阅读说明：本技术 一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法 (Method for high-throughput screening of mould-inhibiting lactic acid bacteria ) 是由 贾彩凤 冉琼 鲍子旗 刘玉婷 *** 李超文 潘建泽 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法,步骤如下：(1)乳酸菌种子液的制备；(2)霉菌孢子悬液的制备；(3)在多孔板中加入固体培养基、上述乳酸菌种子液(样品孔)或空白的MRS培养基(对照孔)进行培养；(4)然后每孔加入霉菌孢子悬液共培养,比较样品孔和对照孔的霉菌生长情况,筛选具有抑霉菌活性的乳酸菌。本发明在多孔板(如24孔板或者48孔板)上进行抑霉菌性乳酸菌的筛选,排除了由于霉菌菌丝及孢子在平板上大面积生长、繁殖对抑菌效果造成的干扰；本发明所述方法能够同时对几十株菌进行筛选,提高了筛选效率和准确度。(The invention discloses a method for high-throughput screening of mould-inhibiting lactic acid bacteria, which comprises the following steps: (1) preparing lactobacillus seed liquid; (2) preparing a mould spore suspension; (3) adding solid culture medium, the lactobacillus seed solution (sample well) or blank MRS culture medium (control well) into a multi-well plate for culturing; (4) then adding mould spore suspension into each hole for co-culture, comparing the mould growth conditions of the sample hole and the control hole, and screening the lactic acid bacteria with mould inhibiting activity. The method screens the mould-inhibiting lactic acid bacteria on a porous plate (such as a 24-pore plate or a 48-pore plate), and eliminates the interference on the antibacterial effect caused by the large-area growth and propagation of mould hyphae and spores on a flat plate; the method can screen dozens of strains at the same time, and improves the screening efficiency and accuracy.)

一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，涉及一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法。

背景技术

近年来，食品安全问题在全球备受关注，霉菌污染导致多种食品腐败，造成重大经济损失。此外，一些霉菌能够在食品中产生霉菌毒素，对人类健康构成威胁。因此，寻找更天然的生物防腐剂是目前国内外食品防腐剂开发的主要研究方向之一。

生物保护，定义为一种有机体对另一种有机体的抑制，近年来受到了广泛的关注。乳酸菌天然存在于许多食物中，并且在发酵食品中已经长期使用，使用乳酸菌进行生物保护具有重要的应用前景。

然而，现有技术中抑霉菌性乳酸菌筛选方法通常是双层琼脂法。该方法只能逐一筛选，试剂、耗材等花费较多且工作量较大，难以同时对大批量株菌进行筛选，不能快速得出结果，效率低下。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法，旨在解决乳酸菌筛选工作效率低下的问题，提供一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法。具体来说是使用多孔板法高通量筛选乳酸菌，所述筛选方法适用于青霉，黄曲霉，黑曲霉，枝孢霉，毛霉，根霉等霉菌。

本发明提供了一种高通量筛选抑霉菌性乳酸菌的方法，包括乳酸菌种子液的制备、种子液接入多孔板中培养、霉菌孢子的制备、乳酸菌和霉菌共培养结束后进行抑菌活性检测，筛选具有抑霉菌活性的乳酸菌。

具体地，所述方法包括以下几个步骤：

(1)乳酸菌种子液的制备：将乳酸菌菌落接入培养基中进行培养，得到乳酸菌种子液；

(2)霉菌孢子悬液的制备：将霉菌接种于固体培养基中进行培养，制备霉菌孢子，然后使用含吐温-80的无菌水冲洗，制备霉菌孢子悬液；

(3)抑菌活性检测：在多孔板中加入固体培养基、步骤(1)制备的乳酸菌种子液、步骤(2)制备的霉菌孢子悬液，然后进行共培养，比较霉菌的生长情况，对有抑霉菌活性的乳酸菌进行初步筛选。

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)乳酸菌种子液的制备：从乳酸菌平板上挑取单个乳酸菌菌落，接入MRS培养基中进行培养，得到乳酸菌种子液；

(2)霉菌孢子悬的液制备：将霉菌接种于马铃薯葡萄糖固体培养基斜面上培养制备霉菌孢子，然后使用含有体积分数为0.01～0.05％吐温-80的无菌水冲洗斜面，后涡旋振荡器上混匀，制得分散均匀的霉菌孢子悬液。

(3)抑菌活性检测：在多孔板中加入培养基、步骤(1)制备的乳酸菌种子液进行培养；然后加入步骤(2)制备的霉菌孢子悬液，后进行共培养，比较霉菌的生长情况，对有抑霉菌活性的乳酸菌进行初步筛选。

步骤(1)中，所述MRS培养基的组成为每升种子培养基包括：蛋白胨8～12g、牛肉浸膏8～12g、酵母粉3～7g、葡萄糖15～25g、硫酸镁0.08～0.12g、醋酸钠3～7g、柠檬酸铵1.5～2.5g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、硫酸锰0.04～0.06g、吐温80 0.8～1.2g，pH调节至6.8-7.4。

