阅读说明：本技术 生物活性寡糖的生产 (Production of bioactive oligosaccharides ) 是由 M·J·阿米促茨 D·派克 A·G·加勒莫 D·A·迈尔斯 J·B·格曼 C·B·莱布拉 于 2018-06-19 设计创作，主要内容包括：提供了产生寡糖的方法。(Methods of producing oligosaccharides are provided.)

具体实施方式

向特定寡糖基团的芬顿式引发(Fenton's Initiation Toward DefinedOligosaccharide Groups，FITDOG)是多糖受控降解成寡糖的方法。在一些实施方式中，粗多糖首先经历过氧化氢和过渡金属或碱土金属(例如硫酸铁(III))催化剂的引发氧化处理，使得糖苷键更不稳定。然后用NaOH或其他碱进行碱诱导性切割，得到各种寡糖。立即进行中和以减少剥落反应(peeling reaction)。该方法能够从各种碳水化合物来源产生大量生物活性寡糖。

如需要，可任选地用一种或多种多糖降解酶处理多糖，以减小多糖的平均大小或复杂度，然后用氧化性处理和金属催化剂处理得到的多糖。多糖酶的非限制性例子包括例如淀粉酶、异淀粉酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶或其组合。

初始氧化处理可包括过氧化氢和过渡金属或碱土金属。已测试不同氧化态、大小、周期元素表的族和配位数的金属以理解FITDOC过程的应用。在FITDOG反应中每种不同的金属显示活性。虽然这些金属对于任何多糖都可用，可用不同的金属产生具有优势聚合度的寡糖。氧化处理后用碱处理。该方法能够从具有不同程度分支和具有不同单糖组成的多糖，包括天然和改性多糖产生寡糖。该方法对任何来源的多糖有效。示范性多糖底物包括但不限于以下一种或多种：直链淀粉、胶淀粉、β-葡聚糖、支链淀粉、木葡聚糖、***半乳聚糖I和***半乳聚糖II、聚鼠李糖半乳糖醛酸I、聚鼠李糖半乳糖醛酸II、半乳聚糖、***聚糖、***木聚糖、木聚糖(例如山毛榉木木聚糖)、糖原、甘露聚糖、葡甘露聚糖、热凝多糖或菊糖。

在一些实施方式中，该方法产生的所得寡糖混合物可具有2-200，例如在2-100或3-20或5-50之间的平均聚合度。

该方法产生的所得寡糖混合物可具有多种用途。在一些实施方式中，可用寡糖混合物作为益菌元选择性刺激一种或多种益生菌的生长。在一些实施方式中，可施用寡糖组合物作为益菌元制剂(即不含细菌)或作为益生元制剂(即包含所需的细菌例如本文所述的双歧杆菌)。一般来说，可用人或动物可摄取的任何食物或饮料制备含益菌元和益生元寡糖的组合物的制剂。示范性食物包括半液体稠度的那些，其允许本文所述的益菌元和益生元组合物的简便和均匀的分散。然而，其他稠度(例如粉末、液体等)也可不受限制使用。因此，这些食品包括但不限于乳基制品，例如奶酪、乡村奶酪、酸奶和冰淇淋。加工水果和蔬菜，包括那些面向婴幼儿的，例如苹果酱或脱水豆和胡萝卜也适用于与本发明的寡糖联用。婴儿米粉例如基于大米或燕麦的米粉以及成人谷物例如Musilix(慕思里)也适合与寡糖联用。除了面向人消费的食物，也可用含益菌元和益生元寡糖的组合物补充动物饲料。

或者，含益菌元和益生元寡糖的组合物可用于补充饮料。这些饮料的例子包括但不限于婴儿制剂，较大婴儿制剂，幼儿饮料，奶，发酵乳，果汁，基于水果的饮料和运动饮料等。许多婴儿和幼儿制剂是本领域已知的，而且是商业可得的，包括例如Carnation GoodStart(雀巢营养子公司，Glendale，加州)和Mayfield乳业(Athens，田纳西州)生产的Nutrish A/B。婴儿或婴幼儿制剂的其他例子包括美国专利号5,902,617中公开的那些。组合物的其它有益制剂包括动物奶例如牛奶的补剂。

