阅读说明：本技术 荷叶碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用 (Application of nuciferine in preparation of medicine for treating acute kidney injury ) 是由 谭克 樊玉梅 李丹雨 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种荷叶碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用,伸入探讨了荷叶碱对AKI的治疗效果及抑制分子机制,进一步挖掘了荷叶碱的药理功能,拓宽了公众对荷叶碱的药效认知。(The invention discloses application of nuciferine in preparation of a medicine for treating acute kidney injury, which discusses the treatment effect and molecular inhibition mechanism of nuciferine on AKI, further develops the pharmacological function of nuciferine, and widens the public pharmaceutical effect cognition on nuciferine.)

荷叶碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及急性肾损伤技术领域，更具体地说是涉及荷叶碱在制备治疗肾损伤药物中的应用。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种临床常见且治疗费用较高的危重病症，其发病率和死亡率均呈逐年增高的趋势。急性肾损伤主要表现为突发和持续的肾功能快速下降和代谢产物的不断积累。诊断指标为血清肌酐(serum creatinine)的增高，主要症状为少尿或无尿，氮质血症，水电解质及酸碱平衡紊乱。根据最新的流行病学调查，轻微、可逆的急性肾损伤也会导致肾脏的持久损害，而严重的急性肾损伤更会导致肾脏功能的不可逆性下降，从而增加死亡的风险和几率。如果AKI不能得到有效治疗，会发展成为慢性肾脏疾病，甚至会直接进展到肾病的终末期。

近期研究表明，AKI的初期，肾血流灌注不足导致肾小管致死性损伤，细胞骨架完整性被破坏；转运蛋白和粘附分子重新分布，细胞间紧密连接断裂，小管基底膜裸露。随着损伤进展，肾缺血再灌注导致小管细胞凋亡、坏死，尤其在近曲小管直段和髓襻升支的粗段最为严重。目前认为，肾小管上皮细胞坏死和凋亡是AKI公认的的诱发因素，并且鉴定出AKI特异性标志物。肾小管上皮细胞在AKI的发病过程中能够促进炎症反应。肾脏损伤分子-1(KIM-1)是一种I型跨膜糖蛋白，表达于受损细胞表面，KIM-1表达增加可导致受损的上皮细胞被巨噬细胞吞噬。AKI发生早期阶段，KIM-1介导的对损伤、衰老细胞吞噬作用的上调可促进炎症反应，故KIM1可作为早期肾小管损伤的标记。另外，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)也是AKI的特异性指标。NGAL属脂质运载蛋白超家族，在肾脏缺血或肾毒性损害时显著上调，高表达于受损肾小管，促进上皮细胞再生，是一种缺血或肾毒性AKI的早期敏感、且较特异的生物学标志物。另外，肾小管上皮细胞产生的细胞因子在AKI中起了一定的作用。肾小管上皮细胞还可以产生其他多种致炎因子，包括TNF-α、IL-6、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和细胞趋化因子等。目前研究较多的细胞趋化因子有调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)和IL-6等。

遗憾的是，目前临床仍然没有在分子水平上治疗AKI的特效药物，AKI严重时甚至需要肾脏替代手术疗法；虽然已在支持治疗方面取得一定进展，但AKI患者的存活率仍没有得到显著改变。

荷叶碱(Nuciferine)是从荷叶中提取的主要单体成分，属于一种阿朴啡类生物碱。由于在食用和药用中所展现出的广泛作用，科学家越来越关注荷叶碱药理作用和分子机制的基础研究。荷叶碱不仅具有出色的抗真菌作用，对革兰氏阳性菌和耐酸菌也有明显的抗菌活性。荷叶碱还可以通过清除相关自由基、增强酶活性等方式起到抗氧化作用。荷叶碱通过多重通路和基因对抗炎症反应。在小鼠巨噬细胞RAW264.7及小胶质细胞BV2中，荷叶碱通过PPAR抑制LPS诱导的炎症因子的释放。荷叶碱通过介导小鼠TLR4-NF-κB信号通路减缓LPS诱导的乳腺炎，还可通过抑制TLR4减缓LPS导致的小鼠急性肺损伤。此外，荷叶碱具备良好的降脂减肥功效，还对多种肿瘤细胞均显示出突出的抗增殖、抗浸润功效，并触发肿瘤细胞发生凋亡。但是，荷叶碱是否对急性肾损伤有抑制和治疗作用并不明确。

