一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法
阅读说明：本技术 一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法 (method for obtaining ultra-short sequence aptamer through screening ) 是由 郑江 江兴龙 鄢庆枇 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法,在SELEX筛选方法基础上,结合高通量测序技术,对每轮SELEX筛选出的寡核苷酸文库都进行高通量测序,通过统计分析每个随机文库对应的高频序列数,进而对随机文库的随机序列进行增减,并通过循环逼近法最终获得最短的适配体序列。通过构建不同的筛选文库,采用高通量测序逼近的方法来获得极短序列的核酸适配体,省去了后期截短加工和改造的麻烦。(the invention discloses a method for obtaining a very short sequence aptamer through screening, which is characterized in that on the basis of a SELEX screening method, a high-throughput sequencing technology is combined, high-throughput sequencing is carried out on oligonucleotide libraries screened by each round of SELEX, the number of high-frequency sequences corresponding to each random library is statistically analyzed, then the random sequences of the random libraries are increased and decreased, and the shortest aptamer sequence is finally obtained through a circular approximation method. By constructing different screening libraries and adopting a high-throughput sequencing approximation method to obtain the aptamer with an extremely short sequence, the troubles of late truncation processing and modification are saved.)
技术领域
本发明涉及寡核苷酸序列、核酸适配体序列，尤其是涉及能获得较短序列核酸适配体的筛选技术。
背景技术
指数富集配体进化技术（Systemic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment），简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——核酸适配体，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的核酸适配体，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。
然而，很多情况下筛选获得的核酸适配体都并不令人满意，通常核酸适配体长度太长，导致合成成本较高，另外，过长的核酸适配体中非必要的序列较多，也会使检测过程中容易出现一些副反应和干扰因素。因此，不少人都对获得的核酸适配体进行截短加工和修饰，以期获得序列更短、亲和力较好的适配体。不过有关的截短加工的效果大多情况下并不理想。
现有技术也缺少一种直接筛选出最短序列核酸适配体的方法，以省去后续对过长核酸适配体序列进行的截短加工操作的麻烦。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获得较短序列核酸适配体的SELEX筛选方法，该方法在筛选时对核酸适配体的序列长度进行了优化控制，使其尽量少，避免了后续的加工改造和截短的麻烦，且容易实现自动化操作，本发明具体内容如下：
一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）合成随机寡核苷酸文库：合成一个两端有固定序列、中间为随机序列的随机寡核苷酸文库，两端固定序列用于与引物结合进行PCR扩增；中间随机序列碱基数目为N，5≤N≤35，N为正整数；
（2）结合：将随机寡核苷酸文库与靶目标相结合；
（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；
（4）PCR扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行PCR扩增，PCR产物一部分用作下一轮筛选的寡核苷酸文库，另一部分用于后续第（5）步的高通量测序；
（5）高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现次数或频率大于或等于2次的非引物序列的高频寡核苷酸序列，即为第1轮SELEX筛选的候选序列；
（6）重复循环筛选：选择第4步扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标结合，重复步骤（2）-（5），获得第2轮SELEX筛选的的候选序列；重复循环m次(1≤m≤10)，获得m轮的SELEX筛选的候选序列；统计第1轮到第m轮的候选序列的数量，用k表示累计获得的高频的候选序列数量；
当筛选过程中出现下列情形时，
①如果初始随机文库中的中间随机序列数量为N，当重复筛选的循环数m满足条件1≤m≤10，且候选序列的数量k满足条件0≤k<5时，继续进行m+1轮的筛选，即重复步骤（2）—（6）的进行循环筛选；
②如果初始随机文库中随机序列数量为N，当循环数m满足1≤m≤10，且高频序列的数量k≥5时，停止筛选；重新合成中间随机序列数为N-1的初始随机文库，以该初始随机文库为起点，按步骤（2）—（6）进行新的SELEX筛选；
