阅读说明：本技术 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用 (D-psicose3-epimerase mutant and application thereof ) 是由 柳志强 贾东旭 孙晨奕 彭晨 金利群 郑裕国 陈德水 廖承军 程新平 李勉 毛宝 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体,及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体,由所示氨基酸经定点突变而得,所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第242位、(2)第105位、(3)第210位、(4)第147位、(5)第184位。本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其突变体,该突变体具有高最适反应温度85℃,解决了现有酶无法在高温生产D-psicose的技术难题。使用本突变体生产D-psicose,产物得率最高可达40.1％,优于原始酶和其他突变酶的转化效果,具有较好工业应用前景。(The invention relates to a D-psicose3-epimerase mutant and application thereof in preparing D-psicose by catalyzing D-fructose isomerization by microorganisms. The D-psicose3-epimerase mutant is obtained by site-directed mutagenesis of the amino acids shown, wherein the site of: (1) 242 th bit, (2) 105 th bit, (3) 210 th bit, (4) 147 th bit, and (5) 184 th bit. The invention has the following beneficial effects: the invention provides a brand-new D-psicose3-epimerase and a mutant thereof, wherein the mutant has a high optimal reaction temperature of 85 ℃, and solves the technical problem that the existing enzyme cannot produce D-psicose at high temperature. The mutant is used for producing D-psicose, the yield of the product can reach 40.1 percent at most, the conversion effect of the D-psicose is better than that of the original enzyme and other mutant enzymes, and the D-psicose has better industrial application prospect.)

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

(二)背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)是D-果糖的C-3差向异构体，属于稀有糖家族，因其高甜度低能量，是一种理想的蔗糖替代物。D-psicose通过竞争吸收和***转运糖蛋白，可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收，进而减少体内脂肪累积，降低糖尿病风险。长期和短期的D-psicose膳食补充，对II型糖尿病患者和胰岛β-细胞功能缺陷患者细胞均有明显的益处。D-psicose在自然界中含量稀少，仅在部分植物(如小麦和鼠刺属植物)中有发现，直接提取导致资源浪费和环境破坏。采用化学合成法，催化反应复杂，纯化过程繁琐，化学污染严重。因此，需要采用更加高效的合成方式制备D-psicose。

生物转化是一种利用微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂，将底物转化为产物的过程。生物转化具有反应条件温和、原料利用率高的特点，同时转化过程具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，能够保证目标化合物的高效合成。目前，利用异构酶或含有该酶的细胞为生物催化剂进行异构化反应制备多种糖类化合物，已成为制糖工业重要的经济增长点。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，简称DPE)属于酮糖3-差向异构酶家族，用于催化D-果糖异构化生成D-psicose。当前的D-psicose生产技术主要集中在日本稀有糖研究中心、首尔国立大学等机构，所用的DPE主要来源于Agrobacteriumtumefaciens ATCC33970、Clostridium cellulolyticum H10和Rhodobacter sphaeroidesSK011等野生菌(Kim T et al.，PLoS ONE,2016,11(7):e0160044.)。上述DPE均不属于耐热性酶，只能在50～60℃的异构化温度下进行催化反应，D-果糖转化率介于25～35％之间。

有报道指出，DPE介入的D-果糖异构化过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向D-psicose方向进行。如果能在高温如70℃或更高的异构化温度下催化，促使平衡正向进行，提高D-果糖转化率，获得高浓度产物，将大幅度减小生产、提取等成本。目前，在用于合成的D-psicose的DPE酶源较少，能够满足高温催化制备高浓度D-psicose的酶更是罕见。在耐高温酶制剂没有成功投放于市场的背景下，研发新型耐高温DPE对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

(三)

发明内容

本发明目的是提供一种在70℃以上仍具有较高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，及其在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，由SEQ ID NO.5所示氨基酸经定点突变而得，所述点突变位点为下列中的一个或多个：(1)第242位、(2)第105位、(3)第210位、(4)第147位、(5)第184位。