优选地，所述MRS培养基的组成为每升种子培养基包括：蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、硫酸镁0.1g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸锰0.05g、吐温801g，pH调节至7.0。

步骤(1)中，所述培养的温度为30～37℃；优选地，为30℃。

步骤(1)中，所述培养的时间为10～36h；优选地，为16～24h。

步骤(1)中，所述培养优选为厌氧静置培养。

步骤(2)中，所述霉菌为青霉，黄曲霉，黑曲霉，枝孢霉，毛霉，根霉等中的一种或多种；优选地，为青霉，黑曲霉。

步骤(2)中，所述马铃薯葡萄糖固体培养基配方为：200g马铃薯浸出液，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，不调节pH。

步骤(2)中，所述冲洗的次数为2～5次；优选地，为3～5次。

步骤(2)中，所述培养的温度为25～30℃；优选地，为30℃。

步骤(2)中，所述培养的时间为3～10d；优选地，为5～7d。

步骤(2)中，所述培养优选为静置培养。

步骤(3)中，所述多孔板中培养基为在MRS培养基的基础上，添加1.0～2.0％琼脂和0.05～0.2M K₂HPO₄，pH调节至6.5～7.5。

优选地，所述多孔板中培养基为在MRS培养基的基础上，添加1.5％琼脂和0.1MK₂HPO₄，pH调节至7.0。

步骤(3)中，所述多孔板中培养基的体积为100～300uL；优选地，为200uL，待培养基完全凝固后，再加入乳酸菌种子液。

步骤(3)中，所述多孔板中乳酸菌的接种量为每孔0.3～1.2uL；优选地，为0.75uL。

步骤(3)中，所述乳酸菌在多孔板进行培养的条件为：30～37℃下培养12～72h；优选地，为30℃下静置培养48h。

步骤(3)中，所述多孔板中霉菌孢子的接种量为每孔50～100uL；优选地，为100uL。

步骤(3)中，所述多孔板中霉菌孢子的终浓度为0.2～5×10⁴个/mL；优选地，为1×10⁴个/mL。

步骤(3)中，所述乳酸菌和霉菌孢子共培养的条件为：25～30℃下培养；优选为：30℃静置培养。

其中，所述乳酸菌和霉菌孢子共培养的时间根据不同霉菌的生长速度而有所不同，一般为2～7d。

本发明使用多孔板法对乳酸菌的抑霉菌效果进行检测，因为每个孔之间是相互区隔开的，可以排除霉菌菌丝生长、蔓延对不同的乳酸菌抑霉菌效果观察的影响。同时由于孔的区隔化，可以在多孔板的不同孔内同时检测乳酸菌对不同霉菌的抑菌效果，从而实现了乳酸菌抑霉菌活性的高通量筛选。

在一个

具体实施方式

中，所述方法包括以下几个步骤：

(1)乳酸菌种子液的制备：从乳酸菌平板上挑取单个乳酸菌菌落，接入15mL螺口试管装液量15mL的MRS培养液中，30℃静置培养10～36h，得到乳酸菌种子液。

(2)霉菌孢子悬液(指示菌菌液)的制备：将霉菌接种于马铃薯葡萄糖固体培养基上静置培养3～10d制备霉菌孢子，然后使用含有体积分数为0.01％吐温-80的无菌水冲洗，后涡旋振荡器上混匀，制得霉菌孢子悬液。

(3)抑菌活性检测：在多孔板中加入固体培养基，待凝固后，加入上述乳酸菌种子液(样品孔)或空白的MRS培养基(对照孔)，培养一段时间；然后每孔加入悬浮于软琼脂中的霉菌孢子，30℃培养48～120h，比较样品孔和对照孔的霉菌生长情况，筛选具有抑霉菌活性的乳酸菌。

本发明还提供了由上述方法筛选得到的抑霉菌性乳酸菌。

其中，所述抑霉菌性乳酸菌为益生菌，包括副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。所述抑霉菌性乳酸菌能够发酵糖类，产物主要为乳酸的一类无芽孢、***，包含乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和片球菌属等，200多个种。形态上可分成球菌、杆菌。

本发明使用多孔板检测乳酸菌的抑制霉菌活性，以添加不含乳酸菌的空白MRS培养基对阴性对照孔，以添加含乳酸菌菌种的孔为样品孔。共培养后，比较样品孔和对照孔中霉菌的生长情况，判断乳酸菌对霉菌的抑制活性。

本发明的有益效果在于：本发明在多孔板(如24孔板或者48孔板)上进行抑霉菌性乳酸菌的筛选，由于孔之间的区隔化，排除了由于霉菌菌丝及孢子在平板上大面积生长、繁殖对抑菌效果造成的干扰。由于不同种属的乳酸菌甚至相同种属但是不同菌株的抑霉菌效果存在差异，因此乳酸菌抑霉菌活性的筛选工作量大，而且繁琐。利用多孔板法，能够同时在一块板上对几十株乳酸菌的抑霉菌活性进行筛选，提高了筛选效率和准确度。

