一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法
阅读说明：本技术 一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法 (Evaluation method for identifying applicability of specific marker in area ) 是由 吴仁人 张杨 陈中颖 李文静 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法,包括步骤：S1：采集样品,并提取DNA；S2：选取特异性引物；S3：制作qPCR反应和标准曲线；S4：选择灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th作为评价引物适用性的指标,并计算各个指标的值；S5：利用层次分析法对引物灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数指标进行定权,以得到各引物的综合适应性评价。本发明方法可有效筛选出既具有特异性优势,且兼顾检出水平较高、检出浓度较为稳定的宿主特异性标记物用于后续的水体微生物污染定量源解析工作。(The invention discloses an evaluation method for identifying the applicability of a specific marker area, which comprises the following steps: s1: collecting a sample and extracting DNA; s2: selecting a specific primer; s3: making qPCR reaction and standard curve; s4: selecting sensitivity, specificity, source intensity characteristics, 25th/75th threshold value and target source 25th/75th as indexes for evaluating the applicability of the primers, and calculating the value of each index; s5: and (3) weighting five parameter indexes including sensitivity, specificity, source intensity characteristics, 25th/75th threshold value and target source 25th/75th by using an analytic hierarchy process to obtain comprehensive adaptability evaluation of each primer. The method can effectively screen the host specific marker which has the advantages of specificity, higher detection level and more stable detection concentration for subsequent analysis of the water body microbial pollution quantitative source.)
技术领域
本发明涉及微生物污染防治研究领域，特别涉及一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法。
背景技术
人和动物的粪便中含有多种病原微生物和肠道病毒，未经处理(或未完全处理)粪便排放至自然水体中不但造成了严重的水体微生物污染，对人类的身体健康也带来了极大的风险。例如，中国多地区每年都会有诺如病毒性肠胃炎病例报导的出现，主要传播途径就是“粪-口”传播。而2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-nCoV)疫情也有通过“粪-口”传播的可能性。因此，如何快速、准确的识别微生物污染来源并评价各自污染源的贡献率成为有效开展针对性源头控制，降低微生物污染风险的关键环节。
粪大肠菌群和大肠埃希氏菌等指示微生物作为反映水体微生物污染状况的传统指标已被世界各国沿用多年，中国的地表水环境质量标准(GB3838-2002)也采用粪大肠菌群制定了相应的水质评价标准。然而，传统指示微生物广泛存在于各类动物肠道中，仅能反映出自然水体的粪便污染水平，不能识别粪便污染的来源，更不能解析各污染源的贡献率。由于缺乏微生物污染源的准确信息，使得水体微生物污染的防治仍停留在“见污治污”的被动模式中，不但增加了污染治理的成本，在预防介水性疾病传播方面也困难重重。针对以上问题，欧、美等发达国家近年来开发出以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染源解析技术，并以不同宿主体内拟杆菌、噬菌体等微生物序列的特异性片段为靶序列设计出人、猪、反刍动物、禽类等多种动物的特异性引物，为水体微生物污染的针对性治理提供了有效的信息。
