一种血卟啉衍生物联合化学药物在乳腺癌治疗中的应用
阅读说明：本技术 一种血卟啉衍生物联合化学药物在乳腺癌治疗中的应用 (Application of hematoporphyrin derivative and chemical drug combination in treatment of breast cancer ) 是由 范平生 李增 纪丽君 张腾跃 汪国兴 钱立庭 刘亚贝 杨广山 黄金 翁呈韬 樊高 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于增加化疗药物敏感性的医药学领域,具体涉及一种血卟啉骈合维拉帕米片段血卟啉衍生物A2在乳腺癌逆转化疗药物的耐受与增敏的用途。血卟啉衍生物A2具有不同程度的增敏化疗药物抑制乳腺癌细胞增殖作用,表明血卟啉衍生物A2能够发展成为化疗药物的增敏剂或者逆转耐药剂,用于乳腺癌患者的治疗。(The invention belongs to the field of medicine for increasing the sensitivity of chemotherapeutic drugs, and particularly relates to an application of hematoporphyrin derivative A2 of hematoporphyrin and verapamil fragments in reversing the tolerance and sensitivity of chemotherapeutic drugs for breast cancer. The hematoporphyrin derivative A2 has the functions of sensitizing chemotherapeutic drugs with different degrees and inhibiting breast cancer cell proliferation, and the result shows that the hematoporphyrin derivative A2 can be developed into a sensitizing agent or a reversal drug resistance agent of the chemotherapeutic drugs and is used for treating breast cancer patients.)
技术领域
本发明属于增加化疗药物敏感性的医药学领域，具体涉及一种血卟啉骈合维拉帕米片段血卟啉衍生物A2在乳腺癌逆转化疗药物的耐受与增敏中的用途。
技术背景
化学疗法是当前乳腺癌疗法中最有效的方法之一。自从1990年代中期开始引入化学疗法并进行早期诊断以来，乳腺癌引起的发病率和死亡率已大大降低，乳腺癌患者的寿命得以延长[1]。然而，耐药性的发展最终成为乳腺癌成功化疗的巨大挑战。据估计，大量乳腺癌患者(高达50％)对当前的化疗方案没有反应[2]。对单一抗肿瘤药物的耐药性往往会触发对多种结构和功能独立的抗癌药的多效耐药性的发展，这种现象被称为多药耐药性(MDR)。如何克服乳腺癌的多药耐药成为目前乳腺癌化疗过程中亟待解决的问题。
维拉帕米(Verapamil，VER)是一种耐药逆转剂，VER是早期发现的可以改变细胞内化疗药物浓度而降低肿瘤耐药性的药物，实验研究表明，VER可以明显提高恶性肿瘤细胞对化学药物的敏感性[3]。该药物能够逆转肿瘤多药耐药(multiple drug resistance，MDR)的有效浓度为6.0-10.0μmol/L，但是当维拉帕米的静脉血药浓度超过1.0-2.0μmol/L就会出现心血管不良反应，如心率下降、血压下降、房室传导阻滞等[4]。因此，口服、静脉应用维拉帕米逆转肿瘤细胞多药耐药的应用受到限制。VER联合化疗药物靶血管灌注和瘤体局部注射有效，然而恶性实体肿瘤生长及转移部位的特殊性、介入治疗要求一定的设备和医生的技能，这样很多恶性实体肿瘤失去此有效方法，这些因素成为限制临床应用VER转肿瘤化疗药物耐受的主要原因。
血卟啉为暗红色结晶性粉末，易溶于甲醇，乙醇，己醇和氯仿等有机溶剂，难溶于水，乙醚及稀无机酸。血卟啉盐溶于水。光敏物质，在肿瘤组织中选择性潴留，在有氧的条件下，光敏剂与分子氧及其他物质作用产生活性氧组分(reactive oxygen species，ROS)，如单线态氧和氧自由基，这些活性氧分子易与多种生物分子反应，引起脂类、蛋白质、核酸和其他细胞组分的损伤，破坏组织、细胞，最终杀灭肿瘤细胞和组织己达到治疗目的[5]。生物特性主要表现为特异性聚集，即为血卟啉及衍生物可以在肿肾、脾、皮肤、瘤、肝、骨等组织中选择性积聚并滞留。通常来说，癌细胞对血卟啉的亲和力比正常细胞大10倍，因此血卟啉在癌细胞中的浓度远大于正常的组织细胞[6]，癌细胞内的滞留时间比较长，在上述正常组织细胞中血卟啉及其衍生物数小时可清除，经过48-72小时之后，正常组织中的血卟啉己完全排出，此时它几乎全部滞留在癌细胞内。经过特定波长的光照射，从而到达治疗癌症目的[7]。但由于血卟啉极性较低，因此不能直接通过静脉给药，从而极大的限制了其在临床中的应用。
参考文献：
[1]Stewart SL，King JB，Thompson TD，Friedman C，Wingo PA.Cancermortality surveillance--United States，1990-2000.MMWR Surveill Summ.2004,53(3)：1-108.
