阅读说明：本技术 检测突变基因的方法 (Method for detecting mutant gene ) 是由 海老沼宏幸 塚本百合子 于 2018-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明的目的是提供一种高灵敏度地检测包含野生型等位基因的核酸样品中以低频包含的突变基因(突变等位基因)的方法和定量方法。在单反应系统中,将设计为在目的基因的突变位点侧翼的第一引物组与包含对应于该突变的ASP的第二引物组混合,可以从低频突变基因获得扩增产物,并且通过包含竞争性核酸以抑制该基因的野生型等位基因的扩增反应,选择特定的引物浓度条件,并使用第一和第二引物组控制PCR反应的循环数,可以确保定量。(An object of the present invention is to provide a method for detecting a mutant gene (mutant allele) contained at a low frequency in a nucleic acid sample containing a wild-type allele with high sensitivity and a quantitative method. In a single reaction system, an amplification product can be obtained from a low-frequency mutant gene by mixing a first primer set designed to flank a mutation site of a target gene with a second primer set comprising ASP corresponding to the mutation, and quantification can be secured by an amplification reaction comprising a competitive nucleic acid to inhibit a wild-type allele of the gene, selecting a specific primer concentration condition, and controlling the number of cycles of a PCR reaction using the first and second primer sets.)

检测突变基因的方法

技术领域

本发明涉及一种用于高灵敏度检测并定量在含有野生型等位基因的核酸样品中以低频包含的突变等位基因的方法。

背景技术

遗传突变包括遗传继承的种系突变和在单个细胞中获得的体细胞突变。据报道，作为某种基因的种系突变的单核苷酸多态性(SNP)和作为典型的体细胞突变的点突变(单核苷酸突变)与多种疾病有关，并且近年来，这种核苷酸序列的检测已被用于选择预期某种药物对其有效的患者。

例如，执行表皮生长因子受体(EGFR)基因突变测试，作为确定酪氨酸激酶抑制剂(TKI)功效的基础，酪氨酸激酶抑制剂是肺癌的治疗剂。由于通过使用痕量的癌组织标本进行该测试，并且将来源于正常组织和癌组织的野生型等位基因混合，因此需要测试具有高灵敏度和高特异性。

在EGFR基因突变中，外显子20的密码子790处的点突变(T790M，2369C->T)特别被称为对第一代和第二代TKI(如吉非替尼和阿法替尼)的耐药性突变。最近已在临床上使用了对T790M突变有效的第三代TKI(osimertinib)，并且需要对T790M突变进行测试，作为将其应用于已知具有TKI耐药性并经历肺癌复发的患者的条件。此外，需要通过频繁的再次活检来收集和检查组织标本，以免忽视由于T790M突变和肺癌复发而引起的TKI耐药性迹象；然而，高度侵入性的再次活检对患者造成沉重负担，并且在某些情况下无法进行。因此，近年来，即使从流出到血浆中的癌组织来源的无细胞DNA中检测到T790M突变，也可以开奥西替尼的处方。然而，血浆中的无细胞DNA的量非常小，并且要求突变检测方法具有比从组织样本检测所需的灵敏度更高的灵敏度。另外，需要用于捕获T790M突变量的变化的定量方法来监测肺癌的复发。

检测EGFR中的基因突变的报道方法包括实时PCR方法(非专利文献1)和MBP-QP方法(非专利文献2)，其通过结合了使用等位基因特异性引物(ASP)的ASP-PCR方法和通过Q探针的解离曲线分析而实现。这些方法的检测灵敏度约为0.1％至1％，足以从已经确认含有癌细胞的组织样本中进行检测；然而，这被认为不足以检测复发患者的低频突变。最近出现的数字PCR方法的灵敏度是这些检测方法的100倍或更高，并且能够进行定量，并且据报道，使用这种方法能够检测现有检测方法无法检测的突变，例如检测未使用TKI治疗的患者的突变(非专利文献3)。一个广泛接受的想法是，即使检测到这样的低频T790M突变时，也应根据对第一代和第二代TKI的抗性以及第三代TKI的有效性来评估突变基因的比例与药物反应之间的关系。如果明确了这种关系，则可以根据抗性突变基因的比例选择合适的药物。然而，实现高度灵敏定量的数字PCR方法操作复杂并且需要昂贵的专用设备。

上述的ASP-PCR方法是一种用于检测EGFR、RAS等的基因突变(尤其是点突变)的简单且相对灵敏的技术；但是，ASP特异性的提高对于用这种方法构建高度灵敏的突变检测系统至关重要。通常将ASP设计为3'端的1至3个碱基中的任何一个对应于基因多态性(例如单核苷酸多态性)的突变核苷酸，并进一步设计为通过在多态性位点以外的位置人工添加与靶核酸不互补的序列(错配)来确保特异性(专利文献1，专利文献2和本申请优先权日申请人的未公开专利申请(PCT/JP2017/12820))。但是，具有人为添加的错配的ASP的亲和力低于完全匹配的引物，这可能导致扩增效率降低。