具体的，所述点突变为下列中的一个或多个：(1)第242位缬氨酸V突变为赖氨酸K、亮氨酸L、酪氨酸Y或天冬酰胺N；(2)第105位甘氨酸G突变为天冬酰胺N、天冬氨酸D或谷氨酸E；(3)第210位异亮氨酸I突变为苏氨酸T、苯丙氨酸F、谷氨酰胺Q或丝氨酸S；(4)第147位亮氨酸L突变为赖氨酸K、天冬酰胺N或半胱氨酸C、(5)第184位苏氨酸T突变为酪氨酸Y或苯丙氨酸F。

优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明挖掘筛选到新型DPE并进行定点突变，通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌用于在高温下生产D-psicose，提升了现有的糖异构体化合物的合成水平，具有重要的理论意义和应用开发潜力，对于填补缺乏耐高温酶的市场空白具有重大意义。

本发明还涉及所述的突变体在微生物催化D-果糖异构化制备D-阿洛酮糖中的应用。

优选的，所述催化在70～85℃下进行。

具体的，所述应用为：以含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以D-果糖为底物，以钴盐为助剂，以Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液为反应介质，在75～85℃，100～300r/min条件下反应，制得D-阿洛酮糖。

优选的，所述反应体系中，底物初始浓度为300～700g/L，湿菌体的用量为10～50g/L，钴盐初始浓度为0.5～5mM。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种全新的DPE及其突变体，该突变体具有高最适反应温度85℃，解决了现有酶无法在高温生产D-psicose的技术难题。使用本突变体生产D-psicose，在80℃转化条件下，获得的NtDPE突变体所生产的D-psicose转化率高达50.12％，高于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有较好应用前景。

(四)附图说明

图1为重组酶的最适温度示意图；

图2为金属离子对重组酶活力的影响示意图。

(五)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：新型DPE的筛选与活力测定

1、酶的来源与重组菌的构建

从NCBI数据库中获得新型DPE，分别来源于Rhizobiales bacterium(GenBank编号WP_112533378.1)、Martelella sp.(GenBank编号MAU19484.1)、Novibacillusthermophilus(GenBank编号WP_077721022.1)，并命名为RbDPE、MsDPE和NtDPE。根据氨基酸序列，依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了三条选择的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/RbDPE、pET28b/MsDPE和pET28b/NtDPE。

SEQIDNO.1：

MKHGIYYSYWEKEWSAKFGPYVEKVAKLGFDVIEVAAHHINSYSDAELAAIRQASKDNGIILTAGIGPTKQKNLSSPDADVRKAGKAFFEQTLTNVAKLDIKSIGGALHSYWPVDYTQPVDKIGDRARGVEGIHGIADFASNLGINLCIEVLNRFENHVLNTAAEGVAFVKDVGKSNVKVMLDTFHMNIEEDSFGDAIRTAGPLLGHFHTGENNRRVPGTGRIPWHEIGLALREINYTGAVVMEPFVKTGGGIGSDIRVWRDLSNGATEAKLDEDARNSLAFSRFVLGAHHHHHH

SEQIDNO.3：

MKFGIYYSYWEQEWSADCLRHVEKVAKLGFDVIEIAAHHLNSFSPAHIDDIARCARDNNIAVTSGLGPSQERNLSSPDADIRKAGRAFFEETLVNIAKLDVHIIGGALHSYWPVDYSQPVDKEGDRARGVEGISSLADFAADLGIDLCIEVLNRFENHVINTAEEGVAFVRDVGKNNVKVMLDTFHMNIEEDSFRAAIRTAGPLLGHFHTGENNRRVPGKGRLPWHEIGAALREIDYRGAVVMEPFVKSGGGIGRDIRVWRDLSNGADEAKMDQDAREALAFSRYVLGGDKGHHHHHH

SEQIDNO.5：

MKYGVYFAYWESSWNVNFEKYVQKVKELGFDILEVAALGLVNLPDEKLERLKQLAEQHNVILTAGIGLPKEYDVSSSDATVRRNGIAFMKKVMDAMYQAGIDRVGGTVYSYWPADYSHPFDKPTARKHSIESVKELAEYARQYDITLLIETLNRFEQFLLNDAEEAVSYVKEVDEPNVKVMLDTFHMNIEEDNIADAIRYTGDHLGHLHIGEANRKVPGKGSMPWKEIGQALKDIHYDGYVVMEPFVKTGGQVGQDIKVWRDLSGNATEEQLDRELAESLVFVKQAFGELHHHHHH

