奎纳克林在制备治疗肺纤维化药物中的应用
阅读说明：本技术 奎纳克林在制备治疗肺纤维化药物中的应用 (Application of quinacrine in preparation of medicine for treating pulmonary fibrosis ) 是由 宁斌 金政鑫 刘镕菡 董辉 张英 田立歌 朱苹 于 2021-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及奎纳克林在制备治疗肺纤维化药物中的应用,其结构式如下所示：。本发明首次发现奎纳克林能够通过靶向CUL4B蛋白,抑制Smad2/3磷酸化,进而影响TGF-β1／Smads信号转导通路,实现治疗肺纤维化的效果,该发现克服了现有技术认为奎纳克林只是作为一种增敏剂参与到肝癌等癌症的治疗过程中,从而显著拓宽了奎纳克林的应用范围。(The invention relates to an application of quinacrine in preparing a medicament for treating pulmonary fibrosis, which has a structural formula as follows: . The invention discovers for the first time that quinacrine can inhibit Smad2/3 phosphorylation by targeting CUL4B protein, further influences TGF-beta 1/Smads signal transduction pathway and realizes the effect of treating pulmonary fibrosis, and the discovery overcomes the defect that quinacrine is only used as a sensitizer to participate in the treatment process of cancers such as liver cancer and the like in the prior art, thereby remarkably widening the application range of the quinacrine.)
技术领域
本发明涉及奎纳克林在制备治疗肺纤维化药物中的应用，属于化学药物开发技术领域。
背景技术
肺纤维化是一组多种病因引起的以进行性呼吸困难、咳嗽、气体交换障碍和呼吸衰竭为特征的间质性肺疾病，其发病机制迄今未阐明，缺乏特异性治疗方法。其特征是驻留在肺间质和血管周围的成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞并生成过多的细胞外基质（ECM）沉积在肺泡和肺间质内。有研究发现，细胞外基质（ECM）产生的关键途径与TGF-β1／Smads信号传导有关。
肺纤维化过程中，多种因素的共同影响，尤其是大量细胞因子的刺激作用，会使肺成纤维细胞（FB）不断地增殖和转型为肌成纤维细胞（MB），肌成纤维细胞能合成和分泌大量胶原。其中最为关键的因素是转化生长因子β（TGF-β）。它是目前认为的致纤维化作用最强的细胞因子之一，它们通过与相应的受体结合，刺激成纤维细胞增殖并诱导其向MB转化，TGF-β还可以诱导上皮-间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），使上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。这一过程在肺纤化中也起到了关键作用。
人类转化生长因子β( TGF-β)家族包括33个成员，均为二聚体的分泌型多肽，其中包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、activin、nodal和骨形态蛋白。该家族成员参与调控细胞分化、细胞衰老、细胞凋亡、细胞粘连与迁移、胞外基质合成与重塑、EMT、免疫抑制剂和血管形成等病理生理过程，在早期胚胎发育、组织器官形成和成体稳态平衡中发挥着至关重要的作用。因此，TGF-β家族细胞因子信号转导通路受到严格的时空特异性调控，而信号转导失调不仅可能导致胚胎发育异常，还与多种人类疾病相联系，包括肿瘤、组织纤维化、心血管疾病和自体免疫疾病等。Smads 蛋白家族是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，Smads 家族蛋白在TGF-β信号向细胞核内传导过程中起关键性作用。研究表明，TGF-β1 参与EMT 过程的机制主要是通过Smads依赖通路完成的，而Smad2、3、4、7 均为为此通路中参与多种信息传递的关键蛋白。TGF-β 首先与位于TGF-βRII的胞外段结合，激活胞内的TGF-βRI，活化的TGF-βRI使Smad2、Smad3磷酸化并与Smad4 结合形成复合物进入细胞核中，进入细胞核中的smad2/3/4复合物与特定的DNA 序列相结合，调节转录因子，促进EMT 发生。该复合物也能诱导纤维连接蛋白及α-SMA 的表达，从而诱发组织纤维化发生。
