一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法
阅读说明：本技术 一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法 (Primer group, kit and detection method for detecting nonspecific amplification in qPCR (quantitative polymerase chain reaction) process ) 是由 王家旺 张彬 于 2019-03-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法,属于核酸的Real Time PCR检测技术领域,本发明中所述的引物组包括4条非特异性扩增正向引物；所述非特异性扩增的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：6所示。本发明提供的试剂盒包括所述引物组,还包括通用反向扩增引物和LNAFAM水解探针。本发明提供的检测非特异性扩增的试剂盒以及非特异性扩增的检测方法能够定量检测含有聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的PCR反应系统的非特异扩增；定量检测互补同源序列对检测实时PCR非特异性扩增的影响；检测退火或者延伸温度对检测实时PCR非特异性扩增的影响；检测退火或者延伸时间对检测实时PCR非特异性扩增的影响。(The invention provides a primer group, a kit and a detection method for detecting nonspecific amplification in a qPCR (quantitative polymerase chain reaction) process, belonging to the technical field of Real Time PCR detection of nucleic acid, wherein the primer group comprises 4 nonspecific amplification forward primers; the nucleotide sequence of the non-specific amplified forward primer is shown as SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: and 6. The kit provided by the invention comprises the primer group, and also comprises a universal reverse amplification primer and an LNAFAM hydrolysis probe. The kit for detecting non-specific amplification and the detection method for non-specific amplification provided by the invention can quantitatively detect the non-specific amplification of a PCR reaction system containing polymerase (such as Taq DNA polymerase); quantitatively detecting the influence of the complementary homologous sequence on the detection of real-time PCR non-specific amplification; detecting the influence of the annealing or extension temperature on the detection of real-time PCR non-specific amplification; the effect of annealing or extension time on the detection of real-time PCR non-specific amplification was examined.)
本发明是申请号为CN201910219827.4，发明名称为“一种特异性定量PCR反应混合液、miRNA定量检测试剂盒以及检测方法”，申请日为2019年3月22日的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明属于核酸的Real Time PCR检测技术领域，尤其涉及一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法。
背景技术
