具体实施方式

DHEA的有益效果

我们觉得，对于称为內在分泌(intracrinology)的雄性激素和雌性激素在外周靶组织的形成和作用(Labrie 1991；Labrie，Simard et al.1992a；Labrie，Simard et al.1992b；Labrie.Simard et al.1994；Labrie，Durocher et al.1995；Luu-The，Dufort et al.1995；Labrie，Simard et al.1996b；Labrie，Belanger et al.1997a；Labrie.Belanger et al.1997b；Labrie，Diamond et al.1997b；Labrie,Luu-The et al.1997)的认知的增加及我们最近的观察指出，在老鼠切除卵巢后雄性激素相较于雌性激素在预防骨质流失扮演较主要的作用(Martel，Sourla et al.1998)以及绝经后妇女相似情况的观察(Labrie.Diamond et al.1997a)，已经铺平性类固醇替代疗法和老化领域及时和潜在高度显着进展的道路。这些可能性得到我们所观察到的支持。

本发明因而是根据我们在男性和女性在性类固醇生理上的了解所取得的最新进展(Labrie 1991；Labrie,Simard et al.1992a；Labrie,Simard et al.1992b； Labrie.Simard et al.1994；Labrie,Durocher et al.1995；Luu-The,Dufort et al.1995；Labrie,Simard et al.1996b；Labrie,Belanger et al.1997a；Labrie,Belanger et al.1997b；Labrie.Diamond et al.1997b；Labrie.Luu-The et al.1997)。

男性的雄性激素持在30岁以后会逐步减少，同时血清DHEA及DHEA-S的浓度也会降低(Labrie，Belanger et al.1997b)。因为血清DHEA与高达50％的外周组织的雄性激素相关(Labrie,Dupont et al.1985: Labrie.Cusan et al.2009；Labrie 2010b；Labrie 2011)，由DHEA随着年纪造成雄性激素的减少在LOH(Late Onset Hypogonadism)的出现上扮演重要的角色并且所有前述问题均与低雄性激素有关。

DHEA，在男性胞机制(intracrine mechanisms)制造的周边雄性激素的重要来源

在动物物种中，人类与一些其他灵长类动物是独特的，具有分泌大量的无活性前体类固醇DHEA和DHEA-S的肾上腺，DHEA和DHEA-S被转换成在末梢组织有效的雄性激素和/或雌性激素。值得注意的是，人除了拥有非常复杂的内分泌和旁分泌系统，在很大程度上依靠在末梢组织形成性类固醇(Labrie.Dupont et al.1985；Labrie,Belanger et al.1988；Labrie 1991；Labrie,Belanger et al.1997a)(图1、2和5)。

在男性中，95％(或更多)由去势诱导血清睾酮，以及雄性激素的一部分消除的临床晚期前列腺癌的益处(Huggins and Hodges 1941)，导致错误地认为去势消除95％(或更多)雄性激素和使单独去势被视为前列腺癌的适当治疗。

在男性中，发现雄激素的25-50％被留在去势后的前列腺(Labrie.Dupont et al.1985；Belanger,Belanger et al.1989；Nishivama,Hashimoto et al.2004；Mostaghel,Page et al.2007)。这解释了为何加入纯(非类固醇)抗雄激素以去势达到更为完整的阻挡雄性激素的效果，并且已显示第一个在延长寿命的前列腺癌的治疗(Labrie, Dupont et al.1982；Labrie,Dupont et al.1985；Caubet，Tosteson et al.1997；Prostate Cancer Triallists′CollaborativeGroup 2000；Labrie.Belanger et al.2005)。残留在去势后相对高含量的雄性激素也解释了为什么在局部阶段开始时联合雄性激素封锁或睾丸和肾上腺起源的雄性激素的封锁的治疗可以让大部分的患者治愈(Labrie,Candas et al.2002；Akaza2006；Ueno,Namiki et al.2006)，从而清楚地表明男性源外或源内的睾丸雄性激素的重要作用。

在外围靶组织，上腺前体类固醇DHEA转化成雄性激素和/或雌性激素取决于各种类固醇和代谢酶的表达和这些组织中每一细胞的代谢酶。在男性和女性肾上腺前体性类固醇的高分泌速率和实验室中使用的所有动物模型(如大鼠、小鼠、豚鼠和其他，但不包括猴子)是完全不同的。动物模型中，性类固醇的分泌发生只在性腺(Labrie,Dupont et al.1985；Labrie,Belanger et al.1988；Belanger,Belanger et al.1989；Labrie.Belanger et al.1997a)。