TGF-β1／Smads信号还参与如下生理活动：1. TGF-β1／Smads信号通路与创伤愈合:伤口愈合分为3个过程，包括(1)生理的炎症过程；(2)肉芽组织增生和胶原合成；(3)组织重塑和瘢痕形成；2. TGF-β1/Smads信号通路与心室重构:心室重构是多种心脏疾病的重要病理生理的改变,可引起心力衰竭、心律失常、心源性猝死等严重并发症。从细胞水平上心室重构包括胞外的信号刺激、胞内信号转导及核内基因转录的活化这3个主要环节。
由此可见，肺纤维化严重威胁人类健康，但由于其确切发病机制至今尚未完全明了，仍缺乏特异有效的治疗手段，因此对肺纤维化发病机制的研究对临床治疗具有指导意义。
奎纳克林是1920年代发现的，历史上曾被用作预防和治疗的抗疟药。奎纳克林是一种吖啶衍生物，可作为奎纳克林二盐酸盐口服给药，奎纳克林二盐酸盐结构式如下：
奎纳克林还可用作贾第鞭毛虫病的抗菌药，系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎的抗炎药，以及作为胸膜内硬化剂用于预防恶性胸腔积液和气胸的复发。此外，它在某些国家仍被用于女性绝育，并且正在针对克雅氏病进行临床评估。因其副作用小，毒性较低且大多数副作用在停药后可逆转，被用作抗癌潜在药物，已有相关研究发现其在结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌、头颈癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌等中的抗癌潜力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供奎纳克林在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
奎纳克林在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用，所述奎纳克林的结构式如下：
。
根据本发明优选的，所述肺纤维化疾病为由TGF-β1／Smads 信号转导通路异常导致的。
根据本发明优选的，所述奎纳克林作为药效成分。
根据本发明优选的，所述药物还包括促进剂，促进剂可以提高CUL4B蛋白与奎纳克林的结合。
一种适于肺部施用的药物，所述药物含有奎纳克林、奎纳克林对映异构体或非对映异构体、奎纳克林药学上可接受的盐做为药效成分。
根据本发明优选的，所述药物还含有提高CUL4B蛋白与奎纳克林结合的促进剂。
根据本发明优选的，所述药物还含有药学上可接受的载体或者辅料。
根据本发明优选的，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、注射剂、胶囊剂或气雾剂。
CUL4B蛋白可做为靶蛋白在筛选治疗肺纤维化疾病的药物中进行应用，所述药物与靶蛋白CUL4B结合后，能够增加靶蛋白CUL4B的稳定性。
原理说明
目前已有研究证实奎纳克林可以与其他抗癌药物联用从而提升药物对例如乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等的治疗效果，说明奎纳克林可能以增敏剂的形式与化疗药物协同作用，从而增加了癌细胞对化疗药物的敏感性，从而抑制肿瘤的增殖与生长。但肺纤维化在发生发展过程中主要受到TGFβ1/Smads信号的调控，在该领域并没有研究人员针对奎纳克林与TGF-β1/Smads信号通路以及肺纤维化之间进行研究，发明人针对TGF-β1/Smads信号通路与肺疾病模型进行的研究具有首创性。
有益效果
本发明首次发现奎纳克林能够通过靶向CUL4B蛋白，抑制Smad2/3磷酸化，进而影响TGF-β1／Smads 信号转导通路，实现治疗肺纤维化的效果，该发现克服了现有技术认为奎纳克林只是作为一种增敏剂参与到肝癌等癌症的治疗过程中，从而显著拓宽了奎纳克林的应用范围。
附图说明
图1为实施例1表面等离子体共振技术实验（SPR实验）的结果照片；
图2为实施例2计算机模拟分子对接实验（MOE-Dock实验）的结果照片；
图3为实施例3中转染不同CUL4B蛋白结构域质粒后证明奎纳克林与不同CUL4B蛋白结构域结合情况的DARTS实验结果照片；
图4为实施例4中提取小鼠肺组织可溶性胶原蛋白的表达柱状图；
图5为实施例4中小鼠肺组织提取RNA使用RT-PCR检测结果的柱状图；
图6为实施例4中小鼠肺组织的HE染色、MASSON三色染色及免疫组化染色结果；
图7为实施例4中小鼠肺脏组织提取蛋白质行western blot实验检测P-SMAD2/3的蛋白水平表达结果照片；
图8为实施例4中小鼠肺脏组织进行免疫组化实验观察P-SMAD2/3的表达情况的照片；
