基于棉花ssr分子标记筛选藏紫草的特异性ssr标记方法
阅读说明：本技术 基于棉花ssr分子标记筛选藏紫草的特异性ssr标记方法 (Specific SSR (simple sequence repeat) marking method for screening Tibetan lithospermum based on SSR molecular markers of cotton ) 是由 阿呷尔布 葛群 李俊文 谢红军 赵静 巩万奎 袁有禄 石玉真 商海红 潘境涛 邓 于 2018-12-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于棉花SSR分子标记筛选藏紫草的特异性SSR标记方法,其包括以下步骤：(1)提取藏紫草根皮部基因组DNA；(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板,选用特异性SSR引物进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳；(4)对电泳结果进行分析,其中所述特异性引物的碱基序列为：SHIN-1494F：TAACGGAGATGGGTTTCGAC；SHIN-1494R：CACAACCGTCCATTTCCTCT。本发明方法重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响,而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉,有利于大规模的快速检测。(The invention discloses a specific SSR (simple sequence repeat) marking method for screening Tibetan lithospermum based on cotton SSR molecular markers, which comprises the following steps: (1) extracting the genomic DNA of the root bark of the Tibetan alkanna tinctoria; (2) taking the genomic DNA extracted in the step (1) as a template, and selecting a specific SSR primer for PCR amplification; (3) performing gel electrophoresis on the amplification product; (4) analyzing the electrophoresis result, wherein the base sequence of the specific primer is as follows: SHIN-1494F: TAACGGAGATGGGTTTCGAC, respectively; SHIN-1494R: CACAACCGTCCATTTCCTCT are provided. The method has the advantages of good repeatability, high polymorphism, stable heredity, no influence by environmental conditions, stable and reliable detection result, rapidness, accuracy, simple and convenient operation and low cost, and is beneficial to large-scale rapid detection.)
技术领域
本发明涉及一种基于棉花SSR分子标记筛选藏紫草的特异性SSR标记，利用这些特异引物对不同藏紫草进行分子标记分析与鉴定，属于生物技术应用领域。
背景技术