PCR是聚合酶链式(Polymerase Chain Reaction)反应的简称，是一种可以将DNA分子数以2的指数倍数(2N)扩增的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。由于PCR强大的灵敏度和精确度，许多需要检测和定量特异的DNA分子的应用领域，包括法医学和临床诊断，都高度依赖于PCR。因为在这些领域，误导或错误的结果可导致严重的后果，因此需要高精确的分析，稳定的，准确的和可重复的结果。
但也正是PCR的超强灵敏度，其非特异扩增可导致错误的结果包括假阳性或者假阴性，可谓“差之毫厘，谬以千里”。由于在PCR反应液的配制是在较低温度(室温或者冰上)完成的，PCR所用的聚合酶(通常是Taq DNA polymerase)在这些温度下具有活性，而引物在这些温度下能与之互补同源性较低的DNA分子(有可能是另一条引物)形成部分双链结构。当引物的3’端与其它形成双链结构时，由于聚合酶在这些温度下具有活性，引物能被延伸合成DNA。当这个新合成的DNA的另外一端具有与另一条引物或者同一引物的结合序列时，两端就具有与引物完全互补同源的DNA序列，这个DNA就能形成真正的PCR模板。也就是说，在PCR退火温度时，引物能与这个新合成的DNA结合形成稳定的双链结构而启动DNA合成。当引物之间的3'端末端有互补序列时，这样可以导致引物以引物为模板进行延伸，造成引物二聚体。可见，PCR所用的聚合酶在低于PCR退火温度的酶活性可导致非特异性扩增。非特异性扩增消耗PCR反应资源，就相当于原本可以扩增的原料减少了，即会导致特异扩增的效率降低，甚至没有特异扩增，PCR检测灵敏度降低或者非特异性扩增信号造成假阳性。
为了克服上述DNA聚合酶缺点，研究人员开发出了热启动DNA聚合酶。这是一项重要的PCR创新，因为热启动DNA聚合酶的应用，大大降低了特异性扩增，包括降低引物二聚体的形成，提高了PCR检测的灵敏度。热启动聚合酶的酶活性，在低于寡核苷酸引物与DNA模板退火的温度时被抑制。这通常是通过用单克隆抗体结合Taq酶来抑制Taq酶活性来实现的。单克隆抗体的抑制作用可以通过95℃变性单克隆抗体而永久解除。这项技术进步使得在室温下制备PCR反应混合物时，PCR没有非特异性扩增和原始二聚体的形成。
但实际上，最近的一份报告证明，通过凝胶电泳PCR分析，测试的17种市面上常用的热启动聚合酶有12种在第一次95℃变性前酶活性没有完全被抑制而导致非特异性扩增(Stevens AJ,Appleby S,Kennedy MA.Many commercial hot-start polymerasesdemonstrate activity prior to thermal activation.Biotechniques 2016；61:293–6)。在实时聚合酶链式反应(Real Time PCR)中这种非特异扩增活性可能比上述文献描述的更广泛，是一种普遍存在的现象。这是由于聚合酶的非共价抑制剂如单克隆抗体或者适配体的结合是一个可逆反应：A+BΔC；也就是说聚合酶的活性不可能100％被抑制，这样发生非特异扩增是不可避免的。
生命必须适应千变万化的环境，但遗传物质却是相对稳定不变的。如何以不变的遗传物质应对可变的环境，生命巧妙地运用表观遗传(Epigenetics)作为遗传和环境沟通的桥梁，来调控基因的表达。表观遗传调控最重要的是microRNA(miRNA)。miRNA是长约22个核苷酸碱基的单链RNA，miRNA利用碱基配对原则，与信使RNA(mRNA)结合来特异性地抑制后者的翻译。目前发现人类大约有近八千多种miRNA。每种miRNA可以调节数百或甚至数千个基因的表达。而且，miRNA像激素一样，可以从细胞分泌到血液循环流动中，递送到其他相邻或远端细胞中起作用。因此，miRNA直接或间接调控几乎所有的基因，调控细胞的各种功能。由于miRNA具有重要的基因调控作用，其异常表达与各种疾病如癌症密切相关。目前已经发现miRNA的失调与四百多种疾病有关。当身体受到致病微生物或癌细胞危害时，免疫反应需要对许多基因进行快速和高度协调的全身性调节，以建立有效的防御来鉴别和消除致病因子。miRNA介导的基因调节比需要转录的其他表观遗传机制(如甲基化)更快。只有miRNA调控网络才能满足这种快速的基因调节的需要。
与其它分子检测相比，miRNA检测无疑具有巨大的优势。miRNA在血液中十分稳定，血浆miRNA在恶劣条件如冷冻和解冻，高温储存，酸性条件和RNA酶消化下是稳定的。这使得miRNA作为生物标志物具有很大的吸引力，非常适合作为疾病的生物标记分子。但由于miRNA只有二十几个碱基，对其检测比较困难，至今缺乏精确检测miRNA的技术，极大地限制了其在临床中的应用。
基于SYBR Green的RT-qPCR的检测方法存在非特异性高和灵敏度低的缺点。这是因为所有种类的核酸都能结合SYBR Green而产生可检测到的信号，干扰真正的信号的检测。而Taqman qPCR测定miRNA的方法要求每miRNA需要一个特异性逆转录引物和一个特异性探针，费用昂贵。而且逆转录引物只有6-8个碱基是miRNA特异的。由六个碱基只能设计出几百个miRNA特异的逆转录引物，而人类有近八千多个miRNA。因此，逆转录引物并不是特异的。