因此，如何提供一种以荷叶碱为主要成分的治疗急性肾损伤的药物并深入研究荷叶碱的作用机制是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种荷叶碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，深入探讨了荷叶碱对AKI的治疗效果及抑制分子机制，进一步挖掘了荷叶碱的药理功能，拓宽了公众对荷叶碱的药效认知。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

荷叶碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用，荷叶碱通过降低血清中肌酐和尿素氮的含量来达到治疗AKI的效果；此外，而且荷叶碱还可以通过降低肾脏内KIM-1的mRNA、NGAL的mRNA、Fn14的mRNA、Klotho的mRNA、IL-6的mRNA、TNF-α的mRNA及fibronectin的表达量来治疗AKI。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种荷叶碱在制备治疗AKI药物中的应用，研究发现，荷叶碱通过降低肾脏中AKI的诱发因子KIM-1的mRNA的表达量、降低肾小管损伤标志分子中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)mRNA的表达量及降低AKI相关致炎因子mRNA的表达量来达到治疗AKI的效果；本发明一方面，提供了一种荷叶碱的新用途，拓宽了荷叶碱的应用范围；另一方面，为AKI的预防和治疗提供了理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为以HE染色法对NaHCO₃组、叶酸(FA)处理组、FA+N(叶酸+荷叶碱)处理组和N(荷叶碱)处理组染色的结果图；

图2附图为以肌氨酸氧化酶法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠血清肌酐含量的结果示意图；

图3附图为以脲酶法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠血清尿素氮含量的结果示意图；

图4附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内KIM-1的mRNA表达量的结果示意图；

图5附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内NGAL的mRNA表达量的结果示意图；

图6附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内Fn14的mRNA表达量的结果示意图；

图7附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内Klotho的mRNA表达量的结果示意图；

图8附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内IL-6的mRNA表达量的结果示意图；

图9附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内TNF-α的mRNA表达量的结果示意图；

图10附图为以qRT-PCR法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内TWEAK的mRNA表达量的结果示意图；

图11附图为以IHC法检测NaHCO₃组、FA处理组、FA+N处理组和N处理组中小鼠肾脏内fibronectin表达量的结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中，KIM-1代表肾脏损伤分子-1；NGAL为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；IL-6为白细胞介素；TNF-α为肿瘤坏死因子-α；Fn14和TWEAK为AKI标志蛋白；Klotho为内分泌成纤维细胞生长因子(FGF)受体复合物主要部分；

实施例中用到的试剂及试验器材如下：

荷叶碱(MCE)，雄性C57BL/6小鼠(北京华阜康)，4％多聚甲醛(Servicebio)，正置显微镜(蔡司)，乙醇(天津永大)，二甲苯(万类生物)，苏木素染料(索来宝)，伊红染料(索来宝)，叶酸(Sigma)，多功能酶标仪(BioTek)，肌酐测定试剂盒(南京建成)，尿素氮试剂盒(南京建成)，2*SYBR Greenmix(TaKaRa)，定量96孔板(Axygen)，定量PCR仪(Bio-Rad)，fibronectin(15613-1-AP，Proteintech)，HRP标记山羊抗兔IgG(31460，thermo fisher)。

实施例1AKI模型的构建及荷叶碱对叶酸诱导的急性肾损伤的影响

试验过程：将雄性C57BL/6小鼠随机分为四组，NaHCO₃组，FA处理组，FA+N处理组和N处理组，每组6只小鼠，处理如下：

NaHCO₃组：小鼠腹腔注射100μl的NaHCO₃(0.3M)；

FA处理组：小鼠腹腔注射250mg/kg剂量的叶酸(50mg/ml)，诱导小鼠的急性肾损伤；

FA+N处理组：在小鼠腹腔注射叶酸2小时前，灌胃给予40mg/kg剂量的荷叶碱(5mg/ml)，叶酸注射后，每隔12小时灌胃给予40mg/kg剂量的荷叶碱；

N处理组：每隔12小时灌胃给予40mg/kg剂量的荷叶碱(5mg/ml)；

48小时后收取NaHCO₃组，FA处理组，FA+N处理组和N单处理组的小鼠肾脏，实施石蜡切片后，进行HE染色，结果如图1所示；

由图1可知，叶酸注射48小时后，FA组小鼠肾脏出现急性肾损伤的病理特征，表现为上皮细胞扁平化或空泡样变性，肾小管刷状缘变浅或消失，肾小管官腔显著增大、扩张，肾间质炎性细胞浸润等。而在FA+N处理组中，上述小鼠的急性肾损伤的病理特征均明显减轻。NaHCO₃组和N处理组的小鼠肾脏无显著病理变化。