在周边组织由肾上腺来源的DHEA制成的雄性激素睾酮和DHT以及E₂在他们的生产地、同一细胞内发挥作用(图5)。这种复杂的机制允许需要这些性激素的特定组织内的细胞保持雌性激素和/雄性激素的生物活性水平，而相同的类固醇在血液中以很低的水平泄漏，从而避免其他组织受到潜在的负面影响。在其细胞-特异的局部形成以及提供予当地细胞的即时可用性，睾酮和DHT(最有活性的天然雄性激素)以及E₂被灭活并在相同的细胞中转化成水溶性葡糖苷酸或硫酸酯衍生物，然后可以定量地扩散到全身循环而可在被肾脏排除以前透过质谱法(Labrie,Belanger et al.2006)而测定。

应当指出的是，内分泌形成雄性激素和雌性激素的重要性延伸到非恶性疾病，例如痤疮、皮脂溢、多毛症和雄性激素性脱发以及骨质疏松和萎缩的外阴阴道(Cusan,Dupont et al.1994；Labrie,Belanger et al.1997a；Labrie,Archer et al.2009b；Labrie, Archer et al.2009a；Labrie.Archer et al.2009c)。几乎所有的组织都拥有不同程度的类固醇合成酶，而其可转换DHEA。然而，每一组织拥有高度组织特异性的类固醇合成酶和类固醇灭活酶，这还需要需要试验证实。

当睾酮的血清水平在被去势的69-80岁的男性中降低97.4％(Labrie,Cusan et al.2009)，雄性激素的代谢物的总和，循环中唯一正确和有效的总的雄激素活性的参数(Labrie.Belanger et al.2006)，只减少58.9％(Labrie,Cusan et al.2009)，从而指出在完全消除睾丸的雄性激素后雄性激素非常重要的部分(41.1％)仍留在男性体内。这些数据与前列腺内DHT浓度相符，在各种研究中，平均39％的DHT在去势后仍留在前列腺，亦即45％(Labrie.Dupont et al.1985)、51％(Belanger,Brochu et al.1986)、25％(Nishivama,Hashimoto et al.2004)以及35％(Mostaqhel.Page et al.2007)(见Labrie 2010b 的图4)。

随着对肾上腺来源的雄性激素在男性中的重要意义的认识，感兴趣的是，比较在完整的绝经后妇女测定与上述男性相同的类固醇类的血清水平数据。从图6A及6B中可见，睾酮和总雄激素代谢物的血清水平在去势的男性和相当年龄的绝经后妇女几乎重叠。最有趣的是，也可以看出，雌酮硫酸盐(E₁S)的血清水平也是相当的(图6C)。也可以看出，E₁和E₂的血清水平也是可比的，从而表明男性和女性肾上腺来源的雌性激素在数量上的相似(Labrie.Cusan et al.2009)。

上述总结的数据显示，在69-80岁的男性中，在缺乏睾丸的情况下，～40％的雄性激素在外周组织制造。因为从三十岁开始，随着年纪的增长，血清DHEA显着的下降(Labrie, Dupont et al.1985)，而睾丸分泌雄性激素仅稍微降低，有可能的是，肾上腺来源相较于较小的年龄有更大的相对和绝对重要性。

如上所述，外周目标组织内性类固醇的本地合成和作用被称为内在分泌(intracrinology)(Labrie,Belanger et al.1988:Labrie1991)。本领域最新和快速的进展透过厘清大部分的组织-特异基因的结构而成为可能，其编码局部外周组织内负责将DHEA-S和DHEA转变成雄性激素及/或雌性激素的类固醇合成酶(Labrie,Simard et al.1992a；Labrie.Suqimoto et al.1992；Labrie.Durocher et al.1995；Luu-The，Zhang et al.1995:Labrie, Simard et al.1996a；Labrie.Luu-The et al.1997)(图5)。

在人体性激素生理上，DHEA和DHEA-S的重要性可由以下说明，估计高达50％的总雄性激素是来自这些肾上腺类固醇前体所得到的(Labrie,Dupont et al.1985: Belanger， Brochuet al.1986； Labrie， Belanger et al.1993)。

关于乳腺癌，DHEA是众所皆知的预防老鼠二甲蒽乳腺肿瘤的发展(Luo，Sourla et al.1997)以及抑制其成长(Li， Yan et al.1993)，此外，还抑制裸鼠中人乳腺癌移植的增长(请见示例1及(Couillard，Labrie et al.1998))。因此，相反于产生刺激作用的雌性激素和孕激素，DHEA有望抑制妇女乳腺癌的发展和生长。