[2]O′Driscoll L,Clynes M.Biomarkers and multiple drug resistance inbreast cancer.Curr Cancer Drug Targets.2006,6(5)：365-384.
[3]Kyrochristos ID,Glantzounis GK,Ziogas DE,et al.From ClinicalStandards to Translating Next-Generation Sequencing Research into PatientCare Improvement for Hepatobiliary and Pancreatic Cancers.Int J Mol Sci.2017，18(1)：180
[4]Krawczenko A,Bielawska-Pohl A,Wojtowicz K，Jura R,Paprocka M，WojdatE,U,Klimczak A,Grillon C.Expression and activity of multidrugresistance proteins in mature endothelial cells and their precursors：Achallenging correlation.PLoS One.2017,12(2)：e0172371.
[5]Liu N，Huang H，Liu S，et al.Calcium channel blocker verapamilaccelerates gambogic acid-induced cytotoxicity via enhancing proteasomeinhibition and ROS generation.Toxicol In Vitro.2014,28(3)：419-425.
[6]Sun X,Yin Q，Chen D,Dong X，Zhou L，Zhang H,Fan P.Determination ofverapamil in dog serum and tissues by reversed-phase high performanceliquidchromatography.Se Pu.2004,22(3)：255-7.
[7]Moan J，Berg K.Photochemotherapy of cancer：experimentalresearch.Photochem Photobiol.1992，55(6)：931-948.
发明内容
本发明首先提供了一种用于治疗乳腺癌的药物组合物，该药物由药学上有效剂量的血卟啉衍生物A2和化疗药物，以及药学上可接受的载体制得。
所述血卟啉衍生物A2由血卟啉和维拉帕米片段的骈合形成，其具有如下结构：
所述维拉帕米片段为3，4-二甲氧基苯乙胺，其具有如下结构：
优选的，所述化疗药物为阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)中的一种或几种。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2占药物组合物的质量分数为0.1-99％。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2占药物组合物质量分数为10％、20％、30％、50％、70％。
本申请中所述药学上可接受的载体包括赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、缓释剂等一种或几种功能的辅料，如淀粉、脂类、蜡、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、明胶、柠檬酸、无机盐类、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素等。
优选的，所述药物组合物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
本发明其次提供血卟啉衍生物A2在制备抗乳腺癌药物的增敏剂或者逆转耐受剂中的应用。
本发明再次提供血卟啉衍生物A2与乳腺癌化疗药物的联合应用，所述血卟啉衍生物A2用于逆转耐受或增敏乳腺癌化疗药物；在乳腺癌化疗药物作用乳腺癌细胞的应用中增加乳腺癌化疗药物对乳腺癌细胞的抑制作用，增强了肿瘤细胞对药物的敏感性。所述化疗药物为阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)中的一种或几种。
本发明还提供血卟啉衍生物A2在药理学上容许的盐在制备抗乳腺癌药物的增敏剂或者逆转耐受剂中的应用。
优选的，所述在药理学上容许的盐包括血卟啉衍生物A2与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸中任一种成的盐；所述无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的任一种，所述有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸中的任一种，所述碱金属为锂，钠、钾中的任一种；所述碱土金属为钙、镁中的任一种；所述碱性氨基酸为赖氨酸。
本发明的有益效果在于：