此外，上述两种方法都存在一个共同的缺点，就是同样的成熟miRNA序列存在于基因组DNA和其它RNA如pri-miRNA，pre-miRNA，甚至mRNA中，可以导致非特异检测。而PCR通常扩增几百万到几千万倍。所谓差之毫厘，谬以千里。非特异扩增将造成非特异检测。因此，现有技术缺乏精确度和灵敏度，不适合于高通量精确测定miRNA。存在结果的可靠性问题，如不同实验室的检测结果不具有可比性，甚至有可能得出相反的结果，如有关乳腺癌患者血液循环中的miR-195和let-7a的报道存在明显差异。
非特异性扩增仍然是qPCR精确检测miRNA的最大问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组，包括4条非特异性扩增正向引物；所述非特异性扩增的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供了一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的试剂盒，包括所述的引物组。
优选的，还包括通用反向扩增引物和LNAFAM水解探针。
优选的，所述通用反向扩增引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
优选的，所述LNAFAM水解探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的方法，包括以下步骤：
S1)特异性反应：将已知浓度的特异性模板DNA进行梯度稀释，获得不同浓度的特异性模板DNA；分别以所述不同浓度的特异性模板DNA为模板，进行特异性qPCR扩增，获得特异性PCR扩增产物，然后根据特异性模板DNA的量和相应的扩增产物的量制作PCR标准曲线；所述特异性qPCR扩增体系包括特异性模板DNA、特异性正向扩增引物、通用反向引物、PCR反应缓冲液和水解探针；
S2)非特异性反应：将所述步骤1)中的特异性qPCR中的扩增体系中添加非特异性模板DNA和权利要求1中所述的非特异性扩增的正向引物，然后进行非特异性qPCR扩增获得非特异性PCR扩增产物；所述特异性qPCR扩增和非特异性qPCR扩增的扩增程序一致；
S3)根据步骤S2)中所述的非特异性PCR扩增产物，利用步骤S1)中的标准曲线分别计算特异性扩增效率和非特异性扩增效率；非特异性的扩增效率和特异性的扩增效率的百分比为非特异性扩增定量指标。
本发明的有益效果：本发明提供的检测非特异性扩增的试剂盒以及非特异性扩增的检测方法能够定量检测含有聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的PCR反应系统的非特异扩增；定量检测互补同源序列对检测实时PCR非特异性扩增的影响；检测退火或者延伸温度对检测实时PCR非特异性扩增的影响；检测退火或者延伸时间对检测实时PCR非特异性扩增的影响。
附图说明
图1为本发明提供的特异性定量PCR反应混合液与三种市面上常用的2X qPCRHot-start DNApolymerase MasterMix(CompetitorA，Competitor B，Competitor C)的非特异性扩增的比较；
图2为引物/非特异模板之间互补同源性的高低对非特异扩增的影响；
图3为用三个非特异性引物检测miRNA的非特异性扩增结果；
图4为PCR引物的3’端与其它DNA分子的3’端和内部互补同源性对PCR非特异扩增的影响；其中(A)为部分热启动酶；(B)、(C)为通过用固体石蜡隔离DNA聚合酶实现完全热启动，实验设计参照图1；(D)部分热启动PCR和完全热启动PCR对PCR非特异扩增的影响；图上的数字表示各个PCR实验组的相对扩增信号的倍数和p值；图示代表了4次独立实验中的一次；
图5为本发明所述的特异性定量PCR反应混合液与一种市面上常用的的2X qPCRHot-start DNApolymerase MasterMix(SupplierA)对PCR引物的3’端与其它DNA的3’端和内部互补同源性的非特异性扩增结果比较；
图6为本发明所述的特异性定量PCR反应混合液与三种市面上常用的2X qPCRHot-start DNA polymerase Master Mix(Supplier A，Supplier B，Supplier C)的PCR延伸时间与非特异性扩增的比较；图上的数字表示各个酶的PCR延伸时间为30秒和18秒时的相对扩增信号的倍数和p值，图示代表了3次独立实验中的一次；
图7为存储时间对本发明提供的无水miRNA定量检测试剂盒的PCR扩增效率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种特异性定量PCR反应混合液，以水为溶剂，包括以下浓度的组成：Tris-HCl(70～80)mmol/L，(NH4)2SO4(15～25)mmol/L，Triton-100(0.08～0.12)％，MgCl2(2～3)mmol/L，dNTPs(150～250)μmol/L，海藻糖(190～210)mmol/L和热启动Taq DNA聚合酶(45000～55000)U/L；所述Tris-HCl的pH值为8.5～9.0。
在本发明中，所述特异性定量PCR反应混合液，以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组成：Tris-HCl 75mmol/L，(NH4)2SO420mmol/L，Triton-1000.1％，MgCl22.5mmol/L，dNTPs 200μmol/L，海藻糖200mmol/L和Taq DNA聚合酶50000U/L；所述Tris-HCl的pH值优选为8.8。