对于用于检测单核苷酸突变的ASP，缩短引物长度对于确保根据单碱基的差异的特异性是有效的。另一方面，在用具有短引物长度的ASP进行扩增的情况下，必须降低PCR的退火温度，这可能引起对发生非特异性扩增的担忧。当在一个反应系统(多重PCR)中使用多个引物同时扩增多个突变时，这种非特异性扩增特别容易发生。

嵌套PCR已知为减少非特异性扩增的技术。在该方法中，通过侧接靶序列的第一引物组进行第一扩增反应后，将1/20至1/50的第一反应溶液用作第二扩增反应的模板，以扩增预期的序列，使用在第一引物组的内侧设计的第二引物组。该方法可以利用以下事实来有效地扩增包含靶序列的区域：即使由于第一引物组的错误引发而扩增了非特异性产物，相同的非特异性区域也不太可能通过第二引物组扩增。但是，由于PCR反应进行两次，因此操作复杂并且花费时间。此外，由于将第一PCR反应后的反应溶液用作第二PCR反应的模板，因此必须打开包含大量扩增产物的反应溶液的盖子，这引起对扩增产物污染测量环境的担忧(相互污染)。

引文清单

专利文献

专利文献1：日本公开专利公开号2005-160430

专利文献2：日本专利号3937136

非专利文献

非专利文献1：Biomed Res Int.2013；2013:385087。

非专利文献2：J Thorac Oncol.2011Oct；6(10):1639-48。

非专利文献3：Clin Cancer Res.2015Aug 1；21(15):3552-60。

发明内容

技术问题

为了解决上述常规问题，本发明的目的是提供一种用于高灵敏度地检测在含有野生型等位基因的核酸样品中以低频包含的突变等位基因的方法和定量方法。

问题的解决方案

本发明人试图在均相反应系统中进行嵌套PCR，并且发现，在单反应系统中，将设计成夹住目标基因的突变位点或其侧翼的第一引物组与包含与突变相对应的ASP的第二引物组混合，可以从低频突变基因高度灵敏地获得扩增产物，并且通过包含竞争性核酸来抑制该基因的野生型等位基因的扩增反应，选择某个引物浓度条件，并任选地使用第一引物组和第二引物组控制PCR反应的循环数，可以确保定量，从而完成了本发明。

因此，本发明提供以下的[1]至[8]。

[1]一种用于基于使用DNA聚合酶的核酸扩增反应中扩增产物的存在或不存在来检测核酸样品中包含的基因突变的方法，该方法包括以下步骤：

在核酸扩增反应溶液中，其中第一引物组与第二引物组共存，其中所述第一引物组设计成在基因多态性位点侧翼，所述第二引物组包含一个或多个用于从含有突变的核酸中选择性扩增的等位基因特异性引物，

(a)在防止第二引物组的核酸扩增反应的条件下，在竞争性核酸的存在下，通过第一引物组的核酸扩增反应扩增包含突变等位基因的核酸，获得扩增产物，所述竞争性核酸具有该基因的野生型等位基因序列，并与全部或部分所述多态性位点杂交，和

(b)使用获得步骤(a)的扩增产物时比第二引物组的引物浓度降低的第一引物组的引物浓度，进行扩增反应；和

(c)在允许至少第二引物组作用于步骤(a)中获得的扩增产物的条件下，通过核酸扩增反应选择性地扩增包含突变等位基因的核酸。

[2]根据以上[1]所述的方法，其中，防止第二引物组的核酸扩增反应的条件是所述等位基因特异性引物不与包含所述突变的核酸退火的温度条件。

[3]根据以上[1]或[2]的方法，其中第二引物组的除所述等位基因特异性引物之外的引物与所述第一引物组的一个引物共同设计。

[4]根据以上[1]至[3]中任一项的方法，其中在第一引物组中，具有与第二引物组的等位基因特异性引物相同方向的引物的浓度是其他引物浓度的1/100至1/20。

[5]根据以上[1]至[4]中任一项的方法，其包括基于通过离子交换色谱分离的扩增产物峰的存在或不存在来检测第二引物组的扩增产物的存在或不存在的步骤。

[6]通过使用来自DNA聚合酶的核酸扩增反应的扩增产物对核酸样品中包含的突变等位基因进行定量的方法，该方法包括以下步骤：

在核酸扩增反应溶液中，其中第一引物组与第二引物组共存，其中所述第一引物组设计成在基因多态性位点侧翼，所述第二引物组包含一个或多个用于从含有突变的核酸中选择性扩增的等位基因特异性引物，

(a)在防止第二引物组的核酸扩增反应的条件下，在竞争性核酸的存在下，通过第一引物组的核酸扩增反应扩增包含突变等位基因的核酸，获得扩增产物，所述竞争性核酸具有该基因的野生型等位基因序列，并与全部或部分所述多态性位点杂交，和

(b)在获得步骤(a)的扩增产物时，在通过第一引物组进行的核酸扩增反应达到饱和阶段之前，通过在以下条件下的核酸扩增反应选择性地扩增含有突变等位基因的核酸：所述条件允许至少第二引物组以反映核酸样品中所含突变等位基因的DNA量的方式连续作用于产生的扩增产物。

