维替泊芬在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的用途
阅读说明：本技术 维替泊芬在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的用途 (Application of verteporfin in preparation of medicine for resisting novel coronavirus SARS-CoV-2 ) 是由 谢幼华 谷陈建 郭慧敏 吴旸 瞿涤 袁正宏 张�荣 王玉燕 朱园飞 徐巍 于 2020-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及维替泊芬新的药用用途,具体涉及维替泊芬在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的用途。本发明经实验证实,维替泊芬通过对体外细胞培养Vero-E6(非洲绿猴肾细胞)进行干预,能有效抑制新型冠状病毒的感染,所述的维替泊芬可进一步制备治疗新型冠状病毒引起的新型冠状病毒病,为治疗和控制新型冠状病毒病提供新的药物。(The invention belongs to the technical field of medicines, relates to a new medicinal application of verteporfin, and particularly relates to an application of verteporfin in preparation of a medicine for resisting novel coronavirus SARS-CoV-2. Experiments prove that the verteporfin can effectively inhibit the infection of the novel coronavirus by intervening in vitro cell culture Vero-E6 (African green monkey kidney cells), and the verteporfin can be further used for preparing a novel coronavirus disease caused by the novel coronavirus disease and provides a novel medicine for treating and controlling the novel coronavirus disease.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及维替泊芬新的药用用途，具体涉及维替泊芬在制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的用途。
背景技术
新型冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，又称为新型冠状病毒肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。该病感染性强，致死率高。引起新型冠状病毒病的病原体是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。SARS-CoV-2和已知的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于冠状病毒科的β冠状病毒属。
临床实践显示，人感染了SARS-CoV-2后常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于SARS-CoV-2所致疾病没有特异治疗方法。有研究表明瑞德西韦和羟氯喹在体外研究中对SARS-CoV-2的复制有明显的抑制效果。但临床研究发现，羟氯喹没有明显的治疗效果。而瑞德西韦曾有治愈1个病例的报道，另外，瑞德西韦在同情用药情况下治疗53例重症患者的试验结果显示，68％的重症患者在使用瑞德西韦后症状有所缓解，但死亡率仍有13％，且60％的患者报告了副作用。瑞德西韦的上述研究病例少，且来自同情用药的数据存在很大的局限性。
有研究显示新型冠状病毒可在Vero-E6细胞株中复制，导致明显的合胞体、细胞脱落等细胞病变效应(CPE)，是通用的新型冠状病毒细胞感染模型，用于新型冠状病毒的分离、培养和药效学测定。