图9为实施例5中人成纤维系HKF的RT-PCR检测结果的柱状图；
图10为实施例6中分别提取细胞核、细胞浆蛋白后进行western blot实验检测结果的照片；
图11为实施例7中敲除CUL4B基因的稳转细胞系进行western blot实验检测结果的照片；
图12为实施例7中敲除CUL4B基因的稳转细胞系进行TGF-β刺激后行western blot实验检测P-Smad2/3蛋白水平表达结果的照片；
图13为实施例7中敲除CUL4B基因的稳转细胞系进行TGF-β刺激后行western blot实验检测α-SMA蛋白水平表达结果的照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
表面等离子体共振技术实验（Surface Plasmon Resonance SPR实验）
1）样品信息
固定相：
名称
分子量
Buffer
浓度
CUL4B
130.4 KD
Tris
30 μg/mL
流动相：
名称
分子量
Buffer （盐酸奎纳克林含量）
盐酸奎纳克林
472.88
65 mg
2）仪器参数
蛋白固定：仪器：Biacore S200；芯片类型：S-CM5；Running buffer：PBS-P；Ligand浓度:30 μg/mL ；流速：10 μL/min。再生条件：再生液：10 mM glycine-HCl, pH 2.0；进样时间：30 s；流速：30 μL/min。动力学分析：对照通道：flow cell 1；Running buffer：PBSP,2%DMSO；Contact time：120 s；Dissociation time：300 s；流速：30 μL/min ；使用KineticAnalysis Wizard模式拟合。
3）实验流程
样品溶解及稀释：
3.1）受体蛋白CUL4B的换液及稀释：
CUL4B蛋白浓度为：30 μg/mL, CUL4B蛋白分子量为：130.4 KD
即蛋白浓度C = 230.0613 nM
使用脱盐柱处理CUL4B蛋白液，将其换液至pH 4.0的10mM NaAc中；
3.2）配体小分子盐酸奎纳克林的溶解及稀释：
取65mg 盐酸奎纳克林干粉，分子量为：472.88，加入6.8728 mL DMSO
充分混匀得：浓度C=20 mM、体积V=6.8728 mL的盐酸奎纳克林溶液；
取20 μL、浓度C=20 mM的盐酸奎纳克林溶液，加入980 μL PBSP充分混匀得：浓度C=400 μM、体积V=1 mL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=400 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=200 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=200 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=100 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=100 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=50 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=50 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=25 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=25 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=12.5 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=12.5 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=6.25 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=6.25 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=3.125 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=3.125 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP, 2%DMSO充分混匀得：浓度C=1.563 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液；
