阅读说明：本技术 一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法 (Rapid identification and typing method for mycobacterium tuberculosis ) 是由 徐费凡 秦永伟 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法,包括：S1.标本预处理,利用标本采集装置对标本进行采集,每份标本中加入对硝基苯甲酸,混合充分后静置15-20分钟；S2.涂片；S3.染色；S4.菌体培养,将上述标本分别取出0.5ml接种到固体培养基中,然后器皿口加橡皮塞处于37摄氏度恒温条件下进行培养,每五天观察一次,连续培养八周；S4.菌体在组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后,使用BACTEC法,以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基；S5.打开橡皮塞通入氧气,继续在37摄氏度条件下培养。该结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法,可以在较短的时间内对结核杆菌进行鉴定和分型,大大降低了鉴定的时间,可以更加快速的出具准确的鉴定报告。(The invention discloses a method for rapidly identifying and typing mycobacterium tuberculosis, which comprises the following steps: s1, pretreating a specimen, namely collecting the specimen by using a specimen collecting device, adding p-nitrobenzoic acid into each specimen, fully mixing, and standing for 15-20 minutes; s2, smearing; s3, dyeing; s4, culturing thalli, namely taking out 0.5ml of the samples respectively, inoculating the samples into a solid culture medium, then culturing the samples under the constant temperature condition of 37 ℃ by adding rubber plugs into the mouth of a vessel, observing the samples once every five days, and continuously culturing the samples for eight weeks; s4, after the thalli are fully ground in a tissue grinder to break cells, a 7H12 culture medium containing 14C palmitic acid as a carbon source substrate is used by a BACTEC method; s5, opening the rubber plug, introducing oxygen, and continuing to culture at 37 ℃. The rapid identification and typing method for the mycobacterium tuberculosis can identify and type the mycobacterium tuberculosis in a short time, greatly reduce the identification time and more rapidly issue an accurate identification report.)

一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法

技术领域

本发明涉及分支杆菌技术领域，具体为一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据媒体报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。

近二十年，由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。21世纪以来全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。现在的结合杆菌的鉴定与分型技术效率低下，耽误时间，准确率低下，针对上述情况，在现有的技术基础上进行技术创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法，以解决上述背景技术中提出的结合杆菌的鉴定与分型技术效率低下，耽误时间，准确率低下的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法，包括：

S1.标本预处理，利用标本采集装置对标本进行采集，每份标本中加入对硝基苯甲酸，混合充分后静置15-20分钟；

S2.涂片，涂片包括直接涂片和集菌涂片；

S3.染色，将S2中的涂片滴加初染色，加热5-7分钟，静置自然冷却；

S4.菌体培养，将上述标本分别取出0.5ml接种到固体培养基中，然后器皿口加橡皮塞处于37摄氏度恒温条件下进行培养，每五天观察一次，连续培养八周；

S4.菌体在组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌；

S5.打开橡皮塞通入氧气，继续在37摄氏度条件下培养。

优选的，所述标本采集装置包括标本采集瓶若干，分别用于盛放痰标本、胸腔积液以及尿液，所述盛放痰标本的标本采集瓶加入柠檬酸钠至浓度为5％，所述盛放尿液的标本采集瓶中的尿液为24小时混合尿。

优选的，所述S2中直接涂片步骤为：分别取0.01ml不同标本涂抹10mm&times。

优选的，所述S2中集菌涂片步骤为：分别向不同标本加入2％NaOH溶液，然后将标本在37摄氏度恒温条件下静置30分钟再进行涂片。

优选的，所述S4中凡7天内生长菌落较快的为快速生长分支杆菌，7天以上生长者为慢生长分支杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法，可以在较短的时间内对结核杆菌进行鉴定和分型，大大降低了鉴定的时间，可以更加快速的出具准确的鉴定报告；

2、所采取的试剂比较廉价，检测方式比较简洁，容易上手，菌体在组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，而结核杆菌为抗酸杆菌；

3、7天内生长菌落较快的为快速生长分支杆菌，7天以上生长者为慢生长分支杆菌，可以在7天就能简单的判断出结核杆菌的存在。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法，包括：

S1.标本预处理，利用标本采集装置对标本进行采集，每份标本中加入对硝基苯甲酸，混合充分后静置15-20分钟；

S2.涂片，涂片包括直接涂片和集菌涂片；

S3.染色，将S2中的涂片滴加初染色，加热5-7分钟，静置自然冷却；

S4.菌体培养，将上述标本分别取出0.5ml接种到固体培养基中，然后器皿口加橡皮塞处于37摄氏度恒温条件下进行培养，每五天观察一次，连续培养八周；

S4.菌体在组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌；

S5.打开橡皮塞通入氧气，继续在37摄氏度条件下培养。

标本采集装置包括标本采集瓶若干，分别用于盛放痰标本、胸腔积液以及尿液，所述盛放痰标本的标本采集瓶加入柠檬酸钠至浓度为5％，所述盛放尿液的标本采集瓶中的尿液为24小时混合尿。

S2中直接涂片步骤为：分别取0.01ml不同标本涂抹10mm&times。

S2中集菌涂片步骤为：分别向不同标本加入2％NaOH溶液，然后将标本在37摄氏度恒温条件下静置30分钟再进行涂片。

S4中凡7天内生长菌落较快的为快速生长分支杆菌，7天以上生长者为慢生长分支杆菌。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。