试验原理：

HE染色又称苏木精-伊红染色法，是石蜡切片技术中最常用的染色方法之一。苏木精为碱性，主要使细胞核内的染色质和胞质内的核酸染成紫蓝色。伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分染成红色。HE染色法师组织学和病理学中最基本、最广泛的技术方法。

实施例2肌氨酸氧化酶法检测荷叶碱对AKI小鼠血清肌酐(CRE)含量的影响

试验过程：小鼠分组处理同实施例1。48小时后对小鼠眼球取血1ml左右，血液静置2小时后在重力为1000g下离心30分钟，取上清得到小鼠血清。向血清中加入尿素氮试剂盒中的试剂一180μl，然后在37℃下静置5分钟，于546nm波长测定吸光度值A1。之后加入试剂二60μl，在37℃下静置5分钟，于546nm波长测定吸光度值A2，并按照下列公式进行计算，结果如图2所示；

由图2可知，FA组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于NaHCO₃组，小鼠血清肌酐水平显著升高；而在FA+N处理组中，小鼠血清肌酐水平明显下降；N处理组的小鼠血清肌酐水平无显著变化。说明荷叶碱可以降低血清肌酐含量，从而预防或治疗AKI。

试验原理：肌酐在肌酐酰胺水解酶的催化下生成肌酸，肌酸进而在肌酸氨基水解酶的催化作用下水解生成肌氨酸和尿素。肌氨酸再经肌氨酸氧化酶催化生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢。过氧化氢与2，4-(6-三碘-3-羟基苯甲酸)及4-氨基安替比林在过氧化物酶的催化下反应产生***化合物，可通过546nm波长比色测定。

实施例3脲酶法检测荷叶碱对AKI小鼠血清尿素氮(BUN)的影响

试验过程：小鼠处理及分组同实施例1。48小时后对小鼠眼球取血1ml，血液静置2小时后在重力为1000g下离心30分钟，取上清得到小鼠血清。向血清中加入尿素氮试剂盒中的缓冲酶液250μl，混匀，37℃水浴10分钟。之后，加入试剂二1.5ml、试剂三1.5ml，混匀，37℃水浴10分钟，640nm波长测定吸光度值，并按照下列公式进行计算。结果如图3所示；

尿素氮浓度(mmol/L)＝(测定值-空白值)/(标准值-空白值)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

由图3可知，FA处理组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于NaHCO₃处理组，小鼠血清尿素氮水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠血清尿素氮水平明显下降。N处理组的小鼠血清的尿素氮水平无显著变化。说明荷叶碱可以显著降低血清中尿素氮的水平，从而达到预防或治疗AKI的效果。

试验原理：尿素在脲酶的催化作用下发生水解作用，产生氨离子和二氧化碳。氨离子在碱性介质中与酚显色剂生成蓝色的物质，该物质的生成量与尿素的含量成正比关系。

实施例4qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内KIM-1的mRNA表达量的影响

试验过程

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎并用玻璃匀浆器匀浆，向匀浆液中加入1ml Trizol，静置10分钟后，加入200μl氯仿，然后再静置10分钟，并以12000rpm的转速离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，晾干得RNA，晾干后用DEPC水溶解RNA，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入KIM-1的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图4可知。

KIM-1引物序列：

KIM1-F，ACATATCGTGGAATCACAACGAC，如SEQ ID NO.1所示；

KIM1-R，ACTGCTCTTCTGATAGGTGACA，如SEQ ID NO.2所示。

由图4可知，FA处理组的小鼠在注射叶酸48小时后，相比于NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内KIM-1的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内KIM-1的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内KIM-1的mRNA水平无显著变化。说明荷叶碱可以显著降低肾脏内KIM-1的mRNA的表达量。

实验原理

在进行荧光定量PCR反应中需要加入特定波长的荧光染料或者基团，然后通过仪器对荧光物质进行监测得到其积累信号即为PCR反应进程，从而定量定性分析起始模板。PCR反应产物随着PCR反应的进行而不断积累，同时荧光信号强度也会不断呈正比增加。

SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料,最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm,可以和所有的dsDNA双螺旋小沟区域结合。在游离状态下SYBR Green I发出的荧光较弱,但是当它与双链DNA结合后,荧光就会大大增强,而且荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

实施例5qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内NGAL的mRNA表达量的影响

试验过程：小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎并用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，再静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入NGAL的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图5可知。

由图5可知，FA处理组的小鼠注射叶酸48小时后，相比于NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内NGAL的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内NGAL的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内NGAL的mRNA水平无显著变化。说明荷叶碱可以显著降低肾脏内NGAL的mRNA的表达量。