除了在我们先前的研究所表明，补充生理量外源性的DHEA允许雄性激素及雌性激素仅在适当的包含特定类固醇合成酶的目标组织的生物合成。这样合成的活性雄性激素及雌性激素留在原细胞内而仅有少量泄漏而进入血液循环。

事实上，施用DEHA的最显着的效果是在DHT的代谢物的葡糖苷酸衍生物的循环水平，即ADT-G和3α-二醇-G，这些代谢产物被在外围胞组织本地生产，并且具备相应的类固醇合成酶以从肾上腺前体DHEA和DHEA-S合成DHT，并在之后进一步将DHT代谢成无活性的结合物(Labrie 1991；Labrie，Simard et al.1996a)。在靶组织雄性激素的这种局部的生物合成和行动使其它组织不会暴露于雄性激素，从而最大限度的减少不希望的男性化或其它与雄性激素相关的副作用的风险。这同样适用于雌性激素，虽然我们认为还没有可靠的总雌性激素分泌(相当于雄性激素的葡糖苷酸)的参数。

DHEA、肌肉和无脂肪体重

由于60-70岁男性的雄性激素的40-50％来自肾上腺DHEA(Labrie，Cusan et al.2009)，合理的认为肾上腺DHEA具有比得上睾丸睾酮在控制男性肌肉质量和力量的重要性。

毫无疑问，雄性激素在肌肉生长，发育和功能上发挥主导作用。雄激素增加在正常男性的肌肉质量是公知的(Bhasin，Storer et al.1996；Bhasin.Woodhouse et al.2001)，这种效果使得国际奥委会发出雄性激素的禁令。事实上，体育兴奋剂的主要形式仍然是蛋白同化雄性激素的滥用(androgenicanabolic abuse)。在适宜的剂量，外源性雄性激素加强男女运动员的肌肉和力量(Handelsman 2006)。结果是，自70年代初，外源性雄性激素在男性和女性运动中已被禁止使用。

中老年男性和女性血清中DHEA的明显下滑，导致了一个建议：一系列的与老化有关的变化，包括肌肉质量和强度的损失，可能是由于随着年龄DHEA下降而造成(Labrie， Belanger et al.1998；Lamberts 2003)。DHEA在啮齿动物身体组成的有益效果是公知的(Taqliaferro.Davis et al.1986；Han，Hansen et al.1998)。在男性中观察到的几个年龄有关的变化，尤其是肌肉和骨量丢失，以及类似于在雄性激素缺乏所观察到的性功能和在脂肪量增加(Matsumoto 2002；Morlev and Perry 2003)。

基于横截面数据，在70岁的最大肌力是在30岁中发现高峰肌肉力量的30-50％(Murray and Pitt 1985；Kallman，Plato et al.1990)。年龄相关的肌肉力量丧失似乎与肌肉的减小的横截面面积相关联(Larsson，Grimbv et al.1979；Kallman，Plato et al.1990)。年龄相关的肌肉减少将增加跌倒、骨折、伤残和威胁生命的并发症的风险(Evans 1997；Frontera,Hughes et al.2000；Melton,Khosla et al.2000；Hughes,Frontera et al.2002；Iannuzzi-Sucich.Prestwood et al.2002)。

以下研究使用了显然过低剂量的睾酮(Elashoff，Jacknow et al.1991)，最近一系列的研究已经明确证实雄性激素对肌肉大小和强度的剂量反应的刺激作用(Bhasin， Storer et al.1996；Bhasin.Storer et al.1997；Bross，Casaburi et al.1998；Bhasin， Wood house et al.2001；Storer，Maqliano et al.2003；Bhasin，Woodhouse et al.2005)比较增加睾酮剂量对60-75岁和19-35岁的男性雄激素敏感的参数的疗效。所有的人都用GnRH激动剂治疗以消除内源性和可变水平的睾丸雄性激素。20周每周庚酸睾酮(testosterone enanthate)的剂量分别为25、50、125、300和600mg。在年轻人和老人所观察到的作用呈现剂量相关的。在无脂肪量和肌肉强度的增加与睾酮剂量呈正相关，在老年和年轻男性间没有不同。最好的容忍是用125mg的剂量达到，此剂量给予高的正常血清睾酮水平、低的不良反应水平并增加了无脂肪组织和肌肉力量(Bhasin.Woodhouse et al.2005)。雄性激素对肌肉的影响在具有性腺机能减退的男性中(Bhasin,Storer et al.1997； Snyder,Peachey et al.2000)以及接受糖皮质激素治疗的男性中(Crawford.Liu et al.2003)是公认的。

