttgaac 180
tcgggaggca gatgttgctg tgagct 206
<210> 72
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 72
ctcatgcctg taatcccagc actctgggag gctgaggtgg gcagatcact tgaggtcagg 60
agttcgagac cagcctggac aacatggtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaatt 120
agttgggtgt ggtggcatcc gcctgtaatc ccagctactc aggaggttga ggcaagaaaa 180
ttgcttgaac ccagaaggca gaagt 205
<210> 73
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 73
tctgtaggct gttgaagcca aggaaaaaca agatgaacaa gtcggacttc ctgggaaagg 60
ggggaaggcc aaggggaaaa aaacacaaat ggctgaagtt ttgccttctc cgcgtggtca 120
aagagtcatt ccacgaataa ccatagaaat gaaagcagag gcagaaaaga aaaataaaaa 180
gaaaattaag gtaatactct tgtggtggct cacacctata atcccagca 229
<210> 74
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 74
cttgttgccc aggctggagt gcaatagcac aatctcggct cactgcaatc ttcacctcct 60
gggttcaagc gattctcctg cctcagcttc ctgagtagct gggattatag gtgcatgcca 120
ccacgcctgg ctgctttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccatg ttagtcaggc 180
tggtctcaaa ctcctgacct tg 202
<210> 75
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 75
gagttcaaca tcatgcttcg gatataaata atgtccactc aatgaactaa atagaattaa 60
taattctgtt aatcatttga taatgccttt actgtctact ttttttgaaa catctttatt 120
gagatattca catgccaaat ttgcccattt aacgtatacc atttggctgg gcgccatggc 180
ttatgcctgt aatcccagca 200
<210> 76
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 76
agggtaaccc atgtggcagc ccatatatta gtacttcatt cttttttttt tttttttttt 60
gaggcagagt ttcgctctgt cgcccaggct ggcatgcagt atgcagtagt agtgagatct 120
cggctcactg caacctccgc ctgctaggtt caggcaattc tcctgcctca gcctcccgag 180
gagctgggat tacaggcacg caccaccatg 210
<210> 77
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 77
tccctagtgg ctggaaccac aggcgcactc caccatgccc attaatttct gtattttttg 60
tagagatggg gttttgccat gttgaccagg ctggtcttta gctcctgagc tcaagcgatc 120
cgcctacctc accctcccaa agtgctgaga ttacaggtgt gagccaccgc acccagccaa 180
gacagggtct 190
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<211> 210
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 78
gtagtgagac atctgcctta ctgggacact cagatccaac tgggttctaa tcctggctac 60
attatccaag tacttccttt ggaaataaat ttgagttctt attaacatta tgttgatact 120
gttcactggg tttagtttca catgtaaata ggtactgcat tcagtatact aaaagtaatc 180
atagtgcttg ccaggtactt tgctaggtgc 210
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 79
tcgaaagcag tcacaagcaa ggtgagtgtt gatcctagtc agtccttttg ctgtagatgt 60
tctgaaacac gtaactaagc cattgctctt aaaaatttgg catatcttta agaaaattaa 120
ctctcatatt ctgttagctt ttactgtaca tatttagttt taacaaagtt aaatatgcca 180
cttatttggg caatggaaga gttggcctt 209
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<211> 222
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 80
tcacttcagc gtaaagcagt gtgtttatta accatccact aagctaaaac tagagcagtt 60
tgatttaaaa gtgtcactct tcctcctttt ctactttcag tagatatgag atagagcata 120
attatctgtt ttatcttagt tttatacata atttaccatc agatagaact ttatggttct 180
agtacagata ctctactaca ctcagcctct tatgtgccaa gt 222
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 81
acgtttggag ggctttgtgg tttgtggtgg aa 32