2、重组菌的转化与诱导表达

将获得的重组表达质粒pET28b/RbDPE、pET28b/MsDPE和pET28b/NtDPE转化至Escherichia coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为100μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含DPE基因的基因工程菌。

LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基在LB液体培养基中添加15g/L琼脂；121℃高压灭菌20min；使用前添加终浓度100μg/mL卡那霉素。

将基因工程菌接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养至OD₆₀₀约0.6～0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4～0.6，再向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，于25℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

3、重组菌的酶活测定

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎。取1g制备的湿菌体，用50mL Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液悬浮，在39W条件下超声破碎15min，制备获得超声破碎后的混悬液，离心，收集上清液。

酶活反应体系：50g/L的D-果糖、1mM CoCl₂.6H₂O100μL上述上清液(酶液)，再加入适量50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液至总体积1mL。反应条件：于60℃条件下反应10min，沸水煮沸10min终止反应，稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过膜；采用HPLC检测D-psicose浓度。分析柱为Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm，9μm，伯乐生命医学产品有限公司)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters717进样器。

酶活定义：60℃和pH 7.5下，每分钟将D-果糖异构化生成1μmol D-阿洛酮糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

表1：重组酶的酶活测定

实施例2：NtDPE单位点突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据NtDPE亲本序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NtDPE为模板，对第242位引入单突变，引物为：

正向引物GATGGTTATGTGNNNATGGAACCG(下划线为突变碱基)

反向引物CGGTTCCATCACNNNATAACCATC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，55℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

2、突变体转化表达

取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

3、高通量筛选阳性转化子

反应混合液组成：5g/L的D-果糖、1mM CoCl₂·6H₂O，再加入50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液至总反应体系1L，备用。

在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μL含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB培养液，接种不同的转化菌落，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4-0.6，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于25℃下诱导表达10h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液。取100μL上述反应混合液加入含有菌体的96孔板中，振荡器振荡混匀后在60℃、600r/min反应10min，冰浴10min停止反应。取2.5μL反应液以半胱氨酸-咔唑显色法筛选突变体，反应体系包括2.5μL反应液、5μL的1.5％(w/v)半胱氨酸盐酸盐、150μL的70％(w/w)浓硫酸、5μL的0.12％(w/v)咔唑乙醇，60℃下保温10min后观察颜色变化。以重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE的反应为对照，取颜色比E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE的反应深的突变株进行酶活精准测定。

4、阳性转化子酶活的精准测定

操作同实施例1的“重组菌的酶活测定”。

该实施例的结果为：对415株重组转化菌初筛，筛选出5株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表2。经分析确定，其余410株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第242位缬氨酸(V)突变为Y、T、K、N和L外的其他氨基酸。

表2：单点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NtDPE-V242K突变体记为NtDPE-1，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-1。

实施例3：NtDPE双位点突变体的构建与筛选

根据实施例2构建的单突变体NtDPE-1序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NtDPE-1为模板，对第105位引入单突变，引物为：

正向引物CATTGATCGTGTGNNNGGTACCGTGTAT(下划线为突变碱基)

反向引物ATACACGGTACCANNNACACGATCAATG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，58℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对587株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活精准测定，具体结果见表3。经分析确定，其余584株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第105位甘氨酸(G)突变为N、D和E外的其他氨基酸。

表3：双点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NtDPE-V242K-G105N突变体记为NtDPE-2，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b/NtDPE-2。

实施例4：NtDPE三位点突变体的构建与筛选

根据实施例3构建的突变体NtDPE-2序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NtDPE-2为模板，对第210位引入单突变，引物为：