本发明中所述特异性定量PCR反应混合液应用于PCR扩增，所述特异性定量PCR反应混合液对于扩增的目的核酸没有任何限定，可应用于所有类型的DNA或RNA的PCR扩增。本发明中，所述特异性定量PCR反应混合液为2倍工作浓度的溶液；在本发明具体实施例中，以miRNA的扩增为例。本发明中，所述特异性定量PCR反应混合液能够进行高特异性PCR扩增，大大降低非特异性PCR扩增反应。
本发明还提供了一种miRNA定量检测试剂盒，包括所述的PCR反应混合液。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括LNAFAM水解探针和通用反向扩增引物；所述LNAFAM水解探针具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述通用反向扩增引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明中，所述LNAFAM水解探针的使用浓度优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L；所述通用反向扩增引物的使用浓度优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。
本发明中，所述miRNA定量检测试剂盒优选的还能够制作为无水miRNA定量检测试剂盒；所述无水miRNA定量检测试剂盒的制备方法优选的如下：将所述试剂盒的组分置于容器后，真空干燥获得无水miRNA定量检测试剂盒。在本发明具体实施过程中，将所述特异性定量PCR反应混合液、LNAFAM水解探针和通用反向扩增引物加入PCR八连管中，真空干燥获得无水miRNA定量检测试剂盒；所述真空干燥的真空度优选为-0.08～-0.1Mpa，更优选为-0.09Mpa；所述真空干燥的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃。本发明中，所述无水miRNA定量检测试剂盒优选的置于黑暗环境中保存；所述无水miRNA定量检测试剂盒无需低温储存，在室温条件下储存六周，PCR扩增效率保持不变。
本发明提供了一种利用qPCR对样品中miRNA进行定量的检测方法，包括以下步骤：1)将样品总RNA、聚A聚合酶缓冲液、大肠杆菌聚A聚合酶、rATP、MnCl2和无RNase水混合孵育获得多聚腺苷酸化反应产物；2)将步骤1)中获得的多聚腺苷酸化反应产物、RT缓冲液、dNTP、逆转录引物、核酸酶阻断剂和无RNase水混合后，进行逆转录获得逆转录产物；3)将所述逆转录产物与所述的特异性定量PCR反应混合液混合后进行qPCR扩增获得样品中miRNA的定量。
在本发明中，将样品总RNA、聚A聚合酶缓冲液、大肠杆菌聚A聚合酶、rATP、MnCl2和无RNase水混合孵育获得多聚腺苷酸化反应产物。在本发明中，反应的体系优选为20μL；本发明对所述样品总RNA、聚A聚合酶缓冲液、rATP、MnCl2和无RNase水的体积比例和用量没有特殊限定，参考本领域常规的多聚腺苷酸化反应体系即可。在本发明具体实施过程中，所述样品总RNA的体积为1μL，总量为30ng～1μg；所述聚A聚合酶缓冲液为5X的聚A聚合酶缓冲液，所述聚A聚合酶缓冲液的体积为4μL；所述大肠杆菌聚A聚合酶的体积为1μL；所述rATP的浓度为10mmol/L，所述rATP的体积为1μL；所述MnCl2的浓度为25mmol/L，所述MnCl2的体积为1μL；所述无RNase水的体积为12μL。本发明中，所述混合孵育的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述混合孵育的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明在所述混合孵育后优选的进行反应的终止；所述终止的温度优选为95℃，所述终止的时间5min；所述终止反应结束后，优选的将获得多聚腺苷酸化反应产物置于0℃保存，更优选的将所述获得多聚腺苷酸化反应产物置于冰上。
本发明在获得所述多聚腺苷酸化反应产物，将所述多聚腺苷酸化反应产物、RT缓冲液、dNTP、逆转录引物、核酸酶阻断剂和无RNase水混合后，进行逆转录获得逆转录产物；本发明对所述逆转录体系各个组分的体积和用量没有特殊要求参考本领域常规的逆转录体系各个组份的体积和用量即可。在本发明具体实施过程中，所述逆转录的体系以20μL计，包括以下组成：
多聚腺苷酸化反应产物，4μL；
10×RT缓冲液，2μL；
100mM dNTP混合物，0.8μL；
10μmol/L逆转录引物，1μL；
核酸酶阻断剂NEB，1μL；
无RNase水，11.2μL。
本发明中，所述逆转录的温度优选为40～44℃，更优选为42℃；所述逆转录的时间优选为50～70min，更优选为60min。本发明在所述逆转录之前优选的将所述逆转录体系置于55℃孵育5min；以利于逆转录体系中各组分的混匀。本发明在所述逆转录后优选的进行逆转录的终止；所述终止的温度优选为95℃，所述终止的时间5min。