维替泊芬，中文别名：微替泊芬，英文名称：Verteporfin。维替泊芬为第二代卟啉类光敏剂，可被光(波长689nm)照射激活，可用于光动力学疗法治疗黄斑退化。研究显示，该药物可选择性地进入病变的血管，通过非热能的激光照射，产生活性氧而闭塞病变血管，从而终止血管的渗漏，保存视力。维替泊芬适用于继发与年龄相关的眼部新生血管形成的患者，以及病理性近视或眼组织胞浆菌病。迄今，尚未见维替泊芬在抑制冠状病毒特别是新型冠状病毒感染和复制中的应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，为解决目前亟需有效的抗SARS-CoV-2药物的问题，提供维替泊芬新的药用用途，具体涉及维替泊芬在制备抗新型冠状病毒 SARS-CoV-2药物中的用途。
本发明通过体外实验评价了维替泊芬抗SARS-CoV-2的活性；所述体外实验主要包括维替泊芬抑制SARS-CoV-2感染的测定、药物的细胞毒性的测定等，提供了维替泊芬在抗SARS-CoV-2药物中的新用途，所述的维替泊芬可制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
本发明的目的通过下述技术方案施现：
本发明提供了维替泊芬抗SARS-CoV-2的新用途。
进一步，本发明提供了一种包含维替泊芬的抗新型冠状病毒药物。
本发明进行了抗SARS-CoV-2药物筛选，结果显示，已知化学物质“维替泊芬”对SARS-CoV-2在Vero-E6细胞上的感染有明显抑制作用，进一步通过体外实验评价了维替泊芬抗SARS-CoV-2的活性；所述体外实验主要包括维替泊芬抑制SARS-CoV-2感染的测定、药物的细胞毒性的测定等，结果表明，所述维替泊芬可用于制备抗SARS-CoV-2药物和治疗SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒病。新型冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，又称为新型冠状病毒肺炎。
本发明所述的维替泊芬，其英文名称为Verteporfin，分子式为C82H84N8O16，其分子结构如式1所示。
本发明的一个实施例中提供了维替泊芬在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用。
在本发明的另一个优选实施例中，维替泊芬用于制备抗SARS-CoV-2药物和治疗因抗 SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒病药物。
本发明采用维替泊芬通过对体外细胞培养Vero-E6(非洲绿猴肾细胞)进行干预，实验结果证实，维替泊芬能有效抑制新型冠状病毒的感染，所述的维替泊芬可制备治疗新型冠状病毒引起的新型冠状病毒病。
进一步，本发明提供了以维替泊芬为药物前体的其他抗新冠病毒病的新药，以及维替泊芬与药学上可接受载体的组合物等。
本发明具有以下有益效果：
本发明经实验表明，维替泊芬在体外培养的Vero-E6(非洲绿猴肾细胞)上能有效抑制SARS-CoV-2的感染，提供了维替泊芬作为抗SARS-CoV-2药物的新用途，为治疗和控制新型冠状病毒病提供新的药物。
附图说明
图1为通过细胞病变(CPE)观察不同浓度的维替泊芬对SARS-CoV-2在Vero-E6细胞上的感染的抑制的实验结果。
图2为通过间接免疫荧光实验观察不同浓度的维替泊芬对SARS-CoV-2在Vero-E6细胞上的感染的抑制的实验结果。
图3为通过实时定量PCR(Q-RT-PCR)方法检测Vero-E6细胞上清病毒拷贝数验证维替泊芬对SARS-CoV-2的感染的抑制作用。
图4为不同浓度的维替泊芬对Vero-E6细胞的毒性作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在诸如Bruce Alberts《细胞分子生物学》第5版(2002)等工具书中均有完整的描述，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1
通过细胞病变(CPE)观察不同浓度的维替泊芬对SARS-CoV-2在Vero-E6细胞上的感染的抑制作用：
在96孔板中接种Vero-E6细胞悬液(4×104个/孔),将培养板放在培养箱中预培养12 小时，细胞贴壁生长；
加入相应浓度的维替泊芬提前处理1小时，溶剂对照加入DMSO，阴性对照不加药物；
之后除阴性对照之外的每孔加入200PFU SARS-CoV-2病毒(GenBank:MT121215.1)，感染12小时后，PBS洗两次，加入新的含维替泊芬的培养基，37℃培养48小时后显微镜观察细胞病变。
实验结果如图1所示，实验结果显示，正常Vero-E6细胞(阴性对照)在培养48小时后生长正常，没有观察到细胞病变，感染SARS-CoV-2的Vero-E6(DMSO溶剂对照)在培养48小时后出现明显的细胞病变，出现明显的细胞脱落，0.31μM维替泊芬处理后的 Vero-E6细胞感染SARS-CoV-2 48小时无明显的细胞病变，而0.16μM维替泊芬处理后的 Vero-E6细胞则出现细胞病变，说明0.31μM的维替泊芬可以有效抑制SARS-CoV-2的感染。