在一项558名20-95岁男性的研究中，血清DHEA-S被发现是60-79岁男性的肌肉强度及质量的独立预测因子(Valenti.Denti et al.2004)。这结果与另一显示血清DHEA-S与肌肉强度关联性的研究吻合(Kostka,Arsac et al.2000:Bonnefov,Patricot et al.2002)。

6或12个月的每日施用剂量50或100mg的DHEA分别提高中老年男性伸膝的力量(Yen,Morales et al.1995)。然而，对于60-80岁女性施用DHEA则无明显效果，然其实验数量较小。施用DHEA增加肌肉质量可见(Yen,Morales et al.1995；Diamond,Cusan et al.1996；Morales,Haubrich et al.1998；Gebre-Medhin.Husebve et al.2000；Villareal,Holloszv et al.2000；Gordon.Grace et al.2002；Johannsson.Burman et al.2002)，而其他研究在女性中则无明显效果(Yen,Morales et al.1995；Callies, Fassnacht et al.2001；Percheron,Hoorel et al.2003)。

无脂肪体重(lean body mass)已报道可由DHEA治疗而增加(Diamond,Cusan et al.1996；Morales,Haubrich et al.1998；Gebre-Medhin.Husebve et al.2000；Viliareal.Holloszv et al.2000；Nair,Rizza et al.2006；Gurnell.Hunt et al.2008)。

姿势失衡、跌倒与老化过程中的髋部骨折有关(Cummings and Nevitt1989)。事实上，据估计，在老年人骨折中的80％是发生在没有外围骨质疏松症的老年人上(Siris,Chen et al.2004)。这些数据强调通过保持肌肉和力量预防老年人跌倒的重要意义(Chang, Morton et al.2004)。骨折有很大一部分来自由于肌肉和力量的损失的跌倒，这应该是可以通过适当的DHEA置换來达到一定程度的预防。

雄性激素和雌性激素在骨生理的作用

雄性激素对骨生理主导作用是有据可查(Labrie.Diamond et al.1997b；Martel.Sourla et al.1998)。事实上，无论是睾酮和DHT增加的转录α(I)类成骨细胞骨肉瘤内的细胞溶胶原mRNA(Benz.Haussier et al.1991)。DHT治疗也已证明刺激去卵巢老鼠软骨内成骨发育(Kapur and Reddi 1989)。此外，绝经后妇女24个月的治疗期内，透过雌性激素+睾酮植入物比单独施用E₂其腰椎、股骨粗隆和全身的骨密度测量增加更多。

此外，在骨质疏松症中，报导了合成类固醇防止骨损失(Henneman and Wallach 1957)。相似的，皮下E₂和睾酮植入物被发现比口服雌激素更有效地预防绝经后妇女的骨质疏松症(Savvas.Studd et al1988)。尽管在该研究中观察到的差异已被归因于雌性激素给药路径的差异，差异的原因很可能是睾酮的作用。以骨形成增加指数而言，绝经后妇女接受甲基睾酮加雌性激素与单用雌激素相比，其增加血清骨钙素，这是骨形成指标(Raisz.Wiita et al.1996)。对血清骨钙素类似的刺激作用已在绝经后妇女12个月的经皮DHEA治疗观察到(Labrie,Diamond et al.1997a)。此外，雄性激素治疗，与癸酸诺龙(nandrolone decanoate)观察,已发现增加绝经后妇女的椎骨骨密度(Need,Horowitz et al.1989)。虽然雄性激素由于其在绝经后妇女独特的作用获得越来越多的支持，使用睾酮会观察到男性化效果(Burger,Hailes et al.1984；Studd,Collins et al.1977)。

我们显示了DHEA在雌性老鼠(Luo,Sourla et al.1997)以及绝经后妇女发挥了有益的效果(Labrie,Diamond et al.1997a)。因此，在完整的雌性老鼠中，以DHEA治疗会增加总骨架、腰椎和股骨的骨密度(BMD)(图7、8及9)。

这显示了SERM雷洛昔芬(Raloxifene)和托瑞米芬(Toremifene)增加骨密度(Smith 2006)。克罗米芬(clomiphene citrate)则显示血清睾酮以及性腺功能减退的症状/体征的正面结果(Shabsigh.Kang et al.2005；Whitten,Nanqia et al.2006)。