或者，含益菌元和益生元寡糖的组合物可配制成丸剂或片剂，或包封入胶囊，例如明胶胶囊。片剂形式可任选包括例如一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。扁囊剂或糖果形式可包括除了活性成分还含有本领域已知载体的有风味，例如蔗糖的组合物，以及在惰性基质中包含组合物的软锭剂，例如明胶和甘油或蔗糖和***胶乳液，凝胶等。含益菌元或益生元寡糖的制剂还可包含常规食物补充剂填充物和增量剂例如米粉。

在一些实施方式中，含益菌元或益生元寡糖的组合物还含有非人蛋白质，非人液体，非人碳水化合物，或其他非人组分。例如在一些实施方式中，组合物包含牛(或其他非人)奶蛋白，大豆蛋白，水稻蛋白，β-乳球蛋白，乳清，大豆油或淀粉。

含益菌元和益生元寡糖的组合物的剂量可根据个体需求变化，并将考虑诸如年龄(婴儿相对于成人)、体重、丧失肠道有益菌的原因(例如抗生素治疗、化疗、疾病或年龄)等因素。根据本说明书，施给个体的量应足以在肠道中随时间建立有益细菌集落。剂量大小也可由伴随包含益菌元或益生元寡糖的组合物给予的任何不良副作用的存在、性质和程度来决定。在一些实施方式中，剂量范围作为食物补剂是有效的，用于在肠道内重建有益细菌。在一些实施方式中，本发明寡糖组合物的剂量范围是约1微克/L到约25克/L的寡糖。在一些实施方式中，本发明的寡糖组合物的剂量范围是约100微克/L到约15克/L的寡糖。在一些实施方式中，本发明的寡糖组合物的剂量范围是约1克/L到约10克/L的寡糖。示范性的双歧杆菌剂量包括但不限于每剂约10⁴到10¹²集落形成单位(CFU)。另一个有利剂量是约10⁶到10¹⁰CFU。

可对任何需要的个体施用含益菌元或益生元寡糖的制剂。在一些实施方式中，个体是婴儿或幼儿。例如在一些实施方式中，个体小于例如3个月、6个月、9个月、1岁、2岁或3岁。在一些实施方式中，个体在3-18岁之间。在一些实施方式中，个体是成人(例如18岁或更大)。在一些实施方式中，个体超过50、55、60、65、70或75岁。在一些实施方式中，个体具有免疫缺陷(例如患有AIDS或进行化疗的个体)。

可用于本发明的益生元组合物的示范性双歧杆菌包括但不限于：长双歧杆菌亚种婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)、长双歧杆菌亚种长双歧杆菌(B.longum subsp.Longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)。所用的双歧杆菌部分取决于目标消费者。

应理解对于一些应用，在本文所述的制剂中包括其他双歧因子是有利的。这些额外的成分可包括但不限于低聚果糖，例如Raftilose(Rhone-Poulenc公司,Cranbury,新泽西州)、菊糖(Imperial Holly公司，Sugar Land,德克萨斯州)和Nutraflora(GoldenTechnologies公司,Westminister,科罗拉多州)，以及乳糖、低聚木糖、大豆寡糖、乳果糖/乳糖醇和低聚半乳糖等。在一些应用中，可在制剂中包括其他有益细菌例如乳酸杆菌(Lactobacillus)、瘤胃球菌(Rumminococcus)、艾克曼菌(Akkermansia)、拟杆菌(Bacteroides)、粪杆菌(Faecalibacterium)。

本文所述的寡糖可用刺激任何种类的微生物。可由寡糖刺激的微生物的例子包括如土壤微生物(例如菌根真菌和细菌以及用作土壤接种物的微生物，例如固氮螺菌属(Azosprillum sp.))，口腔细菌(例如变异链球菌(Streptococcus mutans)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)、血链球菌(Streptococcus sanguis)和口腔链球菌(S.oralis))和皮肤细菌(例如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes))和氨氧化细菌，包括但不限于亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)，亚硝化球菌(Nitrosococcus)，亚硝化螺旋菌(Nitrosospira)，亚硝化胞菌(Nitrosocvstis)，亚硝化叶菌(Nitrosolobus)和亚硝化弧菌。