本发明在所述逆转录结束后，将获得的逆转录产物与所述的PCR反应混合液混合后进行qPCR扩增获得样品中miRNA的定量。在本发明中，所述所述qPCR扩增的扩增体系，以10μL计，包括以下浓度的组成：
。本发明中，所述qPCR扩增的扩增程序优选的包括以下步骤：95℃，60s～10min；95℃，5～30s，65℃，18～120s，40个循环。
本发明中，所述特异引物包括特异性上游引物和特异性下游引物；所述特异引物的核苷酸序列满足以下要求：同一引物的3’和5’端不具有3个以上的同源碱基，任意两条不同引物的3’端不具有3个以上的互补碱基，一条引物之间的3’和另一条引物的5’端不具有3个以上的同源碱基；引物的3’端与扩增体系中特异性模板以外的DNA分子的3’端不具有3个以上的互补碱基，与其它DNA分子5’端的不应该具有3个以上的同源碱基。
本发明中，所述qPCR扩增结束后获得qPCR扩增产物；本发明利用本领域常规的分析方法分析所述扩增产物获得样品中miRNA的定量。
本发明中，所述利用qPCR对样品中miRNA进行定量的检测方法，通过采用所述特异性定量PCR反应混合液，能够极大地提高了PCR扩增的特异性，同时本发明所述检测方法中进一步的限定了引物设计的具体要求，也能够降低非特异性扩增；进一步的，本发明所述的检测方法，将延伸时间限定为18～30s，延伸时间的恰当缩短也能够减少非特异性扩增；利用本发明所述的检测方法可以杜绝PCR中的非特异性扩增。
本发明提供一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的试剂盒，包括4条非特异性扩增正向引物；所述非特异性扩增的正向引物的核苷酸序列如SEQID NO：3～SEQ ID NO：6所示。
本发明中，所述检测qPCR过程中的非特异性扩增的试剂盒优选的还包括通用反向引物URP和LNAFAM水解探针。
本发明提供一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的方法，包括以下步骤：
S1)特异性反应：将已知浓度的特异性模板DNA进行梯度稀释，获得不同浓度的特异性模板DNA；分别以所述不同浓度的特异性模板DNA为模板，进行特异性qPCR扩增，获得特异性PCR扩增产物，然后根据特异性模板DNA的量和相应的扩增产物的量制作PCR标准曲线；所述特异性qPCR扩增体系包括特异性模板DNA、特异性正向扩增引物、通用反向引物、PCR反应缓冲液和水解探针；
S2)非特异性反应：将所述步骤1)中的特异性qPCR中的扩增体系中添加非特异性模板DNA和所述的非特异性扩增的正向引物，然后进行非特异性qPCR扩增获得非特异性PCR扩增产物；所述特异性qPCR扩增和非特异性qPCR扩增的扩增程序一致；
S3)根据步骤S2)中所述的非特异性PCR扩增产物，利用步骤S1)中的标准曲线分别计算特异性扩增效率和非特异性扩增效率；非特异性的扩增效率和特异性的扩增效率的百分比为非特异性扩增定量指标。
本发明中，步骤S1)中所述梯度稀释优选的为10倍梯度稀释；所述梯度稀释优选的设置5～7个梯度，更优选为6个梯度。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供的特异性定量PCR反应混合液：以水为溶剂，包括以下浓度的组成：Tris-HCl 75mmol/L，(NH4)2SO420mmol/L，Triton-1000.1％，MgCl2(2～3)mmol/L，dNTPs200μmol/L，海藻糖200mmol/L和Taq DNA聚合酶50000)U/L；所述Tris-HCl的pH值为8.8。
所述特异性定量PCR反应混合液与三种市面上常用的2X qPCRHot-startDNApolymerase MasterMix(CompetitorA，Competitor B，Competitor C)的非特异性扩增比较。上文中提到的Competitor A，Competitor B，Competitor C(SupplierA，SupplierB，Supplier C)分别为Universal Probe qPCRMasterMix(New EnglandBiolabs(NEB)，Ipswich,MA，USA)，TaqMan FastAdvanced Master Mix(Thermo FisherScientific,Waltham，MA，USA)和Multiplex Master Mix(Thermo FisherScientific,Waltham，MA，USA)
实验设计参照文献(Stevens AJ,Appleby S,Kennedy MA.Many commercial hot-start polymerases demonstrate activity prior to thermalactivation.Biotechniques 2016；61:293–6)，与文献记载内容不同的是，采用Taqman探针检测扩增信号。
实验所用材料如下：
1)LNARTP(0.1μmol/L)
2)P36F1(NSP1)10μmol/L
3)miR0601P7925(NSP2)10μmol/L
4)CompetitorA公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase MasterMix