DHEA及腹部肥胖

腹部肥胖与胰岛素抗性、第二型糖尿病及动脉粥样硬化相关(Shimokata.Tobin et al.1989:Cefalu.Wang et al.1995:Ferrannini,Natali et al.1997；Kopelman 2000)。在其他因素中，荷尔蒙的变化，尤其是肾上腺的DHEA及DHEA-S分泌的减少被认为是涉及的因素(Tchernof,Labrie et al.1996)。在小鼠和大鼠模型中，施用DHEA减少了饮食所致肥胖的内脏脂肪堆积(Yen.Allan et al.1977；Cleary and Zisk 1986:Mohan,Ihnen et al.1990:Hansen,Han et ai.1997)。观察到DHEA减少随着年纪而发生的胰岛素阻抗的有益效果。

在一项研究中，绝经后妇女接受了DHEA乳膏12个月,我们发现胰岛素抵抗下降而皮下脂肪在大腿的水平也降低(Diamond.Cusan et al.1996)。此外，每日施用50mgDHEA于65-78岁的男性及女性6个月，腹部内脏脂肪在女性下降了10.2％而男性为7.4％(Villareal and Holioszv 2004)。在相同研究中，腹部皮下脂肪在女性和男性下降了6％。此外，血清胰岛素对葡萄糖耐受性试验的响应下降了13％，而在葡萄糖反应则没有变化，从而使得施用DHEA可以改善胰岛素敏感指数34％。在DHEA作用的改进也在中年患有高胆固醇血症男性发现(Kawano.Yasue et al.2003)。

在一项先前相同群组的研究中，施用DHEA6个月会减少总身体脂肪质量1.4kg，而无脂肪质量则增加0.9kg(Villareai,Holioszv et al.2000)。

在36周招募1353老年男性的25个随机小规模临床试验中，DHEA与脂肪量的减少有关，其严格按照其转换成相关的具有生物活性的雄性激素代谢产物(Corona,Rastrelli et ai.2013)。对血脂和血糖代谢、骨骼、性功能和生活质量无显着效果。

DHEA与性功能

基于社区的研究表明，妇女自我报告的性功能障碍的范围是从8％至50％。事实上，妇女自三十岁起以及去卵巢后，性欲低下和性功能障碍增加(Laumann,Paik et al.1999)(Nathorst-Boos and von Schoultz 1992)。心理和健康因素与低觉醒和低性欲相关(Dennerstein,Dudley et al.1997)，人们相信低雄性激素发挥独立的作用(Bachmann.Bancroft et al.2002；Miller.Rosner et al.2004)。

雄性激素已知在妇女觉醒、乐趣以及性高潮的容易性和强度扮演重要角色。雄激素也参与神经肌肉平滑肌的肿胀并提高润滑的响应(Basson 2004)。

此外，将雄性激素加入ERT或HRT的详细益处为总体幸福感、精力、情绪和一般生活质量(Sherwin and Gelfand 1985；Sherwin 1988)。在加入雄性激素至雌性激素替代疗法(ERT)后，已经观察到改善了的主要心理和心身症状，即易怒、紧张、记忆和失眠(Notelovitz.Watts et al.1992)。

性欲和/或性生活满意度的丧失是早期绝经后常见的。加入雄性激素的激素替代疗法(HRT)已知具有对这些问题的有益作用。(Shifren.Braunstein et al.2000)发现通过贴片透皮施用睾酮改善手术绝经的妇女性生活的频率、愉悦和心情。每天300μg剂量的睾酮可见效果，此剂量使血清睾酮达至正常上限水平。睾酮治疗也已研究了在非雄性激素缺乏的妇女所抱怨的性欲降低(Goldstat.Briqanti et al.2003)。这些睾酮的治疗与安慰剂相比改善了性欲、性功能以及生活质量。相似的，在有正常水平的雄性激素的绝经期妇女，加甲基睾酮的雌性激素与单独使用雌性激素相比，增加了性欲和频率(Lobo，Rosen etal.2003)。在女性性兴趣、欲望的功能减退，雄性激素治疗已经被建议用于治疗具有参考范围的较低游离血清睾酮水平(Bachmann,Bancroft et al.2002)。事实上，有增加睾酮的使用以治疗性欲障碍(HSDD)(Sherwin and Gelfand 1987；Davis,McCloud et al.1995:Shifren,Braunstein et al.2000；Goldstat.Briqantiet al.2003)。这些随机临床试验表明，睾酮对有HSDD的女性而言是有效的。