③如果初始随机文库中随机序列为N，当循环数m>10，且k=0时，即完成了10轮循环筛选后，高频序列的数量k仍然为零，即没有发现高频序列，则停止筛选；重新合成中间随机序列数为N+1的初始随机文库；再以这个N+1的新的随机文库为初始文库，按步骤（2）—（6）进行新的SELEX筛选；如果之前已经对随机序列为N+1的初始随机文库进行过筛选，且获得了一定数量的高频序列，则这些高频序列就是所要的极短序列的核酸适配体，无需再进行筛选；全部筛选结束；
④如果初始随机文库中随机序列为N，当循环数m>10，且高频序列的数量k≥1时，则停止这次筛选， 重新合成中间随机序列数为N-1的初始随机文库，再按步骤（2）—（6）进行新的SELEX筛选；如果之前已经对随机序列为N-1的初始随机文库进行过了筛选，且没有获得高频序列，则停止全部筛选，这次筛选获得的k个高频序列就是所要的极短序列的核酸适配体；全部筛选结束。
（7）最后对获得的极短序列核酸适配体进行亲和常数等参数的测定，以验证其亲和性。
极短序列最大程度降低甚至完全排除非必要序列的出现，最大程度降低检测过程中副反应和干扰因素的产生，提升检测的质量，降低了检测成本；本发明在SELEX筛选方法基础上，结合高通量测序技术，对每轮SELEX筛选出的寡核苷酸文库都进行高通量测序，通过统计分析每个随机文库对应的高频序列数，进而对随机文库的随机序列进行增减，并通过循环逼近法最终获得最短的核酸适配体序列。本发明通过构建不同长度的随机筛选文库，采用高通量测序逼近的方法来获得极短序列的核酸适配体，省去了后期截短加工和改造的麻烦，能较好降低检测成本、提高检测效率。
附图说明
附图1为本发明方法的筛选流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步描述。
实施例1：筛选溶藻弧菌极短序列核酸适配体
1、合成随机寡核苷酸文库：合成一个两端有固定序列、中间随机序列N=35的随机寡核苷酸文库如下：5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG--3'， 其中的两端固定序列可以与引物P1、P2结合进行PCR扩增，P1序列为5'--TCAGTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--3'，P2序列为5'--CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC --3'。
2、结合：将30pmol的上述随机文库100ul与靶目标溶藻弧菌100ul（含菌量约为108个）在28℃下结合30分钟；
3、分离：6000rpm10分钟，弃上清，取菌沉淀加热到95℃，然后6000rpm离心10分钟，取上清，得到能与靶目标溶藻弧菌结合的寡核苷酸；
4、PCR扩增：对分离出的能与靶目标溶藻弧菌结合的寡核苷酸进行不对称PCR扩增，不对称PCR反应体系如下：
成分
单位：ul
ddH<sub>2</sub>O
16.4
引物P1（10uM）
2
引物P2（0.4uM）
2
dNTP(10mM)
0.4
10×PCR buffer
2
模板（筛选的ssDNA)
2
Dream taq（5U/ul）
0.2
反应条件：94℃预变性4min，然后进行40个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min。
PCR产物一部分用作下一轮筛选的寡核苷酸文库，一部分用于后续第5步的高通量测序。
5、高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现次数或频率大于或等于2次的寡核苷酸序列，即高频序列作为候选序列，获得第一轮SELEX筛选的候选序列。
6、重复循环筛选：选择第4步扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标结合，重复步骤2-5，即结合、分离、PCR扩增、高通量测序等步骤，获得第2轮SELEX筛选的的高频序列或候选序列。则m=2，统计第一轮到第2轮的高频序列，用k表示累计获得的高频序列数量，得到k=3<5，则再进行第3轮的SELEX筛选，得到m=3，k=6≥5，此时停止筛选，重新合成新的初始随机文库5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N34--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3'，该文库与原文库比较，只有中间随机序列变为N=34，其它都不变。以该N34的随机文库为初始文库进行新的SELEX筛选，重复步骤2-6，得到新的m和k，当m=11，k=3时，即完成了10轮循环筛选后，获得了3个高频序列，此时停止筛选，重新合成新的初始随机文库5'--TCA GTCGCT TCG CCG TCT CCT TC--N33--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3'，该文库与上次文库比较，中间随机序列变为N=33，其它都不变。以该N33的随机文库为初始文库进行新的SELEX筛选，重复步骤2-6，得到新的m和k，当m=11，k=0时，即完成了10轮循环筛选后，没有获得高频序列，此时停止筛选。随机文库的随机序列数N+1=34，需进行以N34随机文库为初始文库的SELEX筛选，由于之前已经进行过了N34为初始随机文库的筛选，并获得了3个的高频序列，则这3个高频序列就是所要的溶藻弧菌的极短序列适配体，序列如下：
5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--AGT CTC TGC GGG GGG TAG GAG CTA GAGTTT GGT G--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3' ； 采用单链DNA法测得该序列对溶藻弧菌的亲和常数Kd=15.3±1.2 nmol/L，亲和常数越小其亲和力越高。
5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-- GGA CGA GAT AAA AAA GAA ACG AGGCAC AAG AGG G --GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3'；采用单链DNA法测得该序列对溶藻弧菌的亲和常数Kd=38.6±4.4 nmol/L。