正向引物GGGTCATCTGCATNNNGGTGAAGC(下划线为突变碱基)反向引物GCTTCACCAATATNNNGATGACCC(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，55℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对610株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表4。经分析确定，其余606株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第210位异亮氨酸(I)突变为Q、S、F和T外的其他氨基酸。

表4：三点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NtDPE-V242K-G105N-I210T突变体记为NtDPE-3，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-3。

实施例5：NtDPE四位点突变体的构建与筛选

根据实施例4构建的突变体NtDPE-3序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NtDPE-3为模板，对第147位引入单突变，引物为：

正向引物CACGTCAGTATGATATTACCNNNCTG(下划线为突变碱基)

反向引物CAGCAGGGTAATATCATACTNNNGTG(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，54℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对576株重组转化菌初筛，筛选出4株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表5。经分析确定，其余572株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第147位亮氨酸(L)突变为R、N、C和K外的其他氨基酸。

表5：四位点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NtDPE-V242K-G105N-I210T-L147K突变体记为NtDPE-4，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-4。

实施例6：NtDPE五位点突变体的构建与筛选

根据实施例5构建的突变体NtDPE-4序列设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/NtDPE-4为模板，对第184位引入单突变，引物为：

正向引物AGTGATGCTGGATNNNTTCCACATG(下划线为突变碱基)

反向引物CATGTGGAAGGTANNNAGCATCACT(下划线为突变碱基)

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer(含Mg²⁺)25μL，dNTPs 10mM，正向引物2μL，反向引物2μL，模板DNA1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 50U，加入ddH₂O至50μL。

PCR扩增条件为95℃3min；(95℃15s，56℃15s，72℃6.5min)30循环；72℃5min。

PCR产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑单克隆于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。利用半胱氨酸咔唑法显色法对突变体进行初筛(操作同实施例2的“高通量筛选阳性转化子”)，阳性克隆进行酶活精准测定(操作同实施例1的“阳性转化子酶活测定”)。

该实施例的结果为：对587株重组转化菌初筛，筛选出3株酶活提高的突变株，再对其进行酶活测定，具体结果见表6。经分析确定，其余584株重组菌酶活保持不变或下降的原因是第184位苏氨酸(T)突变为Y、G和F外的其他氨基酸。

表6：五点突变重组菌的酶活测定

将酶活提高最多的NtDPE-V242K-G105N-I210T-L147K-T184Y突变体记为NtDPE-5(即SEQIDNO.7)，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-5。

SEQIDNO.7：

MKYGVYFAYWESSWNVNFEKYVQKVKELGFDILEVAALGLVNLPDEKLERLKQLAEQHNVILTAGIGLPKEYDVSSSDATVRRNGIAFMKKVMDAMYQAGIDRVNGTVYSYWPADYSHPFDKPTARKHSIESVKELAEYARQYDITKLIETLNRFEQFLLNDAEEAVSYVKEVDEPNVKVMLDYFHMNIEEDNIADAIRYTGDHLGHLHTGEANRKVPGKGSMPWKEIGQALKDIHYDGYVKMEPFVKTGGQVGQDIKVWRDLSGNATEEQLDRELAESLVFVKQAFGELHHHHHH

实施例7：重组大肠杆菌发酵产酶与纯化

分别将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-2、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-4、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-5接种至含终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.4-0.6，再向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，于25℃下诱导表达12h后，4℃、6000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体。

采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，收集上清液。

上清液在75℃热处理15min，然后在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集热处理后的上清液。接着使用nickel-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为各自纯酶液。

实施例8：纯化NtDPE及其突变体的最适反应温度

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系为：50g/L的D-果糖、1mM CoCl₂·6H₂O、100μL上述实施例获得的纯酶液，再加入50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液至总体系1mL。分别于不同转化温度：50、55、60、65、70、75、80、85、90℃测定重组DPE的活力(操作方法同实施例1的“重组菌的酶活测定”)。由图1中可知，NtDPE-5的最适反应温度为85℃，比原始酶NtDPE提高15℃。