实施例2
通过间接免疫荧光实验观察不同浓度的维替泊芬对SARS-CoV-2在Vero-E6细胞上的感染的抑制作用：
如实例1步骤处理细胞，病毒感染48小时后用PBS洗2次，每次5分钟；
加入4％多聚甲醛室温固定15分钟；
弃液，加入含0.5％Triton X-100的PBS溶液，室温作用10分钟，PBS洗2次，每次5分钟；
加入用新鲜配制的含5％BSA的PBS溶液，室温封闭1小时，PBS洗2次，每次5 分钟；
加入1:1000稀释的鼠抗N蛋白(SARS-CoV-2)多克隆抗体，室温作用1小时；
PBS洗3次，每次5分钟；
加入1:10000稀释的FITC-山羊抗鼠IgG二抗，室温作用1小时；PBS洗3次，每次 5分钟；
加入DAPI溶液作用20秒，PBS洗2次，每次5分钟；
荧光显微镜下观察。
实验结果如图2所示，结果显示，与实施例1结果一致，Vero-E6细胞经0.31μM 维替泊芬处理后再感染SARS-CoV-2，细胞内无法检测到SARS-CoV-2的N蛋白，其他两组(DMSO溶剂对照和0.16μM维替泊芬处理)可以检测到绿色阳性信号。
实施例3
实时定量PCR(Q-RT-PCR)方法检测Vero-E6细胞上清病毒拷贝数验证维替泊芬对SARS-CoV-2的感染的抑制作用：
如实例1步骤处理细胞；
48小时后，收集细胞上清进行RNA提取。
RNA抽提：
细胞上清100μL加入到300μL TRIzol裂解液中，充分混匀裂解；
加入200μL氯仿剧烈震荡，静置2-3分钟后，4℃，12000g离心15分钟；
吸取上清，加入500μL异丙醇，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟；
加入1mL 75％的乙醇洗涤RNA沉淀；4℃，7500g离心5分钟；
弃去75％乙醇，干燥后加入20-50μL水溶解RNA沉淀；
RNA逆转录：
RNA逆转录采用天根FastKing一步法合成cDNA(Tiangen,KR118)。20μL反应体系中加入4μL 5×FastKing-RT SuperMix，20-2μg RNA，42℃反应15分钟后，95℃反应 3分钟。
实时定量PCR(qrtPCR)；
实时定量PCR采用天根SYBR Green I嵌合荧光法进行(Tiangen,FP205)。20μL反应体系中加入10μL 2×SuperReal PreMix Plus，引物(10μM)各1μL，模板cDNA 1μL，使用水补齐至20μL。反应条件如下：预变性：95℃15分钟；扩增40个循环：94℃10 秒，55℃20秒；72℃20秒；进行熔解曲线分析。扩增引物采用针对SARS-CoV-2N蛋白基因的特异性引物：上游引物：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；下游引物： 5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’。
结果如图3所示，结果显示，随着维替泊芬药物浓度的增加，感染SARS-CoV-2的Vero-E6细胞上清中病毒RNA水平明显降低，说明维替泊芬对SARS-CoV-2的感染有明显的抑制作用，其半数有效浓度(EC50)为0.028μM。
实施例4
检测维替泊芬对Vero-E6细胞的毒性作用：
在96孔板中接种Vero-E6细胞悬液(1×104个/孔)，将培养板放在培养箱中培养12小时；
向培养孔加入不同浓度的待测药物，对照组为溶剂DMSO。
48小时后检测药物对细胞增殖的影响。使用同仁CCK-8终点法试剂盒(ck04)。弃掉孔内多余培养基，每孔加入100μL含有10％CCK8溶液的无血清培养基；
将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
随后使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
实验结果如图4所示，维替泊芬在2.5μM浓度的作用以下，对Vero-E6细胞没有细胞毒性，其半数细胞毒性浓度(CC50)为10.33μM。选择指数(SI)为369(SI＝CC50/EC50)。
综上所述，本发明研究显示维替泊芬可以抑制SARS-CoV-2对Vero-E6细胞的感染；经低浓度维替泊芬(nM水平)的处理后，SARS-CoV-2无法感染Vero-E6细胞，为维替泊芬的应用提供了抗病毒新应用；并由此开发了维替泊芬在预防和治疗SARS-CoV-2感染的新功能，为新型冠状病毒病的新药研发提供了新的思路和方法。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。