在一些实施方式中，对需要的人或动物施用寡糖组合物。例如，在一些实施方式中，将寡糖组合物施给具有至少一种以下症状的人或动物：炎症性肠病综合征、便秘、腹泻、结肠炎、克罗恩氏病、结肠癌、功能性肠道障碍(FBD)、肠易激综合征(IBS)、过量硫酸还原细菌、炎症性肠病(IBD)和溃疡性结肠炎。肠易激综合征(IBS)的特征是腹痛和不适、胀气、和肠道功能改变、便秘和/或腹泻。有三种IBS：便秘型IBS(C-IBS)、交替IBS(A-IBS)和腹泻型IBS(D-IBS)。寡糖组合物对于例如抑制或延长溃疡病人的复发周期是有用的。可施用寡糖组合物来治疗或预防任何形式的功能性肠病，特别是肠易激综合征(IBS)，例如便秘型IBS(C-IBS)、交替型IBS(A-IBS)和腹泻型IBS(D-IBS)；功能性便秘和功能性腹泻。FBD是一些慢性或半慢性胃肠道疾病的总称，其结合有肠痛，肠功能紊乱和社交混乱。

在其他实施方式中，寡糖组合物施给需要刺激免疫系统的对象和/或用于促进对细菌或酵母(例如念珠菌病(Candidiasis))感染或硫酸还原菌诱导的疾病的抗性。

实施例

实施例1

从多糖通过解聚建立寡糖的能力是一诱人的解决方案。目前多糖有两种解聚方式，酸水解和用糖基水解酶酶处理。两种技术都有其自身的缺点，酸水解意味着产生大量单糖和非常少量的寡糖。另一方面，酶处理能够产生大量寡糖，但每种糖基水解酶仅能依赖于连接位置、立体化学和周围环境的单糖排列在非常特异的位点进行切割。这意味着即使能够解聚特定多糖的酶是已知和可得的，它也不能大规模降解天然产品中存在的结构多变的多糖。

虽然报道了纤维素和含酸多糖的解聚，但仍然需要一种能用芬顿系统有效解聚中性多糖的方法。另外，还没有报道过用芬顿系统从粗天然产品以高产率制备大量寡糖。下面的实施例的目的是显示芬顿式引发寡糖基团解离(FITDOG)的分析和制备规模的方法以及应用从多糖分离物和天然产品高产率产生寡糖。

方法

材料

从当地超市获得食品。乙酸钠、过氧化氢(30％w/w)、氢氧化钠、五水硫酸铁(III)和冰醋酸都购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。

小规模的芬顿式引发寡糖基团解离(FITDOG)

制备了含有95％(v/v)乙酸钠缓冲液(用冰醋酸调至pH5)、5％(v/v)过氧化氢(30％w/w)和65nM硫酸铁(III)的溶液。将该混合物涡旋并加到干的多糖标准品，以实现最终溶液为1mg/ml。反应在100℃孵育20分钟。反应后，加入一半反应体积的冷2M NaOH，涡旋，然后加入0.6％最初反应体积的浓乙酸用于中和。

小规模FITDOG产生的寡糖的纯化

用无孔石墨化碳筒(GCC-SPE)分离寡糖。用溶于0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)和纳米纯水的80％乙腈洗涤筒。装载寡糖，用5个柱体积的纳米纯水洗涤。用含0.05％(v/v)TFA的40％乙腈洗脱寡糖。

大规模的芬顿式引发寡糖基团解离(FITDOG)

冻干食品至完全干燥，用KRUPS F203研磨机(Millville,NJ)磨成细粉。将用冰醋酸调至pH5的40mM乙酸钠缓冲液的950ml溶液在装有冷水柱冷凝器的2升圆底烧瓶中煮沸。在烧瓶中加入1.0g磨碎冻干的食品、32mg硫酸铁(III)和50ml30％(w/w)过氧化氢水溶液。搅棒搅拌使溶液反应20分钟。为了诱导切割，加入500ml冰冷2M NaOH，搅拌30秒，然后加入61.5ml冰冷冰醋酸中和反应。