肾上腺来源的雄激素缺乏本质的一个明显的例子是由肾上腺皮质功能不全。(Arlt,Callies et al.1999)研究指出4个月内每天50mg DHEA及安慰剂对于有肾上腺皮质功能不全的效果。DHEA治疗将在低正常范围的血清睾酮提高。此类治疗增加性的想法、兴趣和满意度的频率。幸福感、抑郁和焦虑也有所改善。在每天施用高剂量DHEA 300mg的研究中，其对于色情影片在心理(p,0.016)和物理(<0.030)上有更大的意识(Hackbert and Heiman2002)。

因为现在可以理解到血清睾酮并不能反映全雄性激素池(Labrie,Belanger et al.2006)，不意外的是，睾酮需要被增加至超生理水平以提高性功能，因为血清水平只代表总雄性激素的部分，其高达50％于细胞内做出而无法反映出循环睾酮水平。

由于雄性激素出现在女性性功能障碍如此重要，实际上100％的雄性激素的妇女起源自DHEA(Labrie 2010a；Labrie.Martel et al.2011)并且妇女获益于收用DHEA(Labrie.Archer et al.2009a)，这是合理的认为，在存在或缺乏低血清睾酮下在有性欲减退和性功能障碍(或其他雄性激素缺乏症状)的症状男性施用DHEA，将自施用DHEA获得类似的有益效果。

DHEA和心血管疾病

有令人信服的证据表明雄性激素对男性心血管疾病(CVD)具有有益的作用(Alexandersen.Haarbo et al.1996；Anker,Chua et al.1997)(Beer.Jakubowicz et al.1996；Anker,Clark et al.1997；Hak,Witteman et ai.2002)。这与高血清DHEA与降低死亡率及CVD相符(Alexandersen,Haarbo et al.1996)。

临床试验建议男性的睾酮替代疗法可以帮助有心绞痛且睾酮缺乏的男性(English,Steeds et al.2000；Malkin,Pugh et al.2004)、充血性心脏衰竭(Pugh.Jones et al.2004；Malkin，Pugh et al.2006)及第2型糖尿病(Kapoor，Malkin et al.2005；Kapoor.Goodwin et al.2006)。此外，在人类中，数据表明，DHEA抑制动脉粥样硬化(Eich， Nestler et al.1993；Kurzman.Panciera et al.1998；Havashi，Esaki et al.2000；Komesaroff 2008)、降低心血管疾病风险指标(Mortola and Yen 1990；Beer，Jakubowicz et al.1996)并且改善血管内皮功能(Kawano，Yasue et al.2003；Williams，Dawood et al.2004)。在灵长类动物中，也已经观察到DHEA对动脉粥样硬化的保护作用(Christopher- Henninqs，Kurzman et al.1995)，并且特别是在兔子中(Gordon,Bush et al.1988；Eich, Nestler et al.1993)。

除了TOM试验，一系列的试验的荟萃分析并未显示心血管的不良影响(Calof, Singh et al.2005；Haddad.Kennedy et al.2007；Femandez-Balsells,Murad et al.2010)。Shores et al,2012观察到以睾酮治疗的病人在死亡风险上39％的减少以及减少20％的心脏疾病的发生率(Shores，Smith et al.2012)。

在不良于行的老年男性的睾酮(TOM)测试中，经历了心血管事件的男性在血清游离睾酮水平上相较于未经历者有较大的提升(Basaria，Davda et al.2013)。

低血清DHEA-S已被发现与心血管事件的发生率正相关(Mitchell，Sprecher et al.1994)。血管造影冠状动脉狭窄的程度(Herrington，Gordon et al.1990)和发生率(Herrington，Naniee et al.1996)，从而表明DHEA-S对心血管疾病有保护作用。此外，低血清睾酮已经与男性的冠心病风险增加有关(Turhan，Tulunav et al.2007)而低DHEA水平已报道易患CVD而早期死亡(Barrett-Connor.Khaw et al.1986；Tivesten，Vandenput et al.2009；Ohlsson.Labrie et al.2010)。

DHEA及脑

除了传统绝经症状(Raven and Hinson 2007)，DHEA随着年龄增长的下降被认为与认知损失和认知功能丧失有关(Flood and Roberts1988；Grimlev Evans，Maiouf et al.2006)。