取300 μL、浓度C=1.563 μM的盐酸奎纳克林溶液，加入300 μL PBSP， 2%DMSO充分混匀得：浓度C=0.781 μM、体积V=600 μL的盐酸奎纳克林溶液。
3.3）蛋白固定：
使用pH 4.0的10 mM NaAc 做为Buffer将受体蛋白CUL4B偶联到CM5芯片上，预设偶联值：5000 RU (pg/mm2)；
3.4）亲和力检测：
使用梯度浓度的配体蛋白流经芯片表面，获得响应数据及响应曲线。使用KineticAnalysis Wizard拟合模型对所得响应数据进行拟合。
实验结果
SPR是将一种生物分子固定在传感器芯片表面，再把与之相互作用的分子溶于溶液后流经芯片表面，引起结合到芯片表面的分子质量变化，从而改变表面折射率（折射率的变化和结合在金属表面的生物分子质量成正比），最后通过检测生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号（SPR角随表面折射率的变化而变化）。通过使用Biacore S200对CUL4B蛋白与奎纳克林之间的结合情况进行了SPR检测，发现CUL4B蛋白和奎纳克林之间存在结合，Kd=4.848E-4 M，结果如图1所示。
上述操作为本领域常规技术操作，如可参考《Advances in Surface PlasmonResonance Imaging and Microscopy and Their Biological Applications》（MarkétaBocková, etc,《Annual Review of Analytical Chemistry》，2019. 12:10.1–10.26）等。
实施例2
计算机模拟分子对接实验（MOE-Dock实验）
MOE Dock用于盐酸奎纳克林与CUL4B的分子对接。从PubChem下载奎纳克林的二维结构，通过能量最小化在MOE中转化为三维结构，作为配体。CUL4B的晶体结构从RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)下载，PDB ID为4A0C2。以4A0C的C链作为对接受体。对接前，选取了AMBER10: EHT的力场和反应场(r -场)的隐式溶剂化模型。选择“诱导拟合”方案，允许受体结合位点侧链根据配体构象移动，并对其位置施加约束。用于将侧链原子系到原来位置的重量为10。首先采用London dG评分函数对所有停靠位姿进行评分，然后对前30位姿进行力场细化，再采用GBVI/WSA dG评分函数进行评分。结合自由能最低的构象是最佳的可能结合模式。PyMOL (www.pymol.org)显示了结合模式。
实验结果
奎纳克林与CUL4B蛋白结合模式如图2所示，奎纳克林位于CUL4B的结合囊的深处，表现出键合作用。在结合袋内，奎纳克林吖啶环上的吡啶环和苯环与CUL4B中Glu834的碳原子形成Pi-H相互作用。奎纳克林与周围残基之间也形成了VDW相互作用。这些相互作用贡献了奎纳克林与CUL4B之间的结合能。MOE-Dock模拟研究确定奎纳克林与CUL4B的结合亲和力，对接分数为-7.9926kcal/mol。
上述操作为本领域常规技术操作，如可参考《The molecular basis ofCRL4DDB2/CSA ubiquitin ligase architecture, targeting, and activation》（Fischer ES,etc.《Cell》. 2011 Nov 23;147(5):1024-39），软件采用《MolecularOperating Environment (MOE) 2018.01;》（Chemical Computing Group Inc., 1010Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7. 2018.）等。
实施例3
药物（奎纳克林）与靶蛋白（CUL4B）结合稳定性实验（DARTS实验）
1）质粒构建与转染：质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。分别构建具有FLAG标签的含不同CUL4B蛋白结构域的质粒，将构建好的质粒分别转染进工具细胞293T细胞后于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养48h。
2）配制DARTS细胞裂解液（1mL）：M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂 730μL、蛋白酶抑制剂 10μL、200 mM 磷酸酯酶抑制剂sodium orthovanadate 10μL、1 M氟化钠溶液 50μL、100mM β-甘油磷酸钠溶液 100μL、50mM焦磷酸钠溶液 100μL；配制10×TNC（1 mL）：1 MTris-HCl缓冲液，pH 8.0 500μL、5 M 氯化钠溶液 100μL、1 M 氯化钙溶液 100μL、无菌去离子水 300μL。使用时需用无菌去离子水将10×TNC稀释10倍；使用时链酶蛋白酶 Pronase的浓度为10mg/mL。
