阅读说明：本技术 大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用 (Application of chrysophanol in preparing medicine for treating acute lung injury ) 是由 李荣鹏 蒋杰邦 谭时锐 布会敏 董国凯 蒋继宏 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。本发明中大黄酚对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型显示出良好的治疗作用,可有效调控NF-κB和NLRP3信号通路,证实了大黄酚对于急性肺损伤具备显著的抗炎作用,并能有效促进急性肺损伤中后期的肺损伤修复,因此该大黄酚可用于制备治疗急性肺损伤的药物。本发明为急性肺损伤的治疗提供了一种新途径。(The invention discloses an application of chrysophanol in preparing a medicament for treating acute lung injury. The chrysophanol shows good therapeutic action on a lipopolysaccharide-induced acute lung injury mouse model, can effectively regulate and control NF-kB and NLRP3 signal paths, proves that the chrysophanol has obvious anti-inflammatory action on acute lung injury and can effectively promote the repair of the lung injury in the middle and later stages of acute lung injury, so the chrysophanol can be used for preparing the medicine for treating the acute lung injury. The invention provides a new way for treating acute lung injury.)

大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种大黄酚的应用，具体涉及一种大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。

背景技术

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种严重的呼吸系统疾病，其发病迅速，病死率较高可达40％以上，严重的威胁着人类健康。多种因素均可以导致急性肺损伤的发生，如细菌感染、外伤、休克、急性胰腺炎、败血症、误吸等。急性肺损伤的发病机制尚不清楚，目前认为可能由以下两个方面的原因引起：1、致病因素对肺细胞的直接损伤，例如肺部感染、肺挫伤、溺水、有毒物质吸入等；2、各种原因导致的急性全身炎症反应的间接结果，例如脓毒血症、急性胰腺炎、肺部以外的严重损伤、休克等。目前尚未有效果显著的治疗急性肺损伤的药物，因此寻找一种安全、高效的治疗ALI的药物显得迫在眉睫。

急性肺损伤的特征之一是患者血液中含有大量的内毒素，主要以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为主。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁表面的主要毒力因子。已经报道研究表明巨噬细胞触LPS后可引起炎症反应。LPS被广泛用于诱导动物的急性炎症模型，用于候选抗炎药物的临床前评估。

大黄酚是一种蒽醌类化合物，学名：1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌(1,8-Dihydroxy-3-methylanthraquinone，CAS号：481-74-3)，英文名Chrysophanol，对多种细菌有抗菌作用，能止咳、促进肠管运动、促使神经兴奋和肌肉麻痹，还有抗凝血和利尿作用，在临床药学已占有重要地位。目前该类化合物对急性肺损伤的药理学研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用，为治疗急性肺损伤提供一种新的途径。

为实现上述目的，本发明提供大黄酚在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。

本发明经动物实验验证，HE染色显示与LPS组相比较，LPS+Chr组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性介质渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少；说明大黄酚治疗后显示肺组织病理学损伤得到了明显改善，这些作用呈现剂量依赖性。

对BALF中TNF-α、IL-1β含量检测发现，大黄酚显著降低炎性细胞因子的(TNF-α和IL-1β)水平。

Western blot分析结果显示，大黄酚治疗后，炎症下游NF-κB信号通路中IκBα和p65蛋白的磷酸化水平降低，NLRP3信号通路中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平降低，TXNIP蛋白表达量显著增加，TXNIP和NLRP3之间的相互作用显著增强，且呈剂量依赖性。

综合以上结果表明，所述大黄酚具有对急性肺损伤小鼠肺组织NF-κB和NLRP3信号通路的调控功能。

本发明还提供一种用于治疗急性肺损伤的药物组合物，含有有效治疗剂量的活性成分大黄酚以及药学上可接受的载体。

按本领域常用的制药工艺，所述药物组合物可以被制成任何一种药学上可接受的剂型。优选的，所述任何一种药学上可接受的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明实验结果揭示：大黄酚能够降低肺组织的MPO含量、湿/干重比、BALF中TNF-α和IL-1β含量、BALF中炎症细胞的数量、NF-κB信号通路中IκBα和p65蛋白的磷酸化水平以及NLRP3信号通路中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量，表明大黄酚具有降低肺毛细血管通透性、减轻肺水肿、肺炎症反应和急性肺损伤病理学病变的作用，能作为防治急性肺损伤的有效药物。