提出了DHEA在阿尔茨海默氏病引起的神经元损伤的病因及治疗的作用(Simpkins.Green et al.1997；Weill-Engerer.David et al.2002；Yau，Rasmuson et al.2003)。海马是参与学习、认知和记忆脑区。这个脑区域显示在老化过程中和在阿尔茨海默病明显变化(Beck and Handa 2004)。雌性激素和DHEA可在大脑局部形成雌激素已经显示出增强记忆和学习功能(McEwen.Gould et al.1995；Fov 2001；Vallee.Mavo et al.2001V)。有研究表明，DHEA-S可以影响脑功能和积极影响存储器情绪和精力和间接身体活动(Wolkowitz.Reus et al.1999；Hunt,Gurnell et al.2000；Huppert and Van Niekerk 2001)。

人类的长期记忆可由DHEA治疗改善(Barrett-Connor and Edelstein1994)。另外，部分缺乏雄性激素的老年男性每天口服施用25mg DHEA 12个月改善了情绪、疲劳以及关节疼痛(Genazzani,Inqlese et al.2004)。

已经提出雄性激素对抑郁、记忆力减退、认知和脑细胞失去活性激素的角色(Azad.Pitale et al.2003；Haiszan,MacLuskv et al.2007；Almeida,Yeap et al.2008)。雌性激素也可以在脑中从DHEA合成，并且显示对于阿尔茨海默病，记忆丧失和认知的丧失的益处(Rocca.Bower et al.2007)。三荟萃分析显示绝阿尔茨海默氏病的风险经后服用雌激素的妇女降低20至40％(Yaffe 1998；Hoqervorst,Williams et al.2000；LeBlanc, Janowskv et al.2001)。雌性激素减少在脑中的β-淀粉样蛋白沉积，而孕激素具有相反的效果(Xu,Gouras et al.1998；Huang,Guan et al.2004)。现在有临床研究确凿的证据，有对雌激素对神经保护(Rocca,Bower et al.2007)、心血管疾病(Manson,Bassuk et al.2006)和总体死亡率(Rocca.Grossardt et al.2006)的有益作用的关键年龄窗口。

雌性激素缺乏和认知障碍或痴呆之间的关联通过实验而支持。其中雌性激素改善去卵巢老鼠的海马树突棘的突触形成(McEwen and Alves1999；Monk and Brodatv2000)。此外，雌性激素改善脑血流和葡萄糖代谢并且它可以作为抗氧化剂(Gibbs and Aaaarwal 1998；McEwen and Alves 1999:Monk and Brodatv 2000)。雌激素也被发现，从诱导细胞内钙的升高和从造成线粒体损伤防止B-淀粉样蛋白1-42(Chen,Nilsen et al.2006；Morrison,Brinton et al.2006)。

越来越多的证据建议了性类固醇的角色，亦即雌性激素和睾酮于脑中的神经保护作用(Pike,Carroll et al.2009)。从细胞培养和动物研究的数据支持睾酮作为神经保护(Holland,Bandelowet al.2011)并且相同数据建议这对较老男性认知上的有益效果(Tan and Pu2003)。在最近的临床研究中，睾酮减少海马细胞中神经元和血管老化(Ota, Akishita et al.2012)并且减少认知衰退。

与对照组相比，在阿尔茨海默氏症的老年男性中发现较低的血清睾酮水平(Hoqervorst,Bandelow et al.2004)。

低DHEA于长寿

低DHEA-S与低长寿相关(Kushnir,Blamires et al.2010；Labrie 2010b:Arauio and Wittert 2011: Traish.Kang et al.2011；Magqi.Buvat et al.2013)。

DHEA其他潜在的有益效果

随着老化，肾上腺减少70至95％DHEA及DHEA-S的生成，导致外周靶组织内雄性激素和雌性激素生成的剧烈减少，这与年龄相关疾病的发病机制相关，例如胰岛素抵抗(Coleman,Leiter et al.1982；Schriock,Buffington et ai.1988)以及肥胖(Nestler, Barlascini et al.1988: MacEwen and Kurzman 1991:Tchernof.Despres et al.1995)。DHEA还被发现发挥在一系列动物模型(Schwartz.Pashko et al.1986: Gordon.Shantz et al.1987；Li,Yan et al.1993)的抗血管生成活性。DHEA还显示了(Suzuki,Suzuki et al.1991)、在真菌和病毒的体内和体外疾病中(Rasmussen.Arrowood et ai.1992)的免疫调节作用，包含HIV(Henderson.Yana et al.1992)。另一方面，已经描述了DHEA对于绝经后妇女免疫系统的刺激(Casson,Andersen et ai.1993)。