[7]根据以上[6]的方法，其中通过第一引物组进行的核酸扩增反应的循环数设定为15至32，其中通过第二引物进行的核酸扩增反应的循环数设定为30至60，并且其中两个反应组合并连续进行。

[8]根据以上[6]或[7]的方法，其中第二引物组的扩增产物通过离子交换色谱分离，并且其中核酸样品中包含的突变等位基因是从扩增产物的峰面积定量的。

发明的有益效果

根据本发明，可以特异性且快速地检测和定量以低频率包含的突变基因。例如，如在肺癌患者的EGFR基因突变检测中，即使在样品中大量存在与突变基因(例如，T790M)相对应的野生型等位基因，也可以以高灵敏度检测和定量突变，这使得能够通过风险判断和监测对第一代和第二代TKI的耐药性，实现临床应用。

附图说明

[图1]图1显示了当在用于第一PCR的正向引物的不同浓度下进行PCR扩增时，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线。

[图2]图2显示[A]通过ASP-PCR方法从0.05ng突变体进行PCR扩增情况下的扩增曲线，[B]通过ASP-PCR方法从0.015ng突变体进行PCR扩增情况下的扩增曲线，[C]通过使用第一PCR的正向引物(0.025μM)从0.05ng突变体进行PCR扩增的情况下，第一PCR反应的55个循环的扩增曲线，[D]使用第一PCR的正向引物(0.025μM)从0.05ng突变体进行PCR扩增的情况下，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线，[E]使用第一PCR的正向引物(0.025μM)从0.015ng的突变体进行PCR扩增的情况下，第一PCR反应的55个循环的扩增曲线，以及[F]使用第一PCR的正向引物(0.025μM)从0.015ng的突变体进行PCR扩增的情况下，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线。

[图3]图3显示了在第一PCR反应的55个循环和第二PCR反应的30个循环之后通过离子交换色谱法获得的扩增产物的洗脱峰。

[图4]图4显示[A]第一PCR反应的55个循环后的扩增曲线，[B]在上述[A]的第一PCR反应的55个循环之后，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线，[C]在上述[B]的第二PCR反应的第30个循环时，RFU值与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[D]第一PCR反应的35个循环的扩增曲线，[E]在上述[D]的第一PCR反应的35个循环后，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线，[F]在上述[E]的第二PCR反应的第30个循环时，RFU值与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[G]第一PCR反应的32个循环的扩增曲线，[H]在上述[G]的第一PCR反应的32个循环之后，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线，[I]在上述[H]的第二PCR反应的第30个循环时，RFU值与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[J]第一PCR反应的25个循环的扩增曲线，[K]在上述[J]的第一PCR反应的25个循环之后，第二PCR反应的30个循环的扩增曲线，[L]在上述[K]的第二PCR反应的第30个循环时，RFU值与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[M]第一PCR反应的25个循环的扩增曲线，[N]在上述[M]的第一PCR反应的25个循环之后，第二PCR反应的37个循环的扩增曲线，[O]在上述[N]的第二PCR反应的第37个循环时，RFU值与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[P]第一PCR反应的15个循环的扩增曲线，[Q]在上述[P]的第一PCR反应的15个循环之后，第二PCR反应的47个循环的扩增曲线，和[R]在上述[Q]的第二PCR反应的第47个循环时，RFU值和T790M突变等位基因比例之间的相关性。

[图5]图5显示了[A]在第一PCR反应的15个循环和第二PCR反应的47个循环之后的扩增产物洗脱峰，[B]上述[A]的扩增产物洗脱峰面积与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[C]在第一PCR反应的25个循环和第二PCR反应的37个循环后，扩增产物的洗脱峰，[D]上述[C]的扩增产物洗脱峰面积与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[E]在第一PCR反应的32个循环和第二PCR反应的30个循环后，扩增产物的洗脱峰，[F]上述[E]的扩增产物洗脱峰面积与T790M突变等位基因比例之间的相关性，[G]在第一PCR反应的35个循环和第二PCR反应的27个循环后扩增产物的洗脱峰，[H]上述[G]的扩增产物洗脱峰面积与T790M突变等位基因比例之间的相关性。

具体实施方式

现在将描述用于实现本发明的实施方案；然而，本发明不以任何方式限于这些实施方案，并且可以以各种形式实现而不背离其精神。

在本发明中，可以与第一引物组的一个引物共同设计除等位基因特异性引物(ASP)以外的第二引物组的引物(下文中，具有共同设计的引物在某些情况下将称为“共同引物”)。因此，共同引物在第一引物组和第二引物组中均起作用。在这种情况下，优选将共同引物的浓度设定为第二引物组的浓度。

在本发明中，为了防止在第一PCR反应期间共存的第二引物组工作，将第一引物组的最低Tm值设计为比第二引物组的最低Tm值高10℃以上，且扩增反应温度之差优选为10℃以上。在本发明中，为了防止在第一PCR反应期间共存的第二引物组工作，优选采用防止第二引物组进行的核酸扩增反应的条件。