实施例9：金属离子对DPE最优突变体酶活的影响

将实施例7中的纯酶液作为转化用酶，测定金属离子对重组酶酶活的影响。1mL反应体系包括：50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.5)、50g/LD-果糖、100μL纯酶液和1mM不同金属离子。其中，金属离子的选择如下：(1)选用单金属离子：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺和Ca²⁺。于60℃测定DPE的活力。(2)设置组合金属离子，分别为1mM Co²⁺和0.5mM Ca²⁺、1mM Co²⁺和0.5mM Zn²⁺、1mM Co²⁺和0.5mM Mg²⁺进行酶活测定。以不加金属离子作为对照。由图2可知，Co²⁺对DPE的酶活有极大的促进作用，并且比组合金属的效果更为明显。

实施例10：原始酶与突变酶突变重组菌全细胞制备D-psicose

按实施例7的发酵方法，大规模发酵获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-1、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-2、E.coliBL21(DE3)/pET28b/NtDPE-3、E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE-4、E.coliBL21(DE3)/pET28b/NtDPE-5。分别以上述湿菌体作为生物催化剂，以D-果糖为底物，生物转化制备D-psicose。催化体系包括：500g/L的D-果糖、1mM CoCl₂·6H₂O、20g/L湿菌体，再加入适量50mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.5)缓冲液至总体系100mL。反应体系于70℃、150r/min条件下反应8h。每隔1h取样、离心，用0.22μm膜过滤后进行HPLC检测D-psicose浓度。由表7可知，E.coliBL21(DE3)/pET28b/NtDPE-5的产物得率最终达到40.1％，高于原始酶E.coli BL21(DE3)/pET28b/NtDPE和其他突变酶的得率。

表7：各重组菌得率的比较

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> Rhizobiales bacterium

<400> 1

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Val Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Val

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Ser Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Gln Ala Ser Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Thr Lys Gln Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Asp

65 70 75 80

Val Arg Lys Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Gln Thr Leu Thr Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile Lys Ser Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Val Asp Tyr Thr Gln Pro Val Asp Lys Ile Gly Asp Arg Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile His Gly Ile Ala Asp Phe Ala Ser Asn Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Ser

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Asn Asn Arg Arg Val Pro Gly Thr Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Glu Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Gly Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Arg Val Trp Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ala Thr Glu Ala Lys Leu

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ser Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Ala His His His His His His

290 295

<210> 2

<211> 885

<212> DNA

<213> Rhizobiales bacterium

<400> 2

atgaagcatg gtatctatta cagttactgg gaaaaagaat ggagtgccaa attcggtccg 60

tatgtggaaa aagtggccaa actgggcttc gatgttattg aagtggccgc acatcatatt 120

aatagttata gcgatgcaga actggcagcc attcgtcagg ccagcaaaga taatggcatt 180

attctgaccg ccggcattgg cccgaccaaa cagaaaaatc tgagtagccc ggatgcagat 240

gtgcgcaaag ccggtaaagc attcttcgaa cagaccctga ccaatgtggc aaaactggat 300

attaaaagta tcggtggcgc actgcatagc tattggccgg ttgattatac ccagccggtg 360

gataaaattg gcgatcgcgc acgcggcgtt gaaggcattc atggcattgc cgacttcgca 420

agcaatctgg gcattaatct gtgtattgaa gttctgaatc gcttcgaaaa tcatgtgctg 480

aataccgccg cagaaggtgt tgcattcgtt aaagatgttg gcaaaagtaa tgtgaaagtg 540

atgctggata ccttccacat gaatattgaa gaagatagct tcggtgatgc aattcgcacc 600

gcaggcccgc tgctgggtca cttccatacc ggtgaaaata atcgccgtgt tccgggcacc 660

ggccgcattc cttggcatga aattggcctg gcactgcgcg aaattaatta taccggtgca 720

gttgtgatgg aaccgttcgt taaaaccggc ggcggtattg gcagtgatat tcgtgtgtgg 780

cgtgatctga gtaatggcgc caccgaagca aaactggacg aagatgcacg caatagtctg 840

gccttcagtc gcttcgttct gggtgcacat catcatcatc accat 885

<210> 3

<211> 298

<212> PRT

<213> Martelella sp.