1)考虑到：VER静脉应用的有效浓度所至毒性限制；体外实验和靶血管灌注、胸腹腔、局部注射对恶性实体肿瘤有良好的逆转效果；血卟啉在肿瘤组织中选择性潴留的特性；我们在国内外首次发明了血卟啉与维拉帕米片段合成新的化合物即血卟啉衍生物A2并验证了本全新的化合物联合化疗药物抗肿瘤作用的研究。
2)本发明提供了具有血卟啉衍生物A2对恶性实体肿瘤在逆转乳腺癌化疗药物耐受及增敏的用途；
3)从血卟啉与维拉帕米功能基团制备得到一种对恶性实体肿瘤在逆转乳腺癌化疗药物耐受及增敏的衍生物，在治疗恶性肿瘤具有广阔的应用前景；
4)本发明的方法易掌握、发明的衍生物能够产业化生产，并且本发明所涉及的血卟啉衍生物A2为全新结构可应用与抗肿瘤领域。
附图说明
图1：血卟啉衍生物A2在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的安全范围结果；
图2：血卟啉衍生物A2在乳腺癌细胞T47D中的安全范围结果；
图3：CCK8法检测血卟啉衍生物A2在安全范围内增加5-氟尿嘧啶抑制乳腺癌细胞T47D增值作用。图中Con表示对照组。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05与5-Fu组比较，###p<0.001,与Con组相比，ns表示差异无统计学意义；
图4：CCK8法检测血卟啉衍生物A2在安全范围内增加阿霉素制乳腺癌细胞T47D增值作用。图中Con表示对照组。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05与AMD组比较，###p<0.001，与Con组相比，ns表示差异无统计学意义；
图5.CCK8法检测血卟啉衍生物A2在安全范围内增加5-氟尿嘧啶抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增值作用。图中Con表示对照组。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05与5-Fu比较，###p<0.001,与Con组相比，ns表示差异无统计学意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明，除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。本文中使用的“A2”仅作为对本申请使用的血卟啉衍生物的命名，并不用于限制该血卟啉衍生物。
实施例1：
血卟啉类衍生物A2的合成
将血卟啉与维拉帕米片段(3,4-二甲氧基苯乙胺)在BOP地催化下，通过酰胺缩合反应合成目标产物即血卟啉衍生物A2。合成流程如下：
具体操作为：
将0.5mmol血卟啉溶于盛有30mL二甲基甲酰胺(DMF)的反应容器中，并加入4mmol3,4-二甲氧基苯乙胺和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌3小时，TLC检测反应进程；待反应结束后，向反应容器中加入100mL水，并将反应容器放于冰上等待析出固体；抽滤所述析出固体并干燥，即得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物三倍质量的量的200-300目硅胶，真空旋转蒸发乙酸乙酯；在硅胶柱层析中以二氯甲烷：甲醇体积比50∶1为洗脱剂，根据血卟啉衍生物A2与杂质极性不同，被洗脱下来时间不同，将血卟啉衍生物A2与杂质分离，得到深棕色血卟啉衍生物A2固体纯品。
本实施例制备的血卟啉衍生物A2的氢谱和质谱如下：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.52-8.46(m,2H),8.27(d,J＝11.0Hz，2H),8.16(s,1H),7.86(t，J＝4.8Hz,1H)，6.85-6.77(m,4H),6.74-6.66(m，2H)，4.85(dd，J＝16.5，5.2Hz，2H)，4.71(ddtd，J＝7.3，6.3，5.1，1.0Hz，1H)，4.45(qd，J＝6.7，5.4Hz，1H)，3.82-3.77(m，12H)，3.45(td，J＝5.3,4.8Hz,2H)，3.14(q，J＝5.3Hz,5H),3.01-2.92(m，2H),2.71(tt,J＝5.3,1.0Hz,4H),2.55(dd，J＝16.4,0.4Hz,2H),2.50-2.39(m,4H),2.09(s,3H),1.98(d,J＝1.0Hz,3H)，1.94(s，3H)，1.28-1.16(m，6H).MS(ESI)：m/z 925.5[M+H]+。
实施例2
CCK8试剂盒检测检测血卟啉衍生物A2和化疗药物抑制乳腺癌细胞增值活性
实验材料：血卟啉衍生物A2由血卟啉和维拉帕米的部分片段依据实施例1合成，纯度不低于95％。人乳腺癌肿瘤细胞株T47D和MDA-MB-231由安徽医科大学药学院提供。血卟啉，3，4-二甲氧基苯乙胺，卡特缩合剂，BOP，DIC，5-氨基-2-(3,4-二甲氧基苯基)-2-异丙基戊腈，阿霉素(ADM)，顺铂(Cisplatin)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)购自拜尔迪公司，纯度均大于99％。CCK8试剂盒购自biosharp Life sciences公司。
实验方法：
1.细胞复苏
1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液1ML，注入离心管并加入2ML培养液，混合后低速离心，弃去上清，再重复用培养液洗一次。