在本发明中，第一引物组的每种引物的浓度优选为第二引物组的ASP浓度的1/100(一百分之一)至1/20(二十分之一)。在这种情况下，第一引物组中的一种引物优选具有其他引物的100倍，20倍或10倍以内的浓度，第二引物组中的一种引物优选具有其他引物的100倍，20倍或10倍以内的浓度。如果除ASP外的第二引物组的引物与第一引物组的一个引物共同设计，则第一引物组中与第二引物组的ASP具有相同方向的引物优选具有共同引物浓度的1/100至1/20的浓度。

在本发明中，第一引物组中与第二引物组的ASP具有相同方向的引物浓度优选为0.010至0.100μM，0.020至0.050μM或0.025至0.040μM。

在本发明中，为了进行突变基因的定量(测量与野生型等位基因的比率和/或测量突变基因的拷贝数)，尽管用于选择性地扩增包括突变基因的突变位点的检测区域的任何条件都可以使用而没有特别限制，优选地，通过改变条件(例如降低扩增反应温度)来进行核酸扩增反应，使得在通过第一引物组进行的核酸扩增反应通过指数阶段达到饱和阶段之前，至少第二引物组起作用。适当地，通过第一引物组进行的核酸扩增反应的循环数可以设定为15至32次，16至31次，17至30次，18至29次，19至28次，20至27次，21到26次，22到25次或23到24次或15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，31或32次；通过第二引物组进行的核酸扩增反应的循环数可以设置为30至60次，31至59次，32至58次，33至57次，34至56次，35至55次，36至54次，37至53次，38至52次，39至51次，40至50次，41至49次，42至48次，43至47次，或44至46次，或30、31，32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60次；可以将两个反应组合并依次进行。

在本说明书中，短语“核酸扩增反应达到饱和阶段”是指落入以下(1)和(2)中至少之一的情况：(1)所述核酸扩增反应的第N次循环后扩增产物的量等于或小于所述核酸扩增反应的第N-1次循环后扩增产物的量的1.3倍；和(2)在将核酸扩增反应的循环数作为x轴，将核酸扩增反应的相应循环后扩增产物的量作为y轴而得到的曲线上出现拐点(当二阶导数为正时)。

在本发明中，第一扩增产物的链长优选为250bp以下且50bp以上。在本发明中，当检测血液中的无细胞DNA时，第一扩增产物的链长优选为120bp以下且50bp以上。

在本发明中，竞争性核酸的实例包括肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)和具有3'端的寡核苷酸，所述3'端经过诸如磷酸化的修饰，从而不会发生通过DNA聚合酶的从3'末端的DNA合成反应。竞争性核酸的浓度优选为抑制野生型等位基因(其不是检测的对象)的扩增，并且不抑制在通过第一引物组的扩增中待检测的突变基因的扩增的浓度。更具体地，竞争性核酸的浓度为0.01至1.00μM，0.01至0.75μM，0.02至0.50μM，0.03至0.30μM，0.04至0.25μM，0.05至0.20μM，0.06至0.17μM，0.07至0.14μM，0.08至0.13μM，和0.09至0.11μM。

在本发明中，竞争性核酸的序列与包括要进行突变检测的基因的野生型等位基因的多态性位点的至少10个核苷酸，优选10至30个核苷酸，11至29个核苷酸，12至28个核苷酸，13至27个核苷酸，14至26个核苷酸，15至25个核苷酸，16至24个核苷酸，17至23个核苷酸，18至22个核苷酸或19至21个核苷酸，或10个核苷酸，11个核苷酸，12个核苷酸，13个核苷酸，14个核苷酸，15个核苷酸，16个核苷酸，17个核苷酸，18个核苷酸，19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸，24个核苷酸，25个核苷酸，26个核苷酸，27个核苷酸，28个核苷酸，29个核苷酸或30个核苷酸的序列完全相同。在本发明中，要使用的竞争性核酸的序列可以是要进行突变检测的基因的DNA的两条DNA链中的任何一条。在本发明中，竞争性核酸的长度优选为10至40个核苷酸，11至39个核苷酸，12至38个核苷酸，13至37个核苷酸，14至36个核苷酸，15至35个核苷酸，16至34个核苷酸，17至33个核苷酸，18至32个核苷酸，19至31个核苷酸，20至30个核苷酸，21至29个核苷酸，22至28个核苷酸，23至27个核苷酸，24至26个核苷酸，25至25个核苷酸，26至34个核苷酸，27个至33个核苷酸，28至32个核苷酸，或29至31个核苷酸，或10个核苷酸，11个核苷酸，12个核苷酸，13个核苷酸，14个核苷酸，15个核苷酸，16个核苷酸，17个核苷酸，18个核苷酸，19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸，24个核苷酸，25个核苷酸，26个核苷酸，27个核苷酸，28个核苷酸，29个核苷酸，30个核苷酸，31个核苷酸，32个核苷酸，33个核苷酸，34个核苷酸，35个核苷酸，36个核苷酸，37个核苷酸，38个核苷酸，39个核核苷酸，40个核苷酸，41个核苷酸，42个核苷酸，43个核苷酸，44个核苷酸，45个核苷酸，46个核苷酸，47个核苷酸，48个核苷酸，49个核苷酸或50个核苷酸。在本发明中，竞争性核酸中的多态性位点的位置可以是任何位置，只要该多态性位点完全或部分地包含在竞争性核酸的序列中即可。如果多态性位点完全包含在竞争性核酸的序列中，则在实施方案中，该多态性位点优选对应于从5'侧开始的全长的1/10至9/10的核苷酸。在这种情况下，例如，如果竞争性核酸具有49个核苷酸的长度，则多态性位点优选对应于4.9(＝49×1/10)至44.1的核苷酸，即从第五至第44个核苷酸。在另一个实施方案中，多态性位点优选对应于从5'侧开始的全长的2/10至8/10的核苷酸，3/10至7/10的核苷酸或4/10至6/10的核苷酸。