附图说明

图1为Chr对LPS诱导的小鼠肺组织病理学改变的影响(A：正常对照组；B：LPS组；C：LPS+Chr低剂量组；D：LPS+Chr中剂量组；E：LPS+Chr高剂量组)；

图2为Chr对MPO活性的影响；

图3为Chr对小鼠肺的干湿比的影响；

图4为Chr对LPS诱导的小鼠BALF中TNF-α和IL-1β的影响(其中，A：TNF-α；B：IL-1β)；

图5为Chr对LPS诱导的小鼠BALF中炎性细胞的影响(其中，A：总细胞；B：中性粒细胞；C：巨噬细胞)；

图6为Chr抑制LPS诱导的NF-κB活化(其中，A：通过westen blot验证NF-κB信号通路中关键蛋白；B：p-p65的表达变化；C：p-IKB的表达变化)；

图7为Chr对NLRP3表达的影响；

图8为Chr对TXNIP表达以及TXNIP与NLRP3相互作用的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。其中，大黄酚的获取方式可选但不限于：化学分离或合成或者从商业途径购买。

实施例1大黄酚对ALI小鼠的炎性抑制作用

1、实验动物

C57BL/6健康雄性小鼠，体重18～22g，SPF级，由南京大学生命科学院动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。

2、主要试剂

大黄酚、脂多糖：购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MI)；

MPO检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；

TNF-α、IL-1β的ELISA检测试剂盒：Biolegend(San Diego,CA)

NF-κB、NLRP3抗体：Cell Signaling Technology Inc.(Beverly,MA)

3、数据处理

采用SPSS18.0分析统计软件，实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较采用Dunnet t检验，实验组之间两两比较采用q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

4、C57BL/6小鼠ALI模型的建立、分组和给药

适应性喂养一周后，将60只C57BL/6小鼠随机分成五组，每组12只，分别是：正常对照组、LPS组、LPS+Chr低剂量组、LPS+Chr中剂量组、LPS+Chr高剂量组。其中，LPS组：鼻腔滴注LPS(10μg LPS溶解在50μl PBS溶液中)，LPS+Chr低剂量组：在鼻腔滴注LPS一小时前，腹腔注射大黄酚(5，10，15mg/kg)。小鼠经过LPS血管灌注12小时后，采集小鼠的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid，BALF)和肺组织。

5、H&E染色

取小鼠肺组织，放入10％甲醛溶液中固定48h后，进行脱水、透明和石蜡包埋并作5μm厚切片，然后进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织的病理形态改变。

6、ELISA(酶联免疫吸附测定)

小鼠经过LPS鼻腔滴注12小时后，采集小鼠支气管肺泡灌洗液。使用ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液中的炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的含量，操作严格按试剂盒说明书方法进行。

7、MPO(肝组织髓过氧化物酶)活性

小鼠经过LPS血管灌注12小时后，采集肺组织切片。使用MPO检测试剂盒检测肺组织的MPO活性，操作严格按试剂盒说明书方法进行。

8、小鼠的肺湿/干重比

取小鼠的左叶肺组织并称湿重，称重后将左叶肺组织置于60℃烘箱中干燥72h，冷却至室温后取出并称干重，最后根据公式：肺的湿重/肺的干重，得到肺湿/干比。

9、Western blot检测

用具有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解物分离总细胞蛋白，蛋白质浓度按照BCA试剂盒说明书的指导进行测定，在12％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离约50μg蛋白质，电转移到PVDF膜上，在5％脱脂奶粉中封闭2h，膜与一抗在4℃条件下孵育过夜。以TBST常温下清洗三次，清洗时，TBST加入量为300uL，要求覆盖整个反应孔，与二抗一起孵化2h。显色试剂，按1:1配制。清洗后，加入配制好的显色试剂50uL，显色3分钟后，利用Quantity One软件分析结果。