藏紫草特产于西藏，属滇紫草属，作为藏药入药已有上千年的历史，藏医常用来治疗肺炎、空洞结核和高山多血症，是常用藏药复方藏药鬼臼洗剂、西藏紫草露、二十五味鬼臼丸、七味血病丸等的主要成分，民间也将其作为医治烫伤、烧伤之良药。藏族人民还有长期用紫草的汁液染色食物的传统。然而紫草生境广泛，种类繁多，在西藏地区，大部分滇紫草属植物均长期作为藏紫草入药。据中国植物志记载，产于西藏的滇紫草属植物有6种。《中华本草.藏药卷》规定：藏紫草为长花滇紫草Onosma hookeri Clarke. var. longiforumDuthie 及细花滇紫草Onosma hookeri C. B. Clarke。然而，经我们多年的野外调查，以及和多名藏医药专家调研显示，藏医中，形态如上描述者更接近普通品种。上品藏紫草根细，质浓，长于沙地上，易于采挖，根直，且采挖时多无老皮，地上部分均为基生叶，叶最长者未超过15厘米。《四部医典》中记载：本品根皮止咳祛痰，治肺痈、***、贫血。《晶珠本草》记载：本品利血，治肺病。生在不很潮湿的沙质土壤地，根细多汁者佳，与此相反者质劣。《如意宝树》说：清肺热、止呕血。《藏药图鉴》中说：生长在上质坚硬的早滩，叶灰白色，很粗糙，花蓝红色，根红色，味甘、微苦，功效治肺病、血病等。以上典籍中也只给出了不同生境者在质量上的区别。而导致这种区别是原因为紫草基源还是生境，不得而知。在本发明人之前的研究显示，市售藏紫草质量差异很大。目前对于藏紫草药材的分子水平研究较少，进一步利用分子标记对藏紫草药材进一步研究具有重要的意义。
SSR分子标记，也称为微卫星标记，是一类有1-6个碱基组成的串联重复DNA序列，广泛存在于真核生物的基因组中，其两端多由相对保守的单拷贝序列组成。微卫星序列中寡核苷酸基序在同一物种的不同基因型以及在不同的物种中的重复次数以及具体碱基顺序有所差别。相对于其他的标记相比，SSR分子标记具有数量丰富、变异丰富、对于模板DNA的要求较低、共显性遗传、重复性好以及覆盖性强等特点。SSR分子标记已经广泛应用于植物的遗传图谱构建、QTL挖掘、基因定位、指纹图谱构建、品种的鉴定、种子纯度检测以及物种的遗传多样性分析等。目前有学者成功利用物种之间DNA序列具有同源性的特点，利用已经开发的SSR分子标记或者利用公共数据库中的EST序列和保守重复DNA序列开发物种特异性的SSR分子标记，从而解决无DNA序列信息的物种开发标记的难度，降低成本，提高效率等问题，郑丽珊等利用棉花SSR分子标记，采用转移扩增的方法筛选到111对在不同香蕉品种中有效的多态性引物。
棉花（Gossypium spp.）是重要的经济作物，目前已经开发大量的SSR分子标记并应用于棉花的遗传图谱构建、QTL定位、基因挖掘、指纹图谱构建、品种的鉴定、种子纯度检测以及棉花遗传多样性分析。而在藏紫草药材中开发的SSR分子标记非常有限，且公共数据库中关于藏紫草药材的基因组信息很少，因此本发明人利用55对棉花多态性SSRs引物对42种不同的藏紫草药材DNA进行扩增，从而筛选出在不同藏紫草药材中可以特异性扩增的SSR引物，为进一步藏紫草药材的比较基因组学、品种鉴定、指纹图谱构建以及重要性状的QTL定位、基因挖掘以及分子辅助选择育种奠定了重要的基础，为进一步对藏紫草药材的研究和应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是鉴定藏紫草的特异性SSR标记方法，以克服藏紫草药材中开发的SSR分子标记的不足，本发明方法重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响，而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉，有利于大规模的快速检测。
本发明提供的技术方案是：一种基于棉花SSR分子标记筛选团花滇紫草的特异性SSR标记方法，该方法包括以下步骤：
（1）提取待测藏紫草的基因组DNA；
（2）以第（1）步提取的基因组DNA为模板，选用特异性引物进行PCR扩增；
（3）优选通过凝胶电泳对扩增结果进行分析，若扩增产物中同时具有分子量大小分别为550bp和235bp两个条带的，则所述藏紫草为团花滇紫草；
其中，所述特异性引物的碱基序列为：
SHIN-1494F：TAACGGAGATGGGTTTCGAC
SHIN-1494R：CACAACCGTCCATTTCCTCT 。
藏紫草以根部入药，最终对不同基源的药材进行鉴定时，步骤（1）中，优选地提取藏紫草根皮部基因组DNA。
所述的特异性SSR标记方法，其中，第（2）步中，PCR扩增反应体系为：反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，10μM正向引物0.50μ1，10μM反向引物0.50μ1，30ng/μ1模板DNA1.0μ1 ，5U/μ1Taq DNA聚合酶0.10μ1；反应程序为：94℃预变性45s，1个循环；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min，一个循环；4℃保存待用。
本发明具有如下有益效果：本发明基于棉花SSR分子标记筛选团花滇紫草的特异性SSR标记研究，发明出一种鉴定藏紫草的特异性SSR标记方法，它具有重复性好、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，而且检测结果稳定可靠、快速准确、操作简单方便、成本低廉，有利于大规模的快速检测。