在本发明中，用于检测或定量第二引物组的扩增产物的方法优选为用于通过诸如SYBR(注册商标)Green的嵌入剂测量产生的荧光强度的方法，并且更优选的方法为这样的方法，其中扩增产物通过离子交换色谱分离，并通过其峰的存在与否以及峰面积的比较来检测或定量。尽管通常通过在260nm处进行吸光度测量来检测扩增产物的峰，但在5'端使用标记有荧光染料的ASP可以通过荧光检测器检测扩增产物，并且在扩增产物与非ASP的非特异性扩增产物不同时是有用的。在这种情况下使用的荧光染料的实例包括Alexa Fluor(注册商标)系列，Cy(注册商标)系列，ATTO系列，DY系列，DyLight(注册商标)系列，FAM，TAMRA等。

在本发明中，核酸样品优选为野生型等位基因和突变等位基因混合的样品，特别优选为突变等位基因与或怀疑与野生型等位基因以低频混合的样品。在本说明书中，“低频”是指样品中的野生型等位基因DNA(野生)和突变等位基因DNA(mu)的混合比例(mu/野生％)为0.001至0.01％，0.001至0.02％，0.001至0.05％，0.001至0.1％，0.001至0.2％，0.001至0.5％，0.001至1％，0.001至2％，0.001至5％，0.001至10％，0.002至0.01％，0.002至0.02％，0.002至0.05％，0.002至0.1％，0.002至0.2％，0.002至0.5％，0.002至1％，0.002至2％，0.002至5％，0.002至10％，0.005至0.01％，0.005至0.02％，0.005至0.05％，0.005至0.1％，0.005至0.2％，0.005至0.5％，0.005至1％，0.005至2％，0.005至5％，0.005至10％，0.01至0.01％，0.01至0.02％，0.01至0.05％，0.01至0.1％，0.01至0.2％，0.01至0.5％，0.01至1％，0.01至2％，0.01至5％，或0.01至10％，或0.001％，0.002％，0.005％，0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，0.2％，0.5％，1％，2％，5％或10％。样品优选是源自对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感的癌症患者的癌组织的生物学样品。在本说明书中，“高灵敏度”是指当样品中的突变等位基因的DNA浓度为0.0001至0.001ng/μL、0.0001至0.003ng/μL、0.0001至0.01ng/μL、0.0001至0.03ng/μL、0.0001至0.1ng/μL、0.0001至0.3ng/μL、0.0001至1ng/μL、0.0003至0.001ng/μL、0.0003至0.003ng/μL、0.0003至0.01ng/μL、0.0003至0.03ng/μL、0.0003至0.1ng/μL、0.0003至0.3ng/μL、0.0003至1ng/μL、0.001至0.003ng/μL、0.001至0.01ng/μL、0.001至0.03ng/μL、0.001至0.1ng/μL、0.001至0.3ng/μL、0.001至1ng/μL、0.003至0.01ng/μL、0.003至0.03ng/μL、0.003至0.1ng/μL、0.003至0.3ng/μL、0.003至1ng/μL,0.01至0.03ng/μL、0.01至0.1ng/μL、0.01至0.3ng/μL、0.01至1ng/μL、0.03至0.1ng/μL、0.03至0.3ng/μL或0.03至1ng/μL，或0.0001ng/μL、0.0003ng/μL、0.001ng/μL、0.003ng/μL、0.01ng/μL、0.03ng/μL、0.1ng/μL、0.3ng/μL或1ng/μL时，可以检测到核酸样品中包含的基因突变。

在本发明中，基因突变优选为EGFR基因的外显子20的密码子790的点突变(T790M，2369C->T)。EGFR基因外显子20的密码子790周围的序列显示为SEQ ID NO:1(野生型)和SEQID NO:2(突变)。

(EGFR基因T790M野生序列[ACG]片段)

[化学式1]

(EGFR基因T790M突变序列[ATG]片段)

[化学式2]

在本发明中，核酸扩增反应优选为聚合酶链反应法。

在本发明中，等位基因特异性引物优选为这样的引物，其具有从3'端起对应于突变的突变核苷酸的碱基的第二核苷酸的碱基，从3'端起不互补于靶核酸的相应核苷酸的碱基的第三核苷酸的碱基，和与靶核酸的相应核苷酸的碱基互补的其他核苷酸的碱基。在本发明的另一种形式中，等位基因特异性引物优选地是这样的引物，其具有从3'端起对应于突变的突变核苷酸的碱基的第三核苷酸的碱基，从3'端起不互补于靶核酸的相应核苷酸的碱基的第二核苷酸的碱基，和与靶核酸的相应核苷酸的碱基互补的其他核苷酸的碱基。