然而，由于不同地区的饮食习惯、气候及生活方式等存在差异，导致各类宿主体内的肠道微生物组成和结构普遍表现出区域变异性。因此，同一引物在不同地区的特性表现可能存在很大差异。在目标研究区域预先验证各引物的适用性和有效性成为了水体微生物污染源解析工作的重要环节。以往对于引物的适用性评价通常采用灵敏度与特异性这两项指标，但此两类评价因子仅能对引物特性进行定性分析，难以反映引物在不同地域的表达水平，导致在实际应用过程中可能因各引物检出浓度的差异而无法量化不同宿主来源的微生物污染。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法，该方法结合引物的定性评价因子和源强特征等定量指标，建立较为全面的引物适用性评价方法，可有效筛选出既具有特异性优势，且兼顾检出水平较高、检出浓度较为稳定的宿主特异性标记物用于后续的水体微生物污染定量源解析工作。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法，包括步骤：
S1：采集样品，并提取DNA；
S2：选取特异性引物；
S3：制作qPCR反应和标准曲线；
S4：选择灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th作为评价引物适用性的指标，并计算各个指标的值；
S5：利用层次分析法对引物灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数指标进行定权，以得到各引物的综合适应性评价。
优选的，步骤S1中，DNA提取的方法是：采用粪便基因组提取试剂盒，每份粪便混匀后称取一定量放入灭菌离心管中，进而按照试剂盒说明书进行DNA提取。提取的DNA通过超微量分光光度计测定质量后置于-20℃冰箱储存。
优选的，步骤S3中，在选取特异性引物后，以不同人和动物的粪便样本DNA为模板，对选取的各类宿主特异性引物进行扩增；为构建标准品，对各特异性引物采用对应的样本DNA进行PCR扩增，扩增后的目标产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化回收；
回收后的噬菌体引物扩增产物连接到载体上，其它回收产物连接到pMD19-T Vector载体上，连接完成后，均转化至DH5α感受态细胞，采用氨苄抗生素含量为1:1000的平板培养基筛取阳性克隆，并提取质粒DNA，同时测定相应的DNA浓度，计算目的片段拷贝数；制备的质粒均进行10倍梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 7个梯度；以各梯度质粒为模板，每个梯度设置3个重复，进行qPCR扩增，通过反应获得的Cq值构建相应的标准曲线，各标准曲线的相关系数(R2)均大于0.97，且扩增效率在90-110％之间，表明各标准曲线合格。
进一步的，qPCR扩增包括荧光染料和荧光探针两种方法。
优选的，步骤S4中，灵敏度与特异性通过采用各引物的最低定量限为阈值对扩增结果中的阳性、阴性反应进行统计，进而计算得到。
优选的，步骤S4中，源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th属于定量分析指标，是基于各引物针对目标源和非目标源的检测浓度计算得到。
优选的，步骤S5中，利用层次分析法对五类参数指标进行定权，得到各引物的综合适应性评价，方法是：
S5.1：建立层次递阶结构，从最高层到最底层依次是目标层A、准则层B和变量层C，目标层A是进行引物的适应性评价；准则层B是指用于表征适应性的五类参数指标，变量层C是指候选引物，即待评价的引物；
S5.2：对准则层B构建判断矩阵：依据灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数指标两两之间的重要程度比较，构建判断矩阵；
S5.3：计算准则层B构建的判断矩阵的最大特征值及对应特征根；
S5.4：对判断矩阵进行一致性检验；
S5.5：若步骤S5.3的计算结果通过一致性检验，则将计算结果作为确定的最大特征值及对应特征根，其中最大特征值对应的特征根即为目标层A对准则层B五类参数指标的相对权重；
S5.6：计算在准则层B各指标下变量层C各引物的得分，即对实验获得的变量层C各引物在各准则层B参数指标下的引物特性表征值进行标准化；
S5.7：对变量层C各引物在准则层B各参数评价指标下的得分情况进行加权，权重为目标层A到准则层B的权重，得到各引物适应性综合得分。
更进一步的，步骤S5.3中，采用方根法计算判断矩阵的最大特征值和其对应的特征根，步骤如下：
S5.3.1、计算判断矩阵每行所有元素的几何平均值：
得到表示各行平均值组成的向量，j表示判断矩阵的第j列，aij表示判断矩阵的第i行第j列的元素，i表示判断矩阵的第i行；
S5.3.2、将归一化，即计算：
得到即为最大特征值对应的特征根，这也是目标层A对准则层B五类参数指标的相对权重ω；
S5.3.3、计算判断矩阵的最大特征值：
其中为向量Aω的第i个元素，A表示判断矩阵。
更进一步的，步骤S5.4中，对判断矩阵进行一致性检验，方法是引入随机一致性比率CR，计算公式如下：
式中：p为判断矩阵阶数，CI为一致性指标，CR为随机一致性比率，RI为随机一致性指标，若CR<0.1，判断矩阵具有很好一致性，判断合理；若CR＝0.1，判断矩阵具有较好一致性，判断较合理；若CR>0.1，判断矩阵不符合一致性原则，需重新调整。
更进一步的，步骤S5.6中，对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越佳的参数指标，标准化公式如下：
对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越差的参数指标，标准化公式如下：