本发明基于棉花SSR分子标记筛选藏紫草的特异性SSR标记研究，从大量引物中筛选出能够在不同藏紫草品种中产生特异标记条带，而且带型清晰、重复性好、可靠性强的引物，作为团花滇紫草鉴定的特异性引物。本发明中特异性引物SSR引物对在不同藏紫草品种中鉴定出不同的特异条带。本发明的SSR标记引物在多次重复中表现稳定，可有效用于鉴别藏紫草的不同品种类型，并且可以相互验证，为进一步藏紫草药材的比较基因组学、品种鉴定、指纹图谱构建以及重要性状的QTL定位、基因挖掘以及分子辅助选择育种奠定了重要的基础，对藏紫草药材进一步的研究和应用具有重要的意义。
本发明提供了一种鉴定藏紫草的特异性SSR标记方法，该方法的应用，具有快速准确、经济简便、稳定可靠、不受环境条件及发育时期的影响，且操作简单、统计方便等优点，可以快速、准确地检测棉花杂交种种子的遗传纯度。
附图说明
图1为本发明一种鉴定藏紫草检测特征引物的SSR-PCR电泳图谱，其中，M为Marker（D2000）；箭头所指为团花滇紫草的特异带型；1、3、4为细花滇紫草，2、8、9、10、11为团花滇紫草，5、6、7为长花滇紫草。
具体实施方式
下面通过基于PCR技术的SSR标记分析实施例进一步说明本发明。
实施例1
方法：提取根皮部基因组DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，统计结果并筛选特征性引物。
1.提取藏紫草的基因组DNA。
本实施例的实验材料为藏紫草根。
利用上海生工生物技术公司的Plant Genomic DNA Extraction Kit（产品编号：B518264，包装规格：50次/100次）对基因组DNA进行提取（表1），试剂盒的试剂及步骤如下：
表1 植物基因组DNA提取试剂盒各试剂成分
组分
50次
100次
Buffer GMO
60 ml
120 ml
Buffer GMP
60 ml
120 ml
Buffer DRL
20 ml
40 ml
Wash Solution
12 ml
24 ml
纯化套件（吸附柱和收集管）
50套
100套
Proteinase K
1.2 ml
2.4 ml
TE Buffer（pH8.0）
10 ml
20 ml
操作手册
1份
1份
标准抽提步骤
自备材料:水浴锅、离心机、2ml离心管和无水乙醇。
请提前将水浴锅调至65℃备用。
1. 样品处理
a.固态产品：取足量的固态食品，液氮或者机械研磨至粉末，称取100-200 mg的食品粉末至2 ml离心管中。
b.豆浆等液态产品：取20 ml液态食品于50 ml离心管中，12000 rpm离心10min，弃上清。
c．加工处理的干燥植物组织及中草药：取经液氮研磨的100-300 mg干燥的植物组织或者中草药粉末至2 ml离心管中。
2. 向上述含有生物材料的离心管中加入1ml GMO Buffer和20μ1 proteinase K，充分振荡混匀，65℃水浴30 min，间或振荡混匀。
依据食品材料的体积和大小，可以适量调节GMO Buffer的加量，食品材料需要完全浸没在 GMO buffer中才能保证充***解。
如果需要获得无RNA污染的基因组DNA，需要同时加入20μ1 10 mg/ml RNase A。
3. 12000 rpm离心10 min，吸取全部上清。
4. 向上清中加入400μ1氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中。
5. 向上清中加入2倍体积的GMP Buffer，充分混匀，12000 rpm离心5min，弃上清。
如果需要提高基因组DNA的得率，可以加入GMP buffer 充分混匀之后放置5-10min。
弃上清时请勿吸到沉淀，否则影响最后基因组的得率。
6. 向沉淀中加入350μ1 DRL Buffer，充分悬浮沉淀物。
7. 向上述溶液中加入300μ1无水乙醇，充分混匀，将其全部转移至吸附柱中，室温放置2 min，10000 rpm离心2 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入500μ1 Wash Solution，10000 rpm离心1min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。
Wash Solution 使用前请检查溶液是否按比例加入无水乙醇。
9. 重复步骤8一次。
10. 将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2 min。
此步骤决不能省略，否则残留的乙醇会严重影响后续实验。