5)CompetitorB公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase MasterMix
6)Competitor C公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase MasterMix
7)本实施例提供的特异性定量PCR反应混合液(Universal and SpecificQuantification ofmiRNA)2X qPCR MasterMix，简称USmiR
8)LNAFAM(10μmol/L)
9)URP(10μmol/L)
10)RoxII
11)Nuclease-free Water
具体的反应体系如下：
使用CompetitorA公司PCR反应液的体系：
使用Competitor B公司PCR反应液的体系：
使用Competitor C公司PCR反应液的体系：
使用本实施例提供的特异性定量PCR反应混合液的体系：
上述反应体系的扩增程序如下：
实验结果如图1所示，其中图1左为以Non-Specific Primer-1(NSP1)为引物进行扩增的结果；图1右为以Non-Specific Primer(NSP2)为引物进行扩增的结果。
Non-Specific Primer-1(NSP1)和Non-Specific Primer(NSP2)的3’端与一个具有探针和反向引物结合位点的合成的DNA片段(序列见表3：非特异模板，这个序列与非特异引物序列扩增后形成即本实施例中扩增的目的序列)的3’端具有一定的互补同源性。NSP1的互补同源性比NSP2高。图上的数字表示各个酶的相对扩增信号与US-miR扩增信号的倍数和p值。图示代表了3次独立实验中的一次。
由于非特异扩增主要是由聚合酶扩增体系和引物/非特异模板之间互补同源性决定的。上述的结果已经证明，不同的“热启动”聚合酶扩增体系对非特异扩增的效率具有显著不同的影响。利用本实施例提供的特异性定量PCR反应混合液体系进行扩增的非特异性扩增显著降低。
实施例2
利用实施例1中所述的特异性定量PCR反应混合液检测两对非特异引物NSP1和NSP1a；NSP3和NSP3a的非特异性扩增结果。
实验材料如下：
1)ArtDNA4(Internal Complementary-2)
2)P36F1(NSP1)10μmol/L
3)P36F1a(NSP1a)10μmol/L
4)miR0601P7933(NSP3)10μmol/L
5)miR0601P7933a(NSP3a)10μmol/L
6)实施例1提供的特异性定量PCR反应混合液(Universal and SpecificQuantification ofmiRNA)2X qPCR MasterMix，简称USmiR 2X qPCRMix
7)LNAFAM(10μmol/L)
8)URP(10μmol/L)
9)RoxII
10)Nuclease-free Water。
具体的扩增体系如下：
上述反应体系的扩增程序：
扩增的非特异性检测结果如图2所示，3’端互补同源性序列高引物的比3’端互补同源性序列低的引物的非特异扩增要高几百倍，说明引物的3’端与其它DNA片段的3’端的互补同源性的高低对非特异扩增的影响具有显著的影响。
图1的左右图的实验结果与图2的实验类似：NSP1与非特异模板3’端之间的互补同源性要比NSP2高，结果是NSP1的非特异扩增比NSP2引起的非特异扩增高了八万倍左右。因此，在设计引物时应该避免或者尽量减少引物的3’端与其它DNA片段的3’端的互补同源性，否则可能导致严重的非特异扩增。另外非特异模板里有其它非模板的DNA分子时，优选的引物可以显著降低非特异扩增。
实施例3
RT cDNA中残留逆转录引物是否可以作为非特异扩增的模板的探究
实施例图1所示的实验所用的非特异模板是通用逆转录引物，因此在RT后残留在cDNA溶液中的通用逆转录引物可能作为非特异模板导致非特异扩增。为了证实这种可能性，由于Phi29 DNApolymerase具有3’-5’外切酶活性，采用Phi29 DNApolymerase来降解单链残留的通用逆转录引物。
实验材料
1)LNARTP(0.1μmol/L)
2)10x Phi29 buffer
3)Phi29 DNAPolymerase
4)dNTPs(10mmol/L)
5)DTT(0.1mol/L)
6)Trehalose(1mol/L)
7)P36F1(NSP1)10μmol/L
8)miR0601P7925(NSP2)10μmol/L
9)miR0601P7933(NSP3)10μmol/L
10)(Universal and Specific Quantification ofmiRNA，USQmiR)2XqPCRMasterMix
11)LNAFAM(10μmol/L)
12)URP(10μmol/L)
13)ROXⅡ
14)Nuclease-free Water。
2xPhi29 mix体系：
注：冰上配制，加到等体积的RT产物中，吹打混匀，50℃60min，65℃，10min。
之后进行qPCR反应；
qPCR反应体系如下：
qPCR的反应程序如下：