其中，xij指的是第i种引物在第j个参数指标下的未经标准化的实验得分情况，yij指的是第i种引物在第j个参数指标下的标准化后的实验得分情况。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明中将以往的引物适用性评价指标进行了改进，并建立了新的评价方法。由于改进后的评价方法增加了定量分析指标，使得评价指标得到了完善。同时通过确定各指标在评价体系中的权重，使得引物的地区适用性能够得到更为准确、全面的评估，可以更为直观的了解引物在不同地区的表现。通过本发明筛选出的引物可精准识别环境水体中的微生物污染来源及其贡献率。
附图说明
图1是本实施例中样品采集城市示意图。
图2(a)是人源特异性引物检出浓度分布图。
图2(b)是非人源特异性引物检出浓度分布图。
图3是本实施例方法的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
如图3所示，本实施例提供一种识别特异性标记物地区适用性的评价方法，该方法可从定性和定量两方面的多种指标综合评价引物的特性，帮助研究或管理人员有效筛选出既具有特异性优势，且兼顾检出水平较高、检出浓度较为稳定的宿主特异性标记物用于后续的水体微生物污染定量源解析工作。
本实施例基于宿主特异性生物标记引物的定量源解析方法，采用qPCR技术分析引物在中国的特性表现，结合层次分析法建立评价引物地区适用性的新方法。这里所述的宿主特异性生物标记引物是针对宿主肠道内特定微生物中的保守基因片段开发而来的引物，能对较短的核苷酸序列片段特异性扩增的引物。qPCR是实时荧光定量核酸扩增检测系统，是一种在PCR反应体系中加入荧光染料或Taqman探针，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的进程，最后通过相应的标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
下面结合图3对本实施例所述的识别特异性标记物地区适用性的评价方法中的具体步骤进行详细说明。
(1)样品采集与DNA提取
在中国的28个城市内开展粪便样品采集工作。其中22个城市位于“黑河-腾冲线”东侧，属于人口密集区，对中国水系污染贡献较大，采样点分布见图1。
样品共采集506份，涉及人、猪、牛、羊、骆驼、鸡、鸭、鹅、猫、狗、兔、驴、马等13个物种。其中人、猪、羊、牛、禽类等常见污染源粪便数量占总体样品数量的78％。样品采集后保存于密闭的冰盒中，48h内送回实验室。
DNA是指脱氧核糖核酸，其是一种生物大分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。具有信息储存的功能，可比喻为“蓝图”或“食谱”。粪便DNA的提取采用相关的粪便基因组提取试剂盒，每份粪便混匀后称取0.25g(湿重)放入灭菌离心管中，进而按照试剂盒说明书进行DNA提取。提取的DNA通过超微量分光光度计测定质量后置于-20℃冰箱储存。
(2)特异性引物的选取
这里特异性是指衡量引物不能与非目的基因片段匹配的能力，特异性是将不能够与目的基因片段进行匹配的引物正确地判定为真阴性的比例。本实施例特征生物标记引物如表1所示。
表1特征生物标记引物
(3)qPCR反应和标准曲线制作
以不同人和动物的粪便样本DNA为模板，对选取的各类宿主特异性引物进行扩增。引物信息如表1所示。qPCR扩增包括荧光染料和荧光探针两种方法。荧光染料法扩增体系为20ul:Premix Ex TaqTM II(2×)(购自TaKaRa公司)10ul；ddH2O，6.4ul；上下游引物各0.8ul；DNA模板2ul。反应程序：①预变性，95℃，30s；②变性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min。40个循环。荧光探针法扩增体系为20ul:SuperReal probe PreMix(2×)(购自TaKaRa公司)10ul；DNA模板2ul；上下游引物各0.25ul；探针1ul(10nM)；ddH2O，6.4ul。反应程序：①预变性，95℃，15min；②变性，95℃，3s；③退火延伸，60℃，30s。40个循环。
为构建标准品，对各特异性引物采用对应的样本DNA进行PCR扩增，扩增后的目标产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化回收。回收后的噬菌体引物扩增产物(CPQ_056,CPQ_064)连接到载体上，其它回收产物连接到pMD 19-T Vector载体上。连接完成后，均转化至DH5α感受态细胞，采用氨苄抗生素含量为1:1000的平板培养基筛取阳性克隆，并提取质粒DNA，同时测定相应的DNA浓度，计算目的片段拷贝数。制备的质粒均进行10倍梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6 7个梯度。以各梯度质粒为模板，每个梯度设置3个重复，进行qPCR扩增。通过反应获得的Cq值构建相应的标准曲线。各标准曲线的相关系数(R2)均大于0.97，且扩增效率在90-110％之间，表明各标准曲线合格。
(4)引物的特性分析