11. 取出吸附柱，放入一个新的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入50μ1 TEbuffer，静置。3 min，12000 rpm离心2 min，得到DNA溶液置于-20'C保存或者直接用于后续实验。
如果想提高 DNA的得率，可重复步骤11或将TE buffer 60C预热。
2.分子标记分析
PCR反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1（含Mg2+/20mM），10mMdNTPs 0.50μ1，10μM正向引物0.50μ1，10μM反向引物0.50μ1，30ng/μ1模板DNA1.0μ1 ，5U/μ1Taq DNA聚合酶0.10μ1。PCR反应程序为：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min，PCR反应在TGRADIENT、TC-512及PTC-200上进行。电泳仪器采用DYY-6C型稳压稳流电泳仪和DYC2-30型电泳槽，由北京六一仪器公司生产。扩增产物在8%的非变性聚丙烯凝胶中进行电泳，180V恒压电泳40-50分钟。电泳结束后，进行固定-银染-显色-终止，在可见灯箱下观察拍照，记录结果。
3. 筛选纯度鉴定的特征引物
利用55对棉花SSR引物（见表2）（由中国农业科学院棉花研究所提供）对不同藏紫草品种（请见表3）的DNA进行多态性筛选，进行PCR扩增，筛选出能够在不同藏紫草品种中扩增出特异标记条带（同时扩增出大约550bp和235bp），且带型清晰、重复性好、可靠性强的共显性SSR引物：SHIN-1494b（见图1），筛选出的特异性引物的碱基序列为：
SHIN-1494F：TAACGGAGATGGGTTTCGAC
SHIN-1494R：CACAACCGTCCATTTCCTCT。
上述特异性引物可作为团花滇紫草和细花滇紫草（长花滇紫草，是细花滇紫草的变种）基源鉴别，用该引物对不同藏紫草品种的DNA进行PCR扩增，团花滇紫草能够同时扩增出两条（约550bp和235bp）清晰条带（见图1中的2、8、9、10、11），细花紫滇草和长花紫滇草没有出现这两条条带（见图1中的1、3、4、5、6、7）。
表2
SSR标记名称
正向引物序列
反向引物序列
DPL0343
GCACCCTGATAAGAAGAATGTTGT
TCTCTTCTTCTGCTTCACTATCCC
HAU2386
TCCCCTCTGGCTTCACCTCA
CCTCTGCTTCTGCTGCTGCT
Gh171
CCCTAAAGAGAAATCGGTATCCTC
CAAACCCAGAACTGGCTTC
SHIN-0087
GGCTCTTACGGTGGTTGAAG
CGGTTCAAATCAATCAACCC
HAU2086
TTTGACCCAGAGTCACGCGG
GCCCTCCTGCTCCTCTGTCT
NAU5465F
TTTGGGGAAAAATCACATCT
ATGGTAGGTTGAGGGATGAA
<u>SHIN-1494</u>
<u>TAACGGAGATGGGTTTCGAC</u>
<u>CACAACCGTCCATTTCCTCT</u>
Gh243
CAGAAGGTTATGCAAACAACATGCA
CTAAACTCTCTCTGCTGTGTTCC
DPL0353
GACCTTGATTGATCAGTGCTACC
ATTAATTTGTGGAGCAACCACC
NAU3497
TTGCTTAGCTGGTGAGACTG
CCCTTCACCACCTCTTTCTA
DPL0841
TTGCTCATTTCGTGCTTCTG
TGCCCAAACTCAGTACATGC
DPL0137
GTTCCATCGTAATTTCTCATCCTC
AGTTGGCCTTGTTCTTGGTACTTA
DPL0268
CTGCAAAGAACATATGATGGAGAG
GAGTAAAGGTCATTTCATGTTGGC
NAU2442
TGGGATCTAATTAACCGTGA
CGAAACCTGTAGTGACGTTG
NAU4090
TTCTTCCCTAAACCATGAGC
CTGAACGAAGACCAAGACCT
BNL113
CCCTCGAGGTCGACGGTATCGATA
CCCGGTTCTTGCTGATCCGGATGT
BNL116
GCGGCATGCTTTCTTCATCATATA
ATAACCTGTGACATCTTTTTTTGC
BNL117
GCTTTCGTCATACACACACATTCA
TAGCTAGGCTGCTGCACTACTTGA
BNL118
TTGTGGAATTGATGTTTTCTTCTT
AAGCACAACACAAAATCAAATTCG
BNL119
CGATCCTTCTTATTCTCATCTCTC
GAAACACTTCTTCACAAATCCTAAT