大规模FITDOG产生的寡糖的纯化

滤过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜除去絮结的铁。对于CombiFlash Rf200(Teledyne Isco)快速液相层析，使用自包装的50g多孔石墨化碳(PGC)快速液相层析(Flash-LC)柱。以7ml/分钟对柱加样。使用二相溶剂系统，其由以下组成A:纳米纯水，和B：乙腈(HPLC级)。用100％溶剂A以10ml/分钟洗涤样品20分钟，然后开始用溶剂B梯度(0％到80％)洗涤140分钟，然后在80％溶剂B等度维持20分钟。将洗脱液直接导至废料，除了将40-100分钟时的洗脱液收集入玻璃瓶。在旋转蒸发器上干燥收集的洗脱液1小时，除去乙腈。剩余的液体在冻干机上蒸发。

基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)的分析

样品在纳米纯水中重建。将1μl样品直接铺在不锈钢MALDI盘中。在其中加入0.3μl0.01M NaCl和0.7μl 25mg/ml 2,5-二羟基苯甲酸，并用吸管头混合。然后真空干燥样品。样品在Bruker UltraFlextreme MALDI-TOF/TOF仪上跑样。以阳性模式操作仪器，使用95％最大激光功率。

芯片-HPLC-纳米/四极飞行时间质谱(芯片-HPLC-纳米/Q-TOFMS)分析

在纳米纯水中重建样品，然后用芯片-HPLC-纳米/Q-TOF MS分析。系统包括两个泵：一个毛细管泵用于上样，和一个纳米泵，用于分析分离。在该系统中，一台Agilent 1200系列HPLC和Agilent 6520Q-TOF质谱仪通过芯片数据集接口(chip cube interface)偶联。芯片含有40nl富集柱和75μm×43mm的分析柱，两根柱都用PGC装填。用3％(v/v)乙腈/水+0.1％甲酸以4μl/分钟的流速装样。色谱分离用以下的二相梯度进行：溶剂A：(3％(v/v)乙腈/水+0.1甲酸)和溶剂B:(90％乙腈/水+0.1％甲酸)，流速为0.4μl/分钟。梯度运行60分钟：1％B到5％B运行2分钟，然后5％到30％运行33分钟，然后30％到99％运行5分钟，然后在99％维持10分钟，然后从99％到1％运行1分钟，然后在1％维持9分钟，再进行下一次跑样。

以阳性模式收集数据，并在m/z 118.086到2721.895范围内以内部校准离子校准。干燥气体设定为325℃，流速为5l/分钟。片段、分离器和Octapole 1RF电压分别设定为175、60和750伏。以0.63光谱/秒进行片段化。碰撞能量基于化合物质量，表达成(碰撞能量)＝1.8*(m/z)-2.4。

单糖组成

对干燥的胡桃南瓜和FITDOG寡糖如下进行单糖组成测试。简单说，用138μl纳米纯水重建10mg样品。加入大约100mg 1.4mm的不锈钢珠，在Next Advance Storm 24子弹混合器(Averill Park,NY)中剧烈撞击融解样品，并在100℃煮1小时。接着，加入68μl浓TFA形成4M溶液，100℃孵育2小时。为了淬灭反应，加入800μl冰冷的纳米纯水，将溶液稀释1000倍。真空干燥50μl稀释的溶液。然后用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮衍生干燥的样品，并干燥。然后在纳米纯水中重建样品，用氯仿提取两次，将水层用于分析。将样品注射入配有Agilent 6495QqQ MS的Agilent 1290Infinity II UHPLC。在Agilent Zorbax EclipsePlus C18柱(2.1mm×150mm内径,1.8μm粒径)上进行分离。溶剂系统由以下组成：A:25mM乙酸铵，使用NH₄OH的5％乙腈/水溶液调节到pH 8.2。遵循所有其他的仪器参数。