传统的特异性引物评价通常采用灵敏度和特异性这两项分析指标，灵敏度指衡量引物测出特定基因片段的能力，是能够判定引物在目标宿主样本中获得真阳性的比例。特异性指衡量引物不能与非目标宿主微生物的基因片段配对扩增的能力，是能够判定引物在非目标宿主中获得真阴性的比例。但是灵敏度和特异性均为定性指标，仅采用这两个指标进行分析忽略了引物在不同宿主体内的浓度分布，导致实际检测过程中可能因标记物检出浓度较差或与非目标物种的交叉反应水平较高而出现假阴性或假阳性结果。因此，在原有灵敏度和特异性的基础上，本实施例引入了源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th作为评价引物适用性的指标。其中，源强特征是指特异性标记引物在目标宿主样本库中的平均检出浓度。25th/75th阈值是指特异性标记引物在目标样本库和非目标样本库中的检出浓度均由小到大进行排列，引物在目标样本库中获得的上四分位点(目标源25th)与非目标样本库中获得的下四分位点(75th)的差值为25th/75th阈值。目标源25th/75th是指对特异性标记引物在目标宿主样本库中的检出浓度由小到大排列，上四分位点(排在数组1/4处的数值)与下四分位点(排在数组3/4处的数值)的差值为目标源25th/75th。
其中，灵敏度与特异性通过采用各引物的最低定量限为阈值对扩增结果中的阳性、阴性反应进行统计，进而计算灵敏度与特异性。具体结果如表2所示。
表2不同动物中各宿主特异性标记物的阳性结果统计
a总样本数
另外，源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th属于定量分析指标，是基于各引物针对目标源和非目标源的检测浓度计算而来的，结果如图2(a)、图2(b)所示。
(5)引物的适用性评价
灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数分别代表了引物不同方面的特征，如何根据源解析要求有效定位5类参数在引物评价体系中的比重，是成功识别标记物适用性的关键步骤。
本实施例提出利用层次分析法对引物灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数指标进行定权，以得到各引物的综合适应性评价。该层次分析法主要原理是将与决策相关的元素分解成目标层(A层)，准则层(B层)和变量层(C层)三个层面；将B层指标两两进行比较，对其予以优劣评判，C层的变量得分情况根据实验所得数据进行标准化得到；并利用评判结果建立矩阵模型来计算各指标的权重系数，即得到在某一准则下各个指标相对重要性的度量，具体计算步骤为：
(5-1)建立层次递阶结构
层次分析的结构模型大致分为两层，从最高层到最底层依次是目标层、准则层和变量层。目标层是指研究所要达到的目标，即进行引物的适应性评价；准则层是指用于表征适应性的五类参数指标，变量层是指候选引物，即待评价的引物，由此可以建立本次评价的层次结构(表3)。
表3引物适应性综合评价层次结构
(5-2)对B层构建判断矩阵
判断矩阵是针对上一层次中某元素而言，评定该层次中各元素间相对重要程度的判断。两两指标之间的相对重要程度的度量尺度一般采用9分法，划分标准如表4所示。
表4 AHP法程度赋值及意义
依据灵敏度、特异性、源强特征、25th/75th阈值、目标源25th/75th五类参数指标两两之间的重要性比较，构建判断矩阵(表5)。
表5 B层判断矩阵
(5-3)计算B层判断矩阵的最大特征向量及特征根
本实施例采用方根法求判断矩阵的最大特征值和其对应的特征根，具体计算步骤如下：
1)计算判断矩阵每行所有元素的几何平均值：
得到
2)将归一化，即计算：
得到即为所求特征向量的近似值，这也是各因素的相对权重ω。
3)计算判断矩阵的最大特征值
其中为向量Aω的第i个元素。
(5-4)计算判断矩阵一致性指标，检验其一致性
为了检验判断矩阵是否合理，需要对判断矩阵进行一致性检验，引入随机一致性比率(CR)。
式中：p为判断矩阵阶数，CI为一致性指标，CR为随机一致性比率，RI为随机一致性指标。由于不同阶数的矩阵两两判断的比例测度达到一致性的难度不一样，用RI来对不同阶数矩阵一致性指标CI进行修正。随机一致性指标的统计平均值如表6所示。
表6平均随机一致性指标
若CR<0.1，判断矩阵具有很好一致性，判断合理；
若CR＝0.1，判断矩阵具有较好一致性，判断较合理；
若CR>0.1，判断矩阵不符合一致性原则，需重新调整。
(5-5)得到B层各参数权重
若步骤S5.3的计算结果通过一致性检验，则将计算结果作为确定的最大特征值及对应特征根，其中最大特征值对应的特征根即为目标层A对准则层B五类参数指标的相对权重。
根据以上步骤，计算得到判断矩阵的最大特征值、特征根、随机一致性比率如表7所示：
表7最大特征值、特征根、随机一致性比率
根据以上方法，得到引物适应性综合评价中B层中各参数指标权重如表8。
表8 B层指标相对权重
(5-6)在B层各指标下C层各引物得分情况
对实验获得的C层各引物在各B层参数指标下的引物特性表征值(表9)进行标准化得到表10。对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越佳的参数指标，标准化公式如下：
对于实验引物特性表征值越大则引物适应性越佳的参数指标，标准化公式如下：
xij指的是第i种引物在第j个参数指标下的未经标准化的实验得分情况，yij指的是第i种引物在第j个参数指标下的标准化后的实验得分情况。
表9标准化前C层各引物特性表征值
表10标准化后C层得分情况
(5-7)各引物适应性综合评价
对C层各引物在B层各参数评价指标下的得分情况进行加权，按照权重线性叠加计算综合得分，权重为A层到B层的权重。本实施例各引物适应性综合得分情况如表11所示。
表11各引物适应性综合得分情况
根据表11中的综合得分，可以看出在目标研究区域，人源引物CPQ_056和CPQ_064，猪源引物Pig-2-Bac，反刍动物引物BacCow在各自宿主相关的引物类别中得分较高，表明当需要应用一种引物解析目标区域相应的污染源时，可优先选择这些评分较高的引物，从而可以得到较为准确的结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。