<400> 3

Met Lys Phe Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Asp Cys Leu Arg His Val Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Val

20 25 30

Ile Glu Ile Ala Ala His His Leu Asn Ser Phe Ser Pro Ala His Ile

35 40 45

Asp Asp Ile Ala Arg Cys Ala Arg Asp Asn Asn Ile Ala Val Thr Ser

50 55 60

Gly Leu Gly Pro Ser Gln Glu Arg Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Asp

65 70 75 80

Ile Arg Lys Ala Gly Arg Ala Phe Phe Glu Glu Thr Leu Val Asn Ile

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Val His Ile Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Val Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Glu Gly Asp Arg Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Ser Ser Leu Ala Asp Phe Ala Ala Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asp Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Ile

145 150 155 160

Asn Thr Ala Glu Glu Gly Val Ala Phe Val Arg Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Arg Ala Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Asn Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Leu Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Ala Ala Leu Arg Glu Ile Asp Tyr Arg Gly Ala

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile Gly Arg Asp

245 250 255

Ile Arg Val Trp Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ala Asp Glu Ala Lys Met

260 265 270

Asp Gln Asp Ala Arg Glu Ala Leu Ala Phe Ser Arg Tyr Val Leu Gly

275 280 285

Gly Asp Lys Gly His His His His His His

290 295

<210> 4

<211> 894

<212> DNA

<213> Martelella sp.

<400> 4

atgaagttcg gtatctatta cagctattgg gaacaggaat ggagtgcaga ttgcctgcgt 60

catgttgaaa aagttgccaa actgggcttc gatgttattg aaattgccgc acatcatctg 120

aatagcttca gtccggcaca tattgatgat attgcccgtt gcgcacgtga taataatatt 180

gccgttacca gtggtctggg cccgagtcag gaacgtaatc tgagcagtcc ggatgcagat 240

attcgcaaag caggtcgcgc cttcttcgaa gaaaccttag tgaatattgc caaactggat 300

gttcatatta tcggtggtgc cctgcatagt tattggccgg ttgattatag ccagccggtg 360

gataaagaag gcgatcgcgc acgcggtgtt gaaggcatta gcagtctggc agacttcgca 420

gcagatctgg gtattgatct gtgcattgaa gttctgaatc gcttcgaaaa tcatgttatt 480

aataccgcag aagaaggcgt ggccttcgtt cgcgatgtgg gtaaaaataa tgtgaaagtg 540

atgctggata ccttccacat gaatattgaa gaagatagct tccgtgcagc cattcgtacc 600

gccggcccgc tgctgggtca cttccatacc ggtgaaaata atcgtcgcgt tccgggtaaa 660

ggccgtctgc cgtggcatga aattggtgcc gcactgcgcg aaattgatta tcgcggcgca 720

gttgttatgg aaccgttcgt taaaagcggc ggcggcattg gccgcgatat tcgtgtgtgg 780

cgcgatctga gtaatggtgc agatgaagcc aaaatggatc aggatgcccg tgaagccctg 840

gcattcagcc gctatgtgct gggtggcgat aaaggtcatc atcatcatca ccat 894

<210> 5

<211> 296

<212> PRT

<213> Novibacillus thermophilus

<400> 5

Met Lys Tyr Gly Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Glu Ser Ser Trp Asn Val

1 5 10 15

Asn Phe Glu Lys Tyr Val Gln Lys Val Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Val Ala Ala Leu Gly Leu Val Asn Leu Pro Asp Glu Lys Leu

35 40 45

Glu Arg Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln His Asn Val Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Leu Pro Lys Glu Tyr Asp Val Ser Ser Ser Asp Ala Thr

65 70 75 80

Val Arg Arg Asn Gly Ile Ala Phe Met Lys Lys Val Met Asp Ala Met

85 90 95

Tyr Gln Ala Gly Ile Asp Arg Val Gly Gly Thr Val Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ala Asp Tyr Ser His Pro Phe Asp Lys Pro Thr Ala Arg Lys His

115 120 125

Ser Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Ala Arg Gln Tyr Asp

130 135 140

Ile Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Asn Arg Phe Glu Gln Phe Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asp Ala Glu Glu Ala Val Ser Tyr Val Lys Glu Val Asp Glu Pro