在本发明中，当我们说第一引物组和第二引物组共存时，这意味着第一引物组和第二引物组中包含的所有引物都存在于单个连续液相中(即在核酸扩增反应溶液中)。

在本发明中，优选通过使用等位基因特异性引物不与含有突变的核酸退火的温度条件来实现防止通过第二引物组进行核酸扩增反应的条件。更具体地，优选通过使用比等位基因特异性引物的解链温度(Tm)高1至19℃，高2至18℃，高3至17℃，高4至16℃，高5至15℃，高6至14℃，高7至13℃，高8至12℃，或高9至11℃，或高1℃，高2℃，高3℃，高4℃，高5℃，高6℃，高7℃，高8℃，高9℃，高10℃，高11℃，高12℃，高13℃，高14℃，高15℃，高16℃，高17℃，高18℃，高19℃，高20℃的温度条件来实现防止通过第二引物组进行的核酸扩增反应的条件。

在本发明中，多态性位点优选是包括单核苷酸多态性的位点。在目的基因的目的多态性位点中，具有突变的等位基因被称为突变等位基因，而没有突变的等位基因被称为野生型等位基因。

在本发明中，野生型等位基因是指在要检测的基因突变的突变位点处没有要检测的突变的等位基因。在本发明中，野生型等位基因优选是其中EGFR基因的外显子20的密码子790处的氨基酸为T的等位基因。

在本发明中，突变等位基因是指在要检测的基因突变的突变位点具有要检测的突变的等位基因。在本发明中，突变等位基因优选是其中EGFR基因的外显子20的密码子790处的氨基酸为M的等位基因。

在本发明中，用于定量核酸样品中的突变等位基因的方法优选这样的方法，其中第二引物组的扩增产物通过离子交换色谱分离，以便从由x轴上的洗脱时间和y轴上洗脱的DNA量表示的曲线中扩增产物的峰面积定量核酸样品中包含的突变等位基因。在这种情况下，可以将扩增产物的峰面积作为例如由曲线和基线所包围的区域的面积来获得，所述基线是连接峰的两边的最小点(如果没有最小点，则为最少点(least points))的直线。通过使用含有已知量突变等位基因的核酸样品作为对照样品，并与从对照样品中获得的扩增产物的峰面积进行比较，可以定量包含在该目的核酸样品中的突变等位基因的绝对量。

实施例

在下文中将通过实施例详细描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例。

[实施例1]

EGFR基因外显子20的T790M突变等位基因的高灵敏度检测(1)

通过使用从NCI-H1975细胞系提取纯化的DNA作为人EGFR基因的外显子20的T790M突变的DNA，并使用从K562细胞系提取纯化的DNA作为无突变的DNA，评估了确保根据本发明设计的测量系统的性能的第一引物组的浓度范围。

引物

将用于第一PCR反应的第一引物组(SEQ ID NO:3和4)设置在T790M突变侧翼的区域中，并且将其反向引物设计为与第二引物组(SEQ ID NO:4和5)的反向引物的共同引物。第二引物组的正向引物是对应于T790M(2369C->T)突变的等位基因特异性引物，并且具有从3'端起对应于突变的突变核苷酸的碱基(T)的第二核苷酸的碱基，从3'端起不互补于靶核酸的相应核苷酸的碱基的第三核苷酸的碱基(T)，和与靶核酸的相应核苷酸的碱基互补的其他核苷酸的碱基。通过将SEQ ID NO:3的引物和SEQ ID NO:4的引物组合获得的扩增产物具有79bp的链长，并且通过SEQ ID NO:4的引物和SEQ ID NO:5的引物获得的扩增产物具有65bp的链长。

SEQ ID NO:3(第一正向引物)

[化学式3]

SEQ ID NO:4(第一/第二反向引物)

化学式4]

SEQ ID NO:5(第二正向引物)

[化学式5]

·竞争性核酸

为了抑制含有EGFR外显子20的密码子790的野生型序列的DNA的扩增，将PNA用作竞争性核酸，其具有与密码子790野生型序列互补的序列。将具有如SEQ ID NO:6所示的碱基序列的PNA的合成委托给竞争性核酸合成委托公司(Panagene)。

SEQ ID NO:6(竞争性核酸；PNA)

[化学式6]

·模板DNA的制备

通过将从NCI-H1975细胞系中提取的DNA(突变；mu)和从K562细胞系中提取的DNA(野生)以各自的比例混合以使总浓度为30ng/μL来制备本实施例的模板DNA。对于各自的制备，将野生来源的DNA和突变来源的DNA以0.01％和0％(对照)的混合比(mu/野生的％)混合。

·试剂

制备二十五(25)μL的包含以下试剂的反应溶液，并使用热循环仪设备CFX96(Bio-Rad)进行扩增。

[表1]

·扩增条件

扩增在以下条件下进行。

98℃：30秒

第一PCR反应；98℃：10秒，78℃：15秒(55个循环)