细菌摄取

筛选几种细菌，大部分为双歧杆菌菌株的代谢FITDOG寡糖库的能力。为了实现该目的，在对数期晚期收集纯培养物，用于接种基础MRS，其含有下列不同的碳源：2％葡萄糖(阳性对照)，2％和5％w/v的胡桃南瓜寡糖(BSL)以及无碳源(阴性对照)。培养物在37C厌氧条件下孵育96小时，用Biotek读板计EON 120928C型(Biotek Instruments公司,Winooski,VT,USA)每30分钟监测其生长。振摇30秒后，在600nM测定吸光度，以监测生长。

结果

FITDOG反应条件的优化

在各种条件下用商业木聚糖(多糖)标准优化芬顿反应。用分析级FITDOG法依次优化硫酸铁(III)和过氧化氢的浓度、反应时间、温度、反应pH和淬灭NaOH浓度。用MALDI-TOFMS监测寡糖产物。用MS丰度直接获得相对寡糖浓度。用MALDI TOF-MS谱(图1)获得各产物的相对丰度。

1.Fe₂(SO₄)₃浓度的优化

浓度从0.0065nM到65nM变化，以优化硫酸铁(III)。小于0.65nM时未观察到寡糖丰度。图2显示随浓度提高了总体OS丰度。在约10nM Fe₂(SO₄)₃浓度时，信号达到最大，在65nM稍有增加。因此，用后者浓度进行制备。

2.缓冲液pH的优化

用乙酸钠缓冲液，加入对应于pH 2-12、以1pH单位递增的适当量的酸和碱(乙酸和NaOH(水溶液))优化pH条件。小于5的pH不产生可观察的量。pH5得到寡糖最大丰度，而超过6得到的丰度又非常小(图3)。因此我们选择pH5为最佳值。

3.过氧化氢和NaOH浓度。

该方法的一个重要特征是使用碱性NaOH溶液终止反应。这一步对于产生丰富的寡糖产物是关键的。为了优化条件，通过改变NaOH浓度、H₂O₂浓度和寡糖丰度使用全因素设计。NaOH的浓度为0、0.1、1.0、2.0和3.0M。H₂O₂的浓度是0.02、0.12、0.24和0.48M的过氧化氢。当没有NaOH加入时(0.0M,图4)，在反应混合物中几乎没有或没有可检测的寡糖。类似的，当H₂O₂浓度低于0.02M时，也观察不到可检测的寡糖。当在溶液中没有加入H₂O₂，则没有可检测的寡糖信号。基于该研究，我们发现2.0M NaOH和0.12M H₂O₂能良好运行。

4.反应时间和温度

也用全因素设计分析时间和温度。检测了0、20、40、60和120分钟的时间点。使用25、50、75和100℃的温度。在75℃以下观察到最小寡糖信号。在100℃观察到最大丰度，反应时间为20分钟。(图5)。

5.其他过渡金属的效果

已显示芬顿型反应可用含Fe(III)、Fe(II)和Cu(II)的化合物进行。使硫酸铁(III)、硫酸亚铁(II)和氯化铜(II)与绿豌豆在先前优化的条件下反应。全部三种过渡金属产生寡糖(图6)。氯化铜(II)产生高丰度的长3-7个己糖的寡糖，而Hex4是丰度最高的寡糖。硫酸亚铁(II)也产生长3-7个己糖的寡糖，但丰度比起氯化铜(II)样品要低10倍。硫酸铁(III)产生长度为3-10个己糖的寡糖，丰度与氯化铜(II)相当或更高。该样品还产生了几种己糖异构体，包括三种Hex3异构体和两种Hex4异构体。我们从该数据发现不同的过渡金属和氧化态可从多糖产生寡糖。我们还发现不同的过渡金属可产生不同的寡糖分布，提示每种金属具有不同的特异性。

芬顿反应在食物多糖上的应用

用FITDOG处理粟、鹰嘴豆和香蕉皮，以显示不同的起始多糖产生的寡糖类型。图7显示的是用先前所述的方法测定的单糖组成。葡萄糖在所有食品中是最丰富的组分，然而对于香蕉皮，木糖和果糖更加丰富。对于鹰嘴豆，***糖和半乳糖的丰度更高。粟主要含葡萄糖(95.17％)(图7)。这表明从FITDOG释放的己糖寡糖是由葡萄糖组成的。