结果如图3所示，用Phi29DNApolymerase处理cDNA后，确实能显著降低非特异扩增近一百倍(图3左)，但Phi29DNApolymerase处理对特异扩增并没有影响(图3右)。这个实验证明，用polyA/通用逆转录引物方法逆转录miRNA成cDNA时，残留逆转录引物可能作为非特异模板导致非特异扩增。
实施例4
PCR引物的3’端与其它DNA的3’端和内部互补同源性对PCR非特异扩增的影响的探究
实验材料
1)LNARTP(0.1μmol/L)
2)P36F1(NSP1)10μmol/L
3)MiR0601P7925(NSP2)10μmol/L
4)CompetitorA公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase Master Mix
5)CompetitorB公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase Master Mix
6)Competitor C公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase Master Mix
7)实施例1中提供的特异性定量PCR反应混合液(Universal and SpecificQuantification ofmiRNA)2X qPCR MasterMix
8)LNAFAM(10μmol/L)
9)URP(10μmol/L)
10)RoxII
11)Nuclease-free Water
12)Competitor D公司石蜡(50～52℃)
13)Competitor D公司石蜡(58～60℃)
所述扩增体系如下：
所述扩增的程序如下：
结果如图4所示，
PCR引物的3’端与其它DNA的3’端和内部互补同源性对PCR非特异扩增具有显著不同的影响。其它DNA与PCR引物的3’端互补同源性在DNA的3’端时，非特异扩增量是在内部互补同源性的202倍(图4-A)。由于市面上常用的热启动DNA聚合酶，在第一次95℃变性前酶活性没有完全被抑制而具有一定的聚合酶活性，这些酶不具有完全热启动功能，而具有部分热启动功能，即这些DNA聚合酶在准备PCR的过程中和PCR第一次95℃变性之前有部分聚合酶能进行DNA合成。通过用固体石蜡隔离PCR引物和DNA聚合酶等其它成分(具体方法为：先加7.5μl除正向引物以外的其它成分，在加2.5μl融化的石蜡，石蜡凝固后加2.5μl引物)，使得所聚合酶在准备PCR的过程中和PCR开始时温度达到一定的温度之前不能延伸引物，即不能合成DNA，达到完全热启动(图4-B，4-C)。在完全热启动情况下，其它DNA与PCR引物的3’端互补同源性在DNA的3’端时，非特异扩增量是在内部互补同源性的37倍(图4-B，用融点为50-52℃的石蜡)和33倍(图4-C，用融点为58-60℃的石蜡)。这说明在DNA聚合酶具有酶活性的温度范围内，非特异扩增与温度负相关的，即温度越低，非特异扩增越严重，反之，温度越高，非特异扩增越少。这符合DNA复性的热动力学。值得注意的是在温度高到复性温度时才允许DNA合成情况下，仍然有非特异性扩增。
实施例5
实施例1中提供的特异性定量PCR反应混合液与一种市面上常用的的2X qPCRHot-start DNApolymerase MasterMix(SupplierA)对PCR引物的3’端与其它DNA的3’端和内部互补同源性的非特异性扩增比较。
实验材料
模板：
1)LNARTP(0.1μmol/L)
2)ArtDNA3(10pmol/L)
3)ArtDNA4(10pmol/L)
引物：
4)P36F1(NSP1)10μmol/L
5)URP(10μmol/L)
酶及其它：
6)CompetitorA公司2X qPCR Hot-start DNApolymerase Master Mix
7)实施例1中的特异性定量PCR反应混合液
8)LNAFAM(10uM)
9)ROXⅡ
10)Nuclease-free water
qPCR反应体系1：
qPCR反应体系2：
扩增程序如下：
实验结果如图5所示，图5中，图上的数字表示各个酶的相对扩增信号与本发明提供的特异性定量PCR反应混合液扩增信号的倍数和p值；图示代表了3次独立实验中的一次。由图5可知，添加本发明提供的特异性定量PCR反应混合液的体系中，不论非特异模板与引物的互补同源序列在非特异模板的3’端或是非特异模板的内部，都没有检测到非特异性扩增。
实施例6
实施例1中的特异性定量PCR反应混合液USQ-miR 2X qPCR Master Mix与三种市面上常用的2X qPCR Hot-start DNA polymerase Master Mix(Supplier A，Supplier B，Supplier C)的PCR延伸时间与非特异性扩增的比较。
实验设计参照文献(Stevens AJ,Appleby S,Kennedy MA.Many commercial hot-start polymerases demonstrate activity prior to thermalactivation.Biotechniques 2016；61:293–6)，与文献记载内容不同的是，采用Taqman探针检测扩增信号。