NGAL引物序列：

NGAL-F，AATGTCACCTCCATCCTGGT，如SEQ ID NO.3所示；

NGAL-R，ATTTCCCAGAGTGAACTGGC，如SEQ ID NO.4所示；

实施例6qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内Fn14的mRNA的影响

实验步骤

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎后用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入Fn14的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图6可知。

Fn14引物序列：

Fn14-F，GTGTTGGGATTCGGCTTGGT，如SEQ ID NO.5所示；

Fn14-R，CCAGGCAGAAGTCGCTGTG，如如SEQ ID NO.6所示；

由图6可知，FA+N处理组的小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内Fn14的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内Fn14的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内Fn14的mRNA水平无显著变化。

实施例7qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内Klotho的mRNA的影响

实验步骤

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎并用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入Klotho的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图7可知。

由图7可知，FA处理组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内Klotho的mRNA水平显著降低。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内Klotho的mRNA水平明显升高。N处理组的小鼠肾脏内klotho的mRNA水平无显著变化。

Klotho引物序列：

Klotho-F，TCTCAAGAAGTTCATAATGGAAACC，如SEQ ID NO.7所示；

Klotho-R，CAGAAAGTCAACGTAGAAGAGTCCT，如SEQ ID NO.8所示；

实施例8

qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内IL6的mRNA的影响

实验步骤

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎后用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入IL6的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图8可知。

IL-6引物序列：

IL-6-F，AGTCCGGAGAGGAGACTTCA，如SEQ ID NO.9所示；

IL-6-R，ATTTCCACGATTTCCCAGAG，如SEQ ID NO.10所示；

由图8可知，FA处理组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内IL6的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内IL6的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内IL6的mRNA水平无显著变化。

实施例9

qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内TNFα的mRNA的影响

实验步骤

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎后用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入TNFα的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图9所示。

TNF-α引物序列：

TNF-α-F，AGTGACAAGCCTGTAGCCCACGT，如SEQ ID NO.11所示；

TNF-α-R，CCATCGGCTGGCACCACTAGTT，如SEQ ID NO.12所示；

由图9可知，FA处理组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内TNFα的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内TNFα的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内TNFα的mRNA水平无显著变化。

实施例10

qRT-PCR法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内TWEAK的mRNA的影响

实验步骤

小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，搅碎后用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆液加入1ml Trizol，静置10分钟，加入200μl氯仿，静置10分钟后12000rpm离心10分钟。取上清加入等体积异丙醇，静置10分钟，12000rpm离心15分钟，弃上清，用75％的乙醇清洗沉淀两次，然后晾干RNA，用DEPC水溶解，测浓度。

将RNA反转录成cDNA，之后加入TWEAK的引物和10μl SYBR Green，混匀后，用定量PCR仪扩增，得到扩增产物的Cq值，采用2^-ΔCT法处理数据，结果如图10可知。

TWEAK引物序列：

TWEAK-F，CGAGCTATTGCAGCCCATTAT，如SEQ ID NO.13所示；

TWEAK-R，ACCTGCTTGTGCTCCATCCT，如SEQ ID NO.14所示；

由图10可知，FA处理组小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内TWEAK的mRNA水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内TWEAK的mRNA水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内TWEAK的mRNA水平无显著变化。

实施例11IHC法检测荷叶碱对AKI小鼠肾脏内fibronectin的影响

试验过程：小鼠处理及分组同实施例1。48小时后收取小鼠肾脏，实施石蜡切片处理，然后孵育一抗、二抗，然后以苏木素对切片复染，脱水、透明、封片，镜检。结果如图11所示。

由图11可知，FA处理组的小鼠在注射叶酸48小时后，相比于(NaHCO₃处理组，小鼠肾脏内fibronectin的水平显著升高。而在FA+N处理组中，小鼠肾脏内fibronectin的水平明显下降。N处理组的小鼠肾脏内fibronectin的水平无显著变化。

试验原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 荷叶碱在制备治疗肾损伤药物中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acatatcgtg gaatcacaac gac 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgctcttc tgataggtga ca 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgtcacct ccatcctggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttcccaga gtgaactggc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgttgggat tcggcttggt 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaggcagaa gtcgctgtg 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctcaagaag ttcataatgg aaacc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagaaagtca acgtagaaga gtcct 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtccggaga ggagacttca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atttccacga tttcccagag 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtgacaagc ctgtagccca cgt 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccatcggctg gcaccactag tt 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgagctattg cagcccatta t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acctgcttgt gctccatcct 20