液相色谱-质谱色谱总结了三种多糖的结果(图8)。表1列出了峰及其寡糖组成。每个色谱图获得因其各自单糖组成不同而不同的峰。

香蕉皮(上图)主要获得短寡聚物，包括三种Hex3异构体(己糖三糖A、B和S)。Hex或己糖可以是葡萄糖或果糖，但更可能是葡萄糖。最丰富的寡糖对应于Hex5(J)。还观察到Hex4异构体(F和H)。发现鹰嘴豆具有Hex2HexA1类别(D),HexA对应于己糖醛酸。观察到其他丰富的化合物Hex4(C,E,G)、Hex5(I)、Hex6(K)、和Hex7(N和P)。粟(下图)得到Hex4(C、E和G)，低丰度Hex3。存在Hex5，对应于最大丰度的I，而K对应于Hex6。在L中观察到混合组合，其由Hex5PentA1组成，其中PentA代表戊糖醛酸。

胡桃南瓜寡糖的益菌元活性

检测了来自各种食物多糖FITDOG的几种寡糖的益菌元活性。以来自胡桃南瓜的寡糖为例。寡糖的概况与上面获得的相似。在这个例子中，假链状双歧杆菌MP80在芬顿氧化胡桃南瓜产生的寡糖上生长。与其他测试的菌株相反，假链状双歧杆菌MP80在胡桃南瓜寡糖2％和5％溶液上都能够生长。生长最终在5％溶液中达到最大OD 0.962。胡桃南瓜寡糖中的生长显著比阴性对照(最大OD 0.378)要高，但比阳性对照低(图9)。由于其他测试的菌株没有在胡桃南瓜寡糖上生长，该结果显示这些寡糖选择性地使某些细菌生长。

表1：对几种食物的FITDOG处理发现的丰度最高的化合物文库“X”代表发现化合物的食物。

实施例2

下文结果显示FITDOG法在多糖的复杂混合物和纯多糖上的利用。多糖的复杂混合物包括胡桃南瓜(注意产生3-200的寡糖(图29))。该方法可用于酵母细胞壁(图28)。该方法也可用于纯化的多糖包括：木聚糖、黑麦***木聚糖、地衣聚糖、半乳甘露聚糖、胶淀粉、直链淀粉、聚鼠李糖半乳糖醛酸I、木葡聚糖、热凝多糖、半乳聚糖、甘露聚糖、葡萄糖甘露聚糖、落叶松***葡聚糖、聚半乳糖醛酸、菊糖(图10-24和27)。

不同的金属被用于FITDOG法。它们包括Fe、Ni、Ca、Cu和Mg。它们产生具有不同DP分布的寡糖(图25-26)。

材料：

木聚糖、黑麦***木聚糖、地衣聚糖、半乳甘露聚糖、直链淀粉、聚鼠李糖半乳糖醛酸I、木葡聚糖、热凝多糖、半乳聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、落叶松***半乳聚糖、聚半乳糖醛酸和菊糖购自Megazyme(UK)。胶淀粉购自西格玛-奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。

乙酸钠、过氧化氢(30％w/w)、氢氧化钠、五水硫酸铁(III)、七水硫酸亚铁(II)、七水硫酸铜(II)、氯化亚铜(I)、硫酸锰(II)、七水硫酸钴(II)、硫酸镁、氯化钙、氯化镍(II)和冰醋酸都购自西格玛-奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。

方法：

寡糖生产

制备了含有95％(v/v)乙酸钠缓冲液(用冰醋酸调至pH5)、5％(v/v)过氧化氢(30％w/w)和65nM要研究的金属络合物的溶液。涡旋该混合物，加到干的多糖标准品，以实现最终溶液为1mg/ml。反应在100℃孵育60分钟。反应后，加入一半反应体积的冷2M NaOH，涡旋，然后加入0.6％最初反应体积的冰醋酸用于中和。

寡糖纯化

用无孔石墨化碳芯(GCC-SPE)分离寡糖。用溶于0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)和纳米纯水的80％乙腈洗涤筒。装载寡糖，用5个柱体积的纳米纯水洗涤。用含0.05％(v/v)TFA的40％乙腈洗脱寡糖。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。