10、检测结果

(1)大黄酚能够减轻LPS引起的肺组织病理学改变

如图1所示，光镜下正常对照组小鼠肺组织结构正常，肺泡结构完整、间隔无水肿，无明显中性粒细胞浸润(图1A)，LPS组造模后12h肺组织结构出现破坏，肺泡腔有大量渗出物、炎性细胞浸润、毛细血管扩散性膨胀(图1B)，LPS+Chr低剂量组、LPS+Chr中剂量组、LPS+Chr高剂量组的肺泡结构破坏、炎性细胞浸润、毛细血管扩散性膨胀等病理损伤均较LPS组减轻，且呈剂量增加而递减(图1C-E)。

(2)大黄酚能够抑制LPS引起的肺组织MPO活性

MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒中的酶之一，与急性炎症的严重程度呈正相关。如图2所示，与正常对照组相比，本发明LPS+Chr组MPO活性均较LPS组明显下降，且呈剂量增加而递减，表明大黄酚可减轻肺组织中性粒细胞浸润的急性炎症反应。

(3)大黄酚能够抑制LPS引起的肺湿/干重比

肺湿/干重比能够反应肺水肿的程度。如图3所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的肺湿/干重比显著增加，LPS+Chr组肺湿/干重比均较LPS组下降，且呈剂量增加而递减。

(4)大黄酚能够降低BALF中的炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的含量

在炎症发生过程中，释放大量促炎因子，特别是TNF-α和IL-1β为其中的关键因子，促进机体内环境中炎性因子反应的发生。TNF-α作为细胞因子网络中启动递质，主要由激活的单核巨噬细胞产生，可诱导多种细胞炎症因子产生，细胞因子之间形成网络，扩大炎症连锁反应造成肠粘膜损伤，参与炎症反应和免疫应答。IL-1β被公认为是介导结肠炎发病的细胞因子之一，其可通过激活T、B细胞，促进中性粒细胞浸润，促进IL-2受体表达和其他细胞因子协同作用，促使中性粒细胞和巨噬细胞活化和脱颗粒，同时促进炎症细胞释放***素、血栓素、血小板活化因子等，从而增加上皮细胞和内皮细胞的通透性。如图4所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的TNF-α和IL-1β含量显著增加，LPS+Chr组TNF-α和IL-1β含量均较LPS组下降，且呈剂量依赖性。说明大黄酚可以降低LPS引起的炎症因子TNF-α和IL-1β释放，降低LPS引起的小鼠肺组织炎症反应。

(5)大黄酚能够降低BALF中的炎症细胞数量

本发明测试了BALF中的炎症细胞的数量，包括中性粒细胞和巨噬细胞。如图5所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量均显著增加，LPS+Chr组总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量均较LPS组下降，且呈剂量增加而递减。

(6)大黄酚对LPS引起的NF-κB活性的影响

通过Western blot分析炎症下游NF-κB信号通路中IκBα和p65蛋白的磷酸化水平。如图6所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的IκBα、p65蛋白的磷酸化水平均显著增加，LPS+Chr组的IκBα、p65蛋白的磷酸化水平均较LPS组下降，且呈剂量增加而递减。

(7)大黄酚对NLRP3基因表达的影响

通过Western blot分析NLRP3信号通路中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平。如图7所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白表达量均显著增加，LPS+Chr组的NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白表达量均较LPS组下降，且呈剂量增加而递减。

(8)大黄酚对TXNIP(硫氧还原蛋白相互作用蛋白)表达的影响以及TXNIP和NLRP3之间的相互作用

TXNIP是NLRP3信号通路的上游分子。通过Western blot分析TXNIP和NLRP3之间的相互作用。如图8所示，结果表明与正常对照组相比，LPS组的TXNIP蛋白表达量增加，TXNIP和NLRP3之间的相互作用增强。而LPS+Chr组的TXNIP蛋白表达量显著增加，TXNIP和NLRP3之间的相互作用显著增强。