第二PCR反应；98℃：10秒，56℃：15秒(30个循环)

图1显示了当在降低与第二引物组的等位基因特异性引物具有相同方向的第一正向引物浓度的同时进行扩增反应时，第二PCR反应的扩增曲线(混合比：0.01％)。在第一PCR的反向引物浓度为0.5μM的情况下，当第一PCR的正向引物浓度在0.005至0.025μM的范围内(即，与第二引物组的ASP具有相同方向的第一引物组中的引物浓度为其他引物的1/100至1/20)时，识别出在第二PCR反应中的扩增。本发明的检测方法甚至在0.01％的非常低的突变基因混合率下也能够进行扩增。

[实施例2]

EGFR基因外显子20的T790M突变等位基因的高灵敏度检测(2)

通过使用从NCI-H1975细胞系提取纯化的DNA作为人EGFR基因外显子20的T790M突变的DNA，将根据本发明设计的测定系统的测定灵敏度与不包括用于第一PCR的正向引物的常规技术的ASP-PCR法进行比较。

·模板DNA的制备

制备并使用本实施例的模板，以使从NCI-H1975细胞系提取的DNA(突变)浓度为0.01ng/μL和0.003ng/μL。

·试剂

制备二十五(25)μL的包含以下试剂的反应溶液，并使用热循环仪设备CFX96(Bio-Rad)进行扩增。

(1)ASP-PCR方法(常规技术)

[表2]

(2)在使用第一PCR正向引物的情况下(本发明)

[表3]

·扩增条件

(1)ASP-PCR方法(常规技术)

98℃：30秒

PCR反应；98℃：10秒，56℃：15秒(85个循环)

(2)在使用第一PCR正向引物的情况下(本发明)

条件与实施例1相同。

图2[A]和2[B]显示当通过ASP-PCR方法而不使用第一PCR正向引物进行扩增反应时的扩增曲线。在DNA量为0.05ng/反应的情况下[A]，在所有10个测量中都可以识别到扩增；然而，扩增曲线上升时的循环数在45至60个循环之间变化很大。在0.015ng/反应的少量DNA的情况下[B]，在10个测量中有6个没有观察到扩增。即使在识别出扩增的四个测量中，循环数也会在扩增曲线上升时而变化，并且重现性很差。

另一方面，图2[C]至2[F]显示当使用第一PCR的正向引物以0.025μM(为第一PCR的反向引物的1/20)的浓度进行扩增反应时的第一反应和第二反应的扩增曲线。在DNA量为0.05ng/反应的情况下([C]和[D])，在所有10次测量中均识别出扩增，并且扩增曲线上升时的循环数是均匀的，这表明扩增可以以良好的可再现性进行。即使在0.015ng/反应的少量DNA的情况下([E]和[F])，在所有10次测量中都可以识别到扩增。尽管在第一PCR反应中扩增曲线上升时的循环数从35到40个循环略有变化，且在第二PCR反应中扩增曲线上升时的循环数从15到20个循环略有变化，但是可以确认，即使在突变基因的轻微DNA量的情况下，也可以可靠地实现扩增。

从上面可以看出，当结合第一引物组的PCR反应时，通过有意地降低用于第一PCR的正向引物的浓度，并将第一引物组中与第二引物组的ASP方向相同的引物的浓度设置为其他引物的1/100至1/20，可以改善ASP-PCR方法的测量灵敏度和再现性。

[实施例3]

EGFR基因外显子20的T790M突变等位基因的高灵敏度检测(3)

通过使用从NCI-H1975细胞系提取纯化的DNA作为具有人EGFR基因的外显子20的T790M突变的DNA，并使用从K562细胞系提取纯化的DNA作为无突变的DNA，评价了根据本发明设计的测量系统的测量灵敏度。

·模板DNA的制备

通过将从NCI-H1975细胞系提取的DNA(突变，mu)和从K562细胞系提取的DNA(野生)以各自的比例混合在一起以使总浓度为30ng/μL来制备本实施例的模板DNA。对于各自的制备，将野生来源的DNA和突变来源的DNA以0.1％，0.03％，0.01％和0％(对照)的混合比(mu/野生的％)混合。另外，以0.003ng/μL制备从NCI-H1975细胞系提取的DNA(突变；mu)，并用作具有100％的混合比(mu/野生的％)的模板。

·试剂

[表4]

扩增条件

条件与实施例1相同。

·离子交换色谱条件

用于HPLC的阴离子交换树脂柱：TSKgelDNA-NPR(东曹株式会社)

洗脱液：20mM Tris-HCl(pH 8.6)，0.47至0.62M NaCl梯度液(10分钟)

流速：0.75mL/min

柱温箱：25℃

检测器：紫外线波长260nm

图3示出当通过离子交换色谱分离在上述条件下获得的PCR扩增产物时检测到的洗脱峰。当使用野生来源的DNA作为模板时，没有观察到清晰的洗脱峰。但是，当使用突变来源的DNA(100％)为模板时，在6.3分钟左右识别到与PCR扩增产物对应的主洗脱峰(箭头)，即使突变来源的DNA的混合比例为0.01％，也确认了相似的清晰的洗脱峰。