BNL137
CCCCTTTTACTCTGATTTGGCTT
CTTATCGCAATAGTCGCAGTAAT
BNL150
CTCACCGTTTCCTCTCCAAA
GACATGCGTGTTGGTTTTAAA
BNL169
TCACAAATAAAAGTGAAATTGCG
GGCTGGTGACCATAAAAGGA
BNL193
TGTGAGCCATTGCTGTTAGC
TAAGTGCTGGCATTGTGAGC
BNL226
TTATTCTCACAGCCGGAACC
TTCACCCTCTCGCTTCTCAT
BNL243
GGGTTTTCTGGGTATTTATACAACA
TCATCCACTTCAGCAGCATC
BNL252
TGAAGAGCTCGTTGTTGCAC
CGAAAGAGACAAGCAATGCA
BNL256
TTTTGCTCCATTTTTTTGCC
TTTATTAATTTCGTTTAGCTTCCG
BNL285
ACGCTGTTGATAGAGAGAAATACC
TCACCGTCCGTTTTAACACA
BNL341
ACCTGGGGTACTTGTCCACA
CCATCCCATTTGTGATACCC
BNL358
ATTAATTGCACCAGACATCCC
AAATCTTGGTTTTGAGATTTTCA
BNL387
GAAGGGGAATTTATAGCGGG
AGAGACTCCCGCACTTGAAA
BNL390
CTTTGGGTTGGAATGTGAGG
CATTCTGGCCCACACTCAC
BNL391
ACCTTTTCGAATTTTTGGCC
TCGATCTTGAGTGGGTAGGG
BNL409
AGAAGTCGGACGTGGAAAGA
GCCGTTTTCCTCAGTGATGT
BNL448
GCAGCTTGCTTTTCTGCTTC
ACGCAAGCTTGGTCAATACC
BNL530
CGTAGGATGGAAACGAAAGC
GCCACACTTTTCCCTCTCAA
BNL542
TCGATCACATTTATAAGAACTATTGG
TTCATTTTGAACATTCGCCA
BNL569
TTGAGAAGTACTACCATTAATTATCCA
GACTGATGCCAGTTGACCCT
BNL580
CTATGTTTGGCCTTGGCATT
TAGTGACAGATATCCCCGGC
BNL597
CCCATCCCTTCATAAACCCT
GGGATTGAATATCTCGGCAA
BNL598
TATCTCCTTCACGATTCCATCAT
AAAAGAAAACAGGGTCAAAAGAA
BNL625
AGAGAGGGGGGAAAAGTTCA
GCCAGGCATGGTTTCTATGT
BNL632
CAGTTTCCAAAACGGCGTAT
AAACCCTCACACACACTCCC
BNL673
ATAAGGGAGGTTGCAAGGGT
CTATTTATATGATTTTTATTTGTTTCATCC
BNL686
ATTTTTCCCTTGGTGGTCCT
ACATGATAGAAATATAAACCAAACACG
BNL786
CTTTCCACGTGTAATTTGTTGATA
GATCTTAACTCTTGCTCTCTCTCTCTC
BNL827
AAGCTCCACGTGCTCAAGTT
CTCATGTTGTCGGTGGTGTT
BNL830
TTCCGGGTTTTCAATAAACG
GTTAATACTTTTTTTCTTTTGTGTGTG
BNL834
TCGAGATTCATGGCTCTCCT
TGGCAAAAGTGGACATACCA
BNL836
ATCTTGTTGATTTTCTGACTACAGG
CAGACATTCCCCTTCCTTGA
BNL840
CTCGTGGAAACACCAGGAAT
TCTCGCCATTAAACTGCCTT
BNL852
TGCTTTCAGCCAATGACTTG
AACAATGCCCCCAATATTCA
BNL946
GCTGTTGCTCCACATCTCCT
GGGCAAACAGATAGGCAGAA
BNL1017
AGAAAAAAACTTCCTCATGAACC
GTTTCTCTCAGAATTTGTAGGCC
表3
编号
名称
产地
1
细花滇紫草
山南浪卡子县
2
团花滇紫草
山南贡嘎县
3
细花滇紫草
日喀则康马县
4
细花滇紫草
日喀则白朗县
5
长花滇紫草
日喀则康马县
6
长花滇紫草
拉萨墨竹工卡县
7
长花滇紫草
拉萨城关区
8
团花滇紫草
山南扎囊县
9
团花滇紫草
山南扎囊县
10
团花滇紫草
山南扎囊县
11
团花滇紫草
山南扎囊县
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