3)将培养液适当稀释后，接种于培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养到一定密度时进行传代。
2.细胞传代培养
人乳腺癌肿瘤细胞株T47D和MDA-MB-231培养于含有10％胎牛血清高糖DMEM培养基中。每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中生长到约90％汇合度(贴壁细胞)时，按照1∶3到1∶5的比例传代，约每隔2-4天传代一次。方法如下：
1)用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。
2)加入1-2ml 0.25％胰蛋白酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。待到细胞分离。
3)用含10％胎牛血清的合适培养基终止消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。
3.细胞冻存
1)取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。
2)弃去胰蛋白酶和旧的培养液，加入配置好的冻存液，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。
将冻存管放入冻存盒中置于-80℃，5小时后移入液氮罐中保存。
4.CCK8实验检测细胞药物敏感性
先进行血卟啉衍生物A2对人乳腺癌BFTC-905、RT112/84细胞的安全性实验，用于确定血卟啉衍生物A2的安全范围，以便后续实验。
将人乳腺癌肿瘤细胞株T47D和MDA-MB-231细胞按照6000/孔的密度接种到96孔板中，细胞贴壁后弃去培养基，分别加入不同浓度的化合物A2的新鲜培养基继续培养24小时，血卟啉衍生物A2使用50,20,10,5,2.5,1.25μmol/L共6种浓度梯度。结束后在96孔板中每孔再加入CCK8溶液10μL和90μL的不含血清的培养基，并将96板再温育2小时。然后将96孔板放在酶标仪中450nm处测吸光度值(OD450值)。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为不加药细胞组，细胞抑制率＝1-(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
血卟啉衍生物A2在乳腺癌细胞中的安全范围结果如图1所示，从图上可以看出，血卟啉衍生物A2在低于等于12μM时对乳腺癌细胞MDA-MB-231是无毒的，在低于等于20μM时对乳腺癌细胞T47D是无毒的，因此在检测细胞药物敏感性实验中分别选择血卟啉衍生物A2浓度为12μM、20μM进行实验，以排除血卟啉衍生物A2自身对实验结果的干扰。
将人乳腺癌T47D和MDA-MB-231细胞分别按照5000/孔的密度接种到96孔板中，细胞贴壁后除去培养基，用PBS冲洗细胞两次。用补充有10％FBS和不同浓度的药液的新鲜培养基37℃，5％CO2条件下培养24小时，每孔100μL。上述药液为阿霉素(ADM)、顺铂(Cisplatin)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)三种，每种均使用20,10,5,2.5,1.25μmol/L共5种浓度梯度。
温育后将每孔中液体弃去，在96孔板中每孔再加入CCK8溶液10μL和90μL的不含血清的培养基，并将96板再温育2小时。然后将96孔板放在酶标仪中450nm处测吸光度值(OD450值)。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为不加药细胞组。
细胞抑制率＝1-(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
以上实验均进行了三次重复，所得结果用SPSS统计分析软件和Graph作图软件进行分析处理。
通过人乳腺癌常用化疗药物阿霉素(ADM)、顺铂(Cisplatin)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)单用或联合血卟啉衍生物A2作用于人乳腺癌T47D和MDA-MB-231细胞，检测药物敏感性，经筛选后研究发现：阿霉素(ADM)联合血卟啉衍生物A2组对人乳腺癌T47D细胞的IC50值明显低于阿霉素(ADM)组，有显著性差异；5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合血卟啉衍生物A2组对人乳腺癌T47D、MDA-MB-231细胞的IC50值明显低于5-氟尿嘧啶(5-Fu)组，有显著性差异，其结果如图2、图3所示。从图2中可以看出血卟啉衍生物A2在安全浓度范围内不同程度的增加了5-Fu和ADM抑制T47D细胞增值的作用。其中，血卟啉衍生物A2浓度在15μM时，对5-Fu和ADM具有最大的增效能力。图3中血卟啉衍生物A2以非浓度依赖的方式增加了5-Fu对MDA-MB-231的杀伤作用，血卟啉衍生物A2为12μM时，增效能力最大。
上述实验表明，针对乳腺癌细胞，血卟啉衍生物A2可以不同程度增强乳腺癌常用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿霉素(ADM)对乳腺癌细胞的敏感性，且抑制敏感性作用较强，提示该血卟啉衍生物A2对乳腺癌化疗药物有增敏的作用。