3）用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤转染后293T细胞2次，吸净PBS溶液后加入500μL M-PER裂解液，刮取细胞并移至1.5mL EP管内，于4℃摇床孵育1.5小时后13000rpm、4℃离心15分钟，后吸取上清并分别于两组EP管内各加入225μL上清蛋白，一组加入5μL DMSO（药物溶剂，对照组），另一组加入5μL盐酸奎纳克林（药物终浓度为200μM，药物组），避光室温摇床孵育1.5h后将每组蛋白分为4管，（每管50μL），共8管药物溶液。使用1×TNC稀释链酶蛋白酶 Pronase，按照链酶蛋白酶 Pronase/上清蛋白质量为0、1:1600、1:800、1:400配制四种浓度的蛋白酶溶液两组，共8管蛋白酶溶液。然后将配制好的8管蛋白酶溶液分别加入对应的8管药物溶液的管内(-0、+0、-1:1600、+1:1600、-1:800、+1:800、-1:400、+1:400，-为对照组、+为药物组)，室温孵育10min，每管加入1μL cocktail，冰上孵育5min。按照蛋白：loading buffer为4:1比例加入loading buffer，水浴锅煮沸10min。按上述顺序加样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离、转膜。5%脱脂牛奶封闭1.5小时后，4度摇床FLAG抗体一抗孵育12小时后显色。
4）结果如图3所示，在转染了CUL4B全长结构域1-913的分组中，于130kDa左右显示出目的条带，可以明显看出奎纳克林保护了CUL4B蛋白不被蛋白酶水解，然而在转染了CUL4B蛋白1-813结构域质粒的分组中，奎纳克林失去了其对蛋白的保护效果，但在转染813-913蛋白结构域的分组中，40kDa左右的目的条带清晰显示目的蛋白明显被奎纳克林保护。证明奎纳克林与靶标蛋白CUL4B的结合主要集中在813-913段结构域。随后分别在1-913与813-913段结构域中将位于834位点的GAA谷氨酸点突变为AAG赖氨酸后的结构域质粒分组中，可以看到原本奎纳克林对靶蛋白的保护作用消失了，靶蛋白均可以被蛋白酶水解失活，该实验结合实施例2中的MOE-Dock实验可以证明奎纳克林可以与CUL4B蛋白结合，且二者的结合位点位于CUL4B蛋白的834位氨基酸处。表明奎纳克林可以与CUL4B结合并可能通过其发挥抑制TGF-β1／Smads 信号转导通路的作用。
上述操作为本领域常规技术操作，如可参考《药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）技术研究进展—一种定位药物靶标的方法》（李德军等，《中兽医医药杂质》，2021年40卷第2期）等。
实施例4
肺纤维化体内实验
实验材料：C57BL/6J小鼠，购自济南朋悦动物繁育有限公司；博来霉素，购自MedChemExpress；盐酸奎纳克林，购自MedChemExpress。
实验方法：6-8w的C57BL/6J小鼠，手术分离气管，使用微量注射器气管内注射博来霉素（2mg/Kg），术后第一天开始给小鼠灌喂盐酸奎纳克林，盐酸奎纳克林高浓度组为：25mg/kg（图中简称“高”）和盐酸奎纳克林低浓度组为：10mg/kg（图中简称“低”），4w后麻醉下脊椎脱臼处死小鼠，取小鼠肺组织。肺组织提取RNA，使用RT-PCR检测col1a1、FN1和ACTA2的表达量。肺组织制备石蜡切片，使用HE染色法、MASSON三色染色法观察肺脏结构及纤维瘢痕形成程度，使用免疫组化法检测col1a和αSMA表达量。
实验结果：提取肺组织使用Biocolor可溶胶原蛋白检测试剂盒（Sircol SolubleCollagen Assay）检测可溶性胶原的含量，结果如图4所示，发现奎纳克林治疗组显著减少了博来霉素所引起的肺组织胶原含量的表达。肺组织RT-PCR结果如图5所示，可见奎纳克林治疗组纤维化相关指标的mRNA表达水平相比于对照组均有显著下降；肺组织石蜡切片的HE染色、MASSON三色染色及免疫组化结果如图6所示，HE染色和MASSON三色染色可见相较于奎纳克林治疗组，对照组胶原沉积更为严重，单核细胞浸润明显，肺实质肺泡间隔增厚明显，免疫组化染色可见对照组比正常组αSMA和col1a的阳性表达增高，而奎纳克林显著降低了两个指标的阳性占比。
提取小鼠肺脏组织进行western blot检测，发现奎纳克林抑制了P-SMAD2/3蛋白的表达水平（图7），在免疫组化实验中（图8），奎纳克林同样显著抑制了P-SMAD2/3的表达，充分证明了奎纳克林可以通过抑制TGF-β1/Smads信号通路从而影响肺脏纤维化的发生发展。