实验材料、扩增体系与实施例1中记载的一致；扩增程序将延伸时间改为18s和30s。
结果如图6所示，图6中的数字表示各个酶的PCR延伸时间为30s和18s时的相对扩增信号的倍数和p值；图示代表了3次独立实验中的一次。
在延伸时间比较短的时候(18～30s)，能够达到非特异性扩增的降低可达一到二万多倍，但在延伸时间比较长的时候(60s)非特异扩增的相对量的比值降到几百倍到一千倍以上。这可能是PCR资源的消耗而趋于饱和，但非特异扩增的相对量的还远没有达到饱和的原因。本发明中的USQ-miR-qPCR扩增反应体系，在延伸时间比较短的时候(18～30s)，非特异扩增的相对量没有变化，但在延伸时间增加到60s后，非特异扩增的相对量增加了22倍左右。因此USQ-miR qPCR扩增反应体系的延伸时间优选在18～30s内
表1市售的主要qPCR扩增反应体系与本发明提供的qPCR扩增反应体系(USQ-miR2X qPCR MasterMix)的非特异扩增的比较(相对量的比值)
实施例7
无水miRNA定量检测试剂盒的制备
在微量PCR扩增八连排管中按照PCR总体积20μL的量加入实施例1中的特异性定量PCR反应混合液(2X USQ-miR qPCR)，0.2μmol/L终浓度的正向引物，0.2μmol/L终浓度的通用反向引物URP和0.1μmol/L终浓度的LNAFAM水解探针，室温真空干燥(真空度-0.09Mpa，时间3～8h)制备后，置于室温黑暗处备用。
无水miRNA定量检测试剂盒储存周期的检验
模板为10nmol/L终浓度的ArtDNA4，正向引物是ArtRNA4。除模板以外的PCR反应液过夜真空干燥，分别在干燥后的一周，二周，四周和六周，稀释模板后加20μl/孔。每个八联排管的上4个孔(A-D)为ArtDNA4引物(阳性)，下面4个孔(E-H)为NSP2(阴性)结果。结果如图7所示，所述无水miRNA定量检测试剂盒在室温储存6周内扩增效率保持不变。
实施例8
将实施例1中的特异性定量PCR反应混合液应用于检测临床样品的miRNA
扩增体系和程序与实施例5qPCR反应体系2中的体系相同：
表2血浆和组织miRNA的特异扩增检测(Cq值±SD)
NSP1和NSP2：非特异引物(人工序列，见表1)，SP1，SP2和SP3：特异引物，分别对应于SP1:hsa-miR-548a-5p,SP2:hsa-miR-93-5p和SP3:hsa-miR-92a-3p。NTC:No TemplateControl。SP1*，SP2*，SP3*表示用相应miRNA特异的逆转录引物(见表3)合成cDNA。“无”表示没有扩增信号。
从表2中可以看出，由于这两个非特异引物(NSP1和NSP2)的序列是人工的，不存在于自然中，所以不应该检测出信号，确实所有非特异引物(人工序列)都没有PCR扩增信号。而且，三个特异引物虽然能检测天然存在于人体中的miRNA，但仅在它们对应的miRNA逆转录后才能检测出扩增信号。
实施例9
检测qPCR过程中的非特异性扩增的试剂盒
试剂盒组成：包括qPCR所需的所有成分，即模板(表3：非特异模板LNARTP)，正反向引物和LNAFAM探针和实施例1中的特异性定量PCR反应混合液(2X qPCR Master Mix)作为对照。探针，逆转录引物，PCR正反向引物和其它寡核苷酸的来源委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2X PCR master DNA polymerase mix NEB,Thermo FisherScientific(Waltham，MA，USA)，TAKARA。化学试剂购自Sigma，固体石蜡购自上海标本模型厂。
检测方法：
实验设置包括标准曲线用来定量模板量和作为阳性对照，非特异性扩增的检测包括用两对非特异正向引物共四个引物，四个实验组，每组实验至少三个重复。按照制造商的说明，使用2xDNA聚合酶混合物制备PCR反应混合物，并含有0.2μmol/L(终浓度)的正向引物、通用反向引物(URP)和0.2μmol/L(终浓度)的LNAFAM探针。在10μLPCR反应体积中的PCR模板用量：合成的DNA模板浓度为0.1μmol/L～10μmol/L，取0.08μL做模板，RT产物10倍稀释后取0.08μL。
PCR循环参数为：
95℃10min(加入本发明实施例1中的特异性定量PCR反应混合液的反应体系)
或者95℃1min(加入其他市售的PCR反应混合液的反应体系)；
然后95℃30s，65℃1min，40个循环。
表3本发明上述实施例中所用寡核苷酸名称和序列汇总
寡核苷酸包括qPCR所需的模板(非特异模板)，正反向引物和水解探针。其中正向引物是非特异的，其具有下划线的碱基为正向引物与非特异模板LNARTP的3’端的互补同源序列。非特异正向引物1和2是一对，3和4是一对。每对引物的第二个引物是将第一个引物3’端的互补同源序列去掉几个碱基得到的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 健生生物技术有限公司
<120> 一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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