附图说明

图1：为本发明实施例1高通量筛选抑黄曲霉菌性乳酸菌的实验结果。

图2：为本发明实施例2高通量法筛选抑青霉菌性乳酸菌的实验结果。

图3：为本发明实施例3高通量法筛选抑枝孢霉菌性乳酸菌的实验结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1:高通量筛选抑黄曲霉性的乳酸菌

(1)乳酸菌种子液的培养：从多种乳酸菌平板上挑取单个乳酸菌菌落，接入15mL螺口试管装液量15mL的MRS培养液中，于30℃，静置培养18h，得到乳酸菌种子液。

(2)黄曲霉菌孢子悬液制备：取培养好的黄曲霉菌斜面，使用含有体积分数为0.01％吐温的无菌水冲洗，血球计数板计数并调整其在含0.5％琼脂和0.1M K₂HPO₄溶液中孢子浓度为1×10⁴个/mL，

(3)取培养好乳酸菌的24孔板，每孔上面覆盖100ul(pH＝6)含0.1M K₂HPO₄和1×10⁴个/mL的黄曲霉菌孢子的软琼脂(样品孔)，对照组加不含霉菌孢子的0.1M K₂HPO₄的100ul液体(对照孔)。

(4)30℃培养，5d后观察，比较样品孔和对照孔黄曲霉菌生长情况，从图1可以看出，没有接种乳酸菌的对照孔中，黄曲霉菌丝生长旺盛。和对照孔相比，B4，B5，B6孔中，黄曲霉菌丝生长较弱，表明该乳酸菌(一株副干酪乳杆菌)对黄曲霉有弱的抑制作用。而在接种入乳酸菌的A4，A5，A6孔中，几乎观察不到黄曲霉的生长，说明该乳酸菌(一株植物乳杆菌)对黄曲霉具有较强的抑制作用。

实施例2:高通量筛选抑青霉性的乳酸菌

(1)乳酸菌种子液的培养：从6种乳酸菌(1#,2#,3#,4#,5#,6#)平板上挑取单个乳酸菌菌落，接入15mL螺口试管装液量15mL的MRS培养液中，于30℃，静置培养18h，得到乳酸菌种子液。

(2)青霉菌孢子悬液制备：取培养好的青霉菌斜面，使用含有体积分数为0.01％吐温的无菌水冲洗，血球计数板计数并调整其在含0.5％琼脂和0.1M K₂HPO₄溶液中孢子浓度为1×10⁴个/mL，

(3)取培养好乳酸菌的24孔板，每孔上面覆盖100ul(pH＝6)含0.1M K₂HPO₄和1×10⁴个/mL的青霉菌孢子的MRS软琼脂(样品孔)，对照孔为不含霉菌孢子的软琼脂。

(4)30℃培养，5d观察，比较样品孔和对照孔青霉菌生长情况，从图2可以看出，没有接种乳酸菌的对照孔中，青霉菌丝以及孢子生长旺盛。而在接种入乳酸菌的B4，B5，B6孔中，几乎观察不到青霉的生长，说明该乳酸菌(一株植物乳杆菌)对青霉具有较强的抑制作用。

实施例3:高通量筛选抑枝孢霉性的乳酸菌

(1)乳酸菌种子液的培养：从不同的乳酸菌平板上挑取单个乳酸菌菌落，接入15mL螺口试管装液量15mL的MRS培养液中，于30℃，静置培养18h，得到乳酸菌种子液。

(2)青霉菌孢子悬液制备：取培养好的枝孢霉菌斜面，使用含有体积分数为0.01％吐温的无菌水冲洗，血球计数板计数并调整其在含0.5％琼脂和0.1M K₂HPO₄溶液中孢子浓度为1×10⁴个/mL。

(3)取培养好乳酸菌的24孔板，每孔上面覆盖100ul(pH＝6)含0.1M K₂HPO₄和1×10⁴个/mL的枝孢霉菌孢子的MRS软琼脂(样品孔)，对照孔为不含霉菌孢子的软琼脂。

(4)30℃培养，2d观察，比较样品孔和对照孔枝孢霉菌生长情况，从图3可以看出，没有接种乳酸菌的对照孔中，枝孢霉菌丝及孢子生长旺盛。和对照孔相比，B4，B5，B6孔中，枝孢霉菌丝生长较弱，表明该乳酸菌(一株鼠李糖乳杆菌)对枝孢霉有弱的抑制作用。而在接种入乳酸菌的A4，A5，A6孔(一株鼠副干酪乳杆菌)，B4，B5，B6孔(一株鼠李糖乳杆菌)以及C1，C2，C3孔(一株植物乳杆菌)中，几乎观察不到枝孢霉的生长，说明该几种乳酸菌对枝孢霉具有较强的抑制作用。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。