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Asn Ile Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Thr Gly Asp His Leu Gly His Leu

195 200 205

His Ile Gly Glu Ala Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Ser Met Pro

210 215 220

Trp Lys Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Asp Ile His Tyr Asp Gly Tyr

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Gln Val Gly Gln Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Asn Ala Thr Glu Glu Gln Leu

260 265 270

Asp Arg Glu Leu Ala Glu Ser Leu Val Phe Val Lys Gln Ala Phe Gly

275 280 285

Glu Leu His His His His His His

290 295

<210> 6

<211> 888

<212> DNA

<213> Novibacillus thermophilus

<400> 6

atgaagtacg gtgtgtactt cgcctattgg gaaagtagtt ggaatgttaa cttcgaaaaa 60

tacgtgcaga aagttaaaga actgggcttc gatattctgg aagtggcagc actgggtctg 120

gttaatctgc cggatgaaaa actggaacgc ctgaaacagc tggcagaaca gcataatgtt 180

attctgaccg caggtattgg cctgccgaaa gaatatgatg tgagtagtag tgatgccacc 240

gttcgccgca atggcattgc cttcatgaaa aaagtgatgg atgccatgta tcaggcaggc 300

attgatcgtg tgggtggtac cgtgtatagt tattggccgg ccgattatag tcatccgttc 360

gataaaccga ccgcacgcaa acatagtatt gaaagcgtta aagaattagc cgaatatgca 420

cgtcagtatg atattaccct gctgattgaa accttaaatc gcttcgaaca gttcctgctg 480

aatgatgcag aagaagcagt gagctatgtt aaagaagtgg atgaaccgaa tgtgaaagtg 540

atgctggata ccttccacat gaatattgaa gaagataata tcgccgatgc aattcgttat 600

accggtgatc atctgggtca tctgcatatt ggtgaagcca atcgtaaagt tccgggcaaa 660

ggcagcatgc cgtggaaaga aattggccag gcactgaaag atattcatta tgatggttat 720

gtggtgatgg aaccgttcgt taaaaccggc ggtcaggtgg gccaggatat taaagtgtgg 780

cgcgatctga gcggcaatgc caccgaagaa cagctggatc gcgaactggc agaaagcctg 840

gtgttcgtta aacaggcatt cggtgaactg catcatcatc atcaccat 888

<210> 7

<211> 296

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

Met Lys Tyr Gly Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Glu Ser Ser Trp Asn Val

1 5 10 15

Asn Phe Glu Lys Tyr Val Gln Lys Val Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Val Ala Ala Leu Gly Leu Val Asn Leu Pro Asp Glu Lys Leu

35 40 45

Glu Arg Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln His Asn Val Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Leu Pro Lys Glu Tyr Asp Val Ser Ser Ser Asp Ala Thr

65 70 75 80

Val Arg Arg Asn Gly Ile Ala Phe Met Lys Lys Val Met Asp Ala Met

85 90 95

Tyr Gln Ala Gly Ile Asp Arg Val Asn Gly Thr Val Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ala Asp Tyr Ser His Pro Phe Asp Lys Pro Thr Ala Arg Lys His

115 120 125

Ser Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Ala Glu Tyr Ala Arg Gln Tyr Asp

130 135 140

Ile Thr Lys Leu Ile Glu Thr Leu Asn Arg Phe Glu Gln Phe Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asp Ala Glu Glu Ala Val Ser Tyr Val Lys Glu Val Asp Glu Pro

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Tyr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Asn Ile Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Thr Gly Asp His Leu Gly His Leu

195 200 205

His Thr Gly Glu Ala Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Ser Met Pro

210 215 220

Trp Lys Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Asp Ile His Tyr Asp Gly Tyr

225 230 235 240

Val Lys Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Gln Val Gly Gln Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Asn Ala Thr Glu Glu Gln Leu

260 265 270

Asp Arg Glu Leu Ala Glu Ser Leu Val Phe Val Lys Gln Ala Phe Gly

275 280 285

Glu Leu His His His His His His

290 295