5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-- AGC TTT TTT TAC AAA GGG AAC GAC ACACCG TTG A --GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3；采用单链DNA法测得该序列对溶藻弧菌的亲和常数Kd=65.1±9.2 nmol/L。
结果显示，本申请方法获得的溶藻弧菌极短序列适配体具备亲和力。
实施例2：筛选哈维氏弧菌极短序列核酸适配体
1、合成随机寡核苷酸文库：合成一个两端有固定序列、中间随机序列N=25的随机寡核苷酸文库如下：5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N25--GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGA GGG--3'， 其中的两端固定序列可以与引物P1、P2结合进行PCR扩增，P1序列为5'--TCAGTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--3'，P2序列为5'--CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC --3'。
2、结合：将30pmol的上述随机文库100ul与靶目标哈维氏弧菌100ul（含菌量约为108个）在28℃下结合30分钟；
3、分离：6000rpm10分钟，弃上清，取菌沉淀加热到95℃，然后6000rpm离心10分钟，取上清，得到能与靶目标哈维氏弧菌结合的寡核苷酸；
4、PCR扩增：对分离出的能与靶目标哈维氏弧菌结合的寡核苷酸进行不对称PCR扩增，不对称PCR反应体系如下：
成分
单位：ul
ddH<sub>2</sub>O
16.4
引物P1（10uM）
2
引物P2（0.4uM）
2
dNTP(10mM)
0.4
10×PCR buffer
2
模板（筛选的ssDNA)
2
Dream taq（5U/ul）
0.2
反应条件：94℃预变性4min，然后进行40个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min。
PCR产物一部分用作下一轮筛选的寡核苷酸文库，一部分用于后续第5步的高通量测序。
5、高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现次数或频率大于或等于2次的寡核苷酸序列，即高频序列作为候选序列，获得第一轮SELEX筛选的候选序列。
6、重复循环筛选：选择第4步扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标哈维氏弧菌结合，重复步骤2-5，即结合、分离、PCR扩增、高通量测序等步骤，获得第2轮SELEX筛选的的高频序列或候选序列。则m=2，统计第1轮到第2轮的高频序列总数（用k表示），如果k=0，则再进行第3-10轮的SELEX筛选，如果m=11，k=0，即完成了10轮循环筛选后，没有获得高频序列，此时停止筛选。重新合成新的初始随机文库5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N26-GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3'，该文库与原文库比较，只有中间随机序列变为N=26，其它都不变。以该N26的随机文库为初始文库进行新的SELEX筛选，重复步骤2-6，得到新的m和k，当m=11，k=2时，即完成了10轮循环筛选后，获得了2个高频序列，此时停止筛选，随机文库的随机序列数N-1=25，需进行以N25随机文库为初始文库的SELEX筛选，由于之前已经进行过了N25为初始随机文库的筛选，并没有获得高频序列，则N=26文库获得的2个的高频序列就是所要的哈维氏弧菌的极短序列适配体，序列如下：
5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-- TTT TAA TAC CCC GGG AAC GAC ACA CA--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3；采用单链DNA法测得该序列对哈维氏弧菌的亲和常数Kd=19.6±3.4 nmol/L。
5'--TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-- CCC TTT CCC AAA ATC GGA ACA CTATG--GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG--3；采用单链DNA法测得该序列对哈维氏弧菌的亲和常数Kd=55.5±7.6 nmol/L。
结果显示，本申请方法获得的哈维氏弧菌极短序列适配体具备亲和力。
实施例1及实施例2中，单链DNA法测定核酸适配体的亲和常数方法如下：
1、核酸适配体处理：取浓度为10μM的核酸适配体，用2×结合缓冲溶液依次稀释至10nM、20nM、40nM、60nM、80nM和100nM。
2、结合：分别取100μl（108cfu/ml）弧菌菌液，与100μl不同浓度10nM、20nM、40nM、60nM、80nM和100nM的核酸适配体结合，摇床（30℃、100rpm）结合30min。
3、洗涤：结合完毕后，6000rpm离心5min，去上清，用200μl 1×缓冲溶液洗涤3次。
4、加热：95℃加热5min，15000rpm离心10min，取上清液。
5、检测：用K5500超微量紫外可见分光光度计测定各浓度下的核酸适配体与菌的亲和力。
6、数据处理：以核酸适配体浓度为横坐标，以核酸适配体亲和力为纵坐标，采用双曲线函数（hyperbola函数），用Oringin9.0软件进行非线性拟合，得到相应的核酸适配体亲和常数。
本申请方法获得的极短序列最大程度降低甚至完全排除非必要序列的出现，最大程度降低检测过程中副反应和干扰因素的产生，提升了检测的质量和效率，降低了检测成本；由上述实施例可见，采用本发明的方法将适配体的序列实现极短化，避免了效率低下的截断加工，降低适配体检测成本，提高适配体的检测效率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，熟悉本领域的技术人员应该明白，本发明包括但不限于上面具体实施方式中的描述内容。但任何不偏离本发明的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围。