上述操作为本领域常规技术操作，如可参考《Regulation of TransformingGrowth Factor-b1–driven Lung Fibrosis by Galectin-3》（Alison C. MacKinnon1,etc.《AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE》，VOL 185,2012）等。
实施例5
人成纤维细胞系HKF体外实验
实验材料：人成纤维细胞系HKF，购自上海传秋生物科技有限公司；TGF-β，购自PeproTech；盐酸奎纳克林，购自MedChemExpress。
实验方法：取对数生长期人成纤维细胞系HKF，接种到6孔板，置37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24h。待细胞长至70%融合度时，按分组情况，进行不同处理，奎那克林终浓度为1uM，TGFβ浓度为10ng/ml,置培养箱中继续培养，24小时后提取RNA，使用RT-PCR检测纤维化相关指标。
实验结果：HKF细胞系RT-PCR结果如图9所示，加入TGFβ刺激后纤维化指标上升，但在TGF刺激后加入奎那克林，指标则显著下降，且呈剂量依赖性，证明奎那克林可以治疗肺纤维化。
实施例6
实验方法：取对数生长期的人成纤维细胞系HKF，接种到6孔板中，置37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中，培养细胞长至70%融合度时，对照组给予DMSO，药物组给予盐酸奎纳克林（药物溶剂为DMSO，终浓度10ng/mL），每孔加入TGF-β（10 ng/mL）刺激细胞，按照加入TGF-β后的0min、15min、30min、60min提取细胞蛋白，使用碧云天公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0028）分别提取细胞核、细胞浆蛋白，通过Western Blot检测TGF-β通路的相关指标。
实验结果：如图10所示，相比于对照组，药物组的smad2/3主要积聚在浆蛋白中，奎纳克林明显抑制了核蛋白中smad2/3的表达，证明奎纳克林可以抑制Smad2/3磷酸化入核，从而抑制TGFβ1/Smads信号通路。
实施例7
CUL4B敲除验证实验
CRISPR-Cas9系统：CRISPR/Cas9是一种基因精确编辑技术，使用该技术能够进行细胞水平单基因或多基因敲除，其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA，gRNA)对目标DNA序列的PAM依赖性识别并在PAM区(5’-NGG)上游3bp的特定位点启动DNA切割。Cas9核酸内切酶生成的双链断裂可通过同源介导的修复（HDR，Homology directedrepair）或非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining）进行修复。NHEJ修复会在DSB位点随机引入碱基的插入或者缺失（Indel），如果这些Indel不是3的倍数就会导致后续的阅读框发生移码，这种移码往往会产生提前终止密码子（premature terminationcodon，PTC）,导致蛋白功能的丧失（提前翻译终止的多肽一般会被降解），实现基因敲除（KO，Loss of Function)。
使用CRISPR-Cas9系统敲除HKF细胞CUL4B编码基因，使用Western Blot验证CUL4B编码基因的敲除情况，结果如图11所示，CUL4B编码基因敲除后HKF细胞不再表达CUL4B，说明通过CRISPR-Cas9系统，成功在HKF细胞细胞系中实现CUL4B的敲除。
将CUL4B敲除细胞系（KO）、空转细胞系（KONC）两种稳转细胞系接种到6孔板中，37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养细胞长至70%-80%时，KONC组和KO组给予DMSO，KONC+奎纳克林和KO+奎纳克林组给予TGF-β1（药物溶剂为DMSO，药物终浓度10μM），置于培养箱中继续培养6h。Western Blot和RT-PCR验证敲除靶蛋白CUL4B编码基因后是否还能抑制Smad2/3的激活以及纤维化的发展。
Western Blot结果如图12所示，敲除CUL4B后，加入盐酸奎纳克林已不能抑制NIHHKF细胞中Smad2/3的磷酸化，说明敲除了CUL4B蛋白，盐酸奎纳克林对TGF-β1/Smads信号转导通路的抑制作用也随之消失，如图13所示，敲除CUL4B后，加入盐酸奎纳克林也无法抑制TGF-β1诱导的纤维化相关蛋白α-SMA的高表达，说明靶蛋白CUL4B被敲除后，盐酸奎纳克林抑制纤维化的作用亦被取消。
以上结果均证明盐酸奎纳克林是通过与CUL4B蛋白结合然后抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活从而具有治疗肺脏纤维化的作用。
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