从上述结果表明，通过检测经根据本发明设计的测量系统获得的PCR扩增产物的离子交换色谱分离而获得的特定洗脱峰的存在与否，可以高灵敏度地检测突变基因，并且也可以确保特异性。

[实施例4]

EGFR基因外显子20的T790M突变等位基因的定量(1)

通过使用从NCI-H1975细胞系提取和纯化的DNA作为具有人EGFR基因的外显子20的T790M突变的DNA，并使用从K562细胞系提取和纯化的DNA作为无突变的DNA，对根据本发明设计的测量系统的定量进行了评估。

·模板DNA的制备

通过将从NCI-H1975细胞系提取的DNA(突变；mu)和从K562细胞系提取的DNA(野生)以各自的比例混合以使总浓度为10ng/μL来制备本实施例的模板DNA。对于各自的制备，将野生来源的DNA和突变来源的DNA以10％，3％，1％，0.3％，0.1％和0％的混合比(mu/野生的％)混合。

·试剂

条件与实施例3相同。

·扩增条件

98℃：30秒

第一PCR反应；98℃：10秒，78℃：15秒(55至15个循环)

第二PCR反应；98℃：10秒，56℃：15秒(30至47个循环)

图4[A]至4[R]显示了第二PCR的扩增曲线，以及通过适当地组合第一PCR反应和第二PCR反应的循环数进行扩增反应时的最终相对荧光强度(PFU)值与突变等位基因比例(％)之间的相关性。如果扩增反应达到饱和阶段，则在第一PCR反应中产生的扩增产物的量通常不反映核酸样品中包含的基因突变的比例，因此，可以认为在第二PCR反应中产生的扩增产物也不反映核酸样品中基因突变的比例。实际上，在[A]至[C]中，当将第一PCR反应的循环数设为55以使扩增反应达到饱和阶段时，可以看出第二PCR反应的扩增曲线根本不反映出核酸样品中所含基因突变的比例(％)。相反，如在[D]至[F]中所示，表明将第一PCR反应的循环数降低至35会导致第一PCR的扩增反应未达到饱和阶段的条件，并且在随后的第二PCR反应中，通过用于第一PCR的引物，可以获得从扩增产物中扩增的曲线，其反映了核酸样品中包含的基因突变的量。此外，通过将第一PCR反应的循环数设置在32至15的范围内，并且另外将第二PCR反应的循环数设置为30或更大，使用ASP的第二PCR反应在保持特异性的同时，继续通过第一PCR反应获得的扩增产物的扩增反应，并反映了核酸样品中包含的基因突变的量，因此从第二PCR反应的最后一个循环中的PFU值和突变等位基因的比例(％)之间的关系中可以识别出更准确的相关性([G]至[R])。

从上述结果表明，在如下条件下，使用ASP通过核酸扩增反应选择性地扩增突变基因，维持了突变等位基因的比例(％)的定量，所述条件允许在第一PCR反应达到饱和阶段之前，至少第二引物组以反映核酸样品中包含的基因突变量的方式连续作用于所产生的扩增产物。

[实施例5]

EGFR基因外显子20的T790M突变等位基因的定量(2)

·模板DNA的制备

条件与实施例4相同。

试剂

条件与实施例3相同。

·扩增条件

98℃：30秒

第一PCR反应；98℃：10秒，78℃：15秒

第二PCR反应；98℃：10秒，56℃：15秒

循环数：第一PCR+第二PCR的组合＝62个循环

·离子交换色谱条件

条件与实施例3相同。

图5[A]，5[C]，5[E]和5[G]显示了通过对第一和第二PCR反应62的总循环数进行扩增反应的组合并用离子交换色谱法分离和检测扩增产物而获得的洗脱峰(箭头表示主洗脱峰)，图5[B]，5[D]，5[F]和5[H]显示了主洗脱峰面积与突变等位基因比例(％)之间的相关性。

在实施例4的循环数(在所述循环数时第二PCR反应后的荧光强度与突变等位基因的比例(％)之间的相关性获得了良好的结果)的组合条件下，在6.3分钟左右，识别了源自突变等位基因的扩增产物的清晰的洗脱峰，此外，在[A]～[F]中，洗脱峰的面积与突变等位基因的比例(％)之间也识别了良好的相关性。在第一PCR反应的35个循环的条件下(其中在实施例4中没有获得足够定量)，尽管识别了洗脱峰的定量，但是在突变等位基因的比例方面没有获得足够的结果。

从上述结果表明，在如下条件下，使用ASP通过核酸扩增反应选择性地扩增突变基因，然后通过离子交换色谱分离扩增产物，并比较扩增产物的峰面积，确保了突变等位基因的比例(％)的定量，所述条件允许在第一PCR反应达到饱和阶段之前，至少第二引物组以反映核酸样品中包含的突变基因的DNA量的方式连续作用于产生的扩增产物。

工业适用性

本发明的突变基因的检测方法可以用于制备用于预测酪氨酸激酶抑制剂对癌症患者中表皮生长因子受体的敏感性的伴随诊断剂和系统，以及制备作为个性化医学基础的其他伴随诊断剂和系统。