DHEA和脂质

已经报导施用不同剂量的DHEA不同时间之后，总和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇小但显着的下跌(Nestler,Barlascini et al.1988；Mortola and Yen 1990: Arlt, Calliesetal.1999；Barnhart,Freeman et al.1999；Petri,Lahitaet al.2002:Petri, Mease et al.2004)，而在其他研究中，除了总和高密度脂蛋白胆固醇以外，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇也下降了(Gebre-Medhin,Husebve et al.2000:Dhatariva.Biqelow et al.2005)。在先前的研究中，每天以剂量50mg(Arlt,Cajlies et al.1999；Barnhart, Freeman et ai 1999: Hunt.Gurnell et al.2000)、4-6g的10％DHEA膏(Labrie.Beianqer et al.1997a)、1600mg(Mortola and Yen 1990)或25mg(Casson,Santoro et al.1998)施用DHEA，会使血清HDL胆固醇少量地减少，并且在其他研究中，50mg/天(Morales.Nolan et al.1994:Barnhart,Freeman et al.1999；Villareal,Holioszv et al.2000)或25mg/天(Kawano,Yasue et al.2003；Lovas,Gebre-Medhin et al.2003)则无显着效果。

相反于雌性激素，DHEA不会增加甘油三酯(Diamond,Cusan et al.1996)。事实上，甘油三酯的减少常见于DHEA(Lasco.Frisina et al.2001；Chang.Lan et al.2002；Dhatariva.Bigelow et al.2005)。也报导了增加HDL及减少LDL胆固醇(Lasco,Frisina et al.2001)，而只有总胆固醇减少被报导(Libe,Barbetta et al.2004；Williams,Dawood et al.2004)。DHEA施用于绝经后妇女被报导是减少血清载脂蛋白A(Apolipoprotein A)并且增加HDL胆固醇(Casson，Santoro et al.1998；Morales,Haubrich et al.1998)。DHEA被发现减少血清Lp(A)(Barnhart.Freeman et al.1999)，是对于CVD(Lobo 1991)有益的效果。

在雄性激素影响下，因为甘油三酯及HDL胆固醇水平的减少，被认为是因为增加肝脂酶活性导致增加高密度脂蛋白的清除(Haffner,Kushwaha et al.1983；Hazzard, Haffner et al.1984；Kantor.Bianchini et al.1985)。增加的胆固醇逆向转运(透过增加HDL间隙去除外周组织的胆固醇)似乎和降低HDL和甘油三酯水平相关，而非降低HDL生产(Wu and von Eckardstein 2003)。DHEA相对小(若存在)的对整体胆固醇、HDL胆固醇和有时LDL胆固醇的抑制效果，还涉及DHEA衍生的雄性激素对肝脂酶活性的影响，从而损害肝细胞胆固醇的形成(Tan.Shiu et al.1998)。

共识是，DHEA对于血脂只有小而无临床上明显的效果(Arlt,Justl et al.1998；Morales,Haubrich et al.1998；Gebre-Medhin,Husebve et al.2000；Lasco.Frisina et al.2001；Poretskv,Brillon et al.2006；Gurnell.Hunt et al.2008；Lovas and Husebve 2008)。然而，根据我们的临床研究，显示了对血清甘油三酯的抑制效果而对于胆固醇则无影响(图10)，而EM-800(阿考比芬前药，游离盐)则减少血清甘油三酯(图10)及胆固醇(图10及11)。

DHEA的益处:雌性激素类似物及雄性激素效果的组合

本发明是基于在男性和女性中的性类固醇生理学的了解所取得的最新进展，以及对于女性在绝经期不仅因为卵巢分泌雌性激素被剥夺而失去雌性激素，还多年暴露于雄性激素的认知。事实上，正常妇女产生相当于男性分泌的雄性激素约50％的量的雄性激素(Labrie,Belanger et al.1997a)。男性和女性雄性激素池从30岁逐渐减小，而DHEA和DHEA-S的血清浓度也同时下降(Labrie,Belanger et al.1997b)。加入像阿考比芬的SERM是增加睾酮的血清水平(图12)、对骨损失的保护以及其他施用SERM的益处。在图12中，DHEA和阿考比芬的效果的示意图以GnRH/LH分泌雌性激素的负反馈效应呈现，如进一步于图13及14，从雄性食蟹猴所获得者，观察到增加血清睾酮水平的增加。

阿考比芬增加人的LH分泌，其通过在有晚期乳腺癌绝的经前妇女6个月每天口服施用20mg的阿考比芬血清E₂水平从222至2030pg/mL的增加而确定。

阿考比芬的有益效果

如图15所示，大约100％他莫西芬对肿瘤成长的刺激效果被在同时的EM-652.HCl的治疗下被阻止(阿考比芬)。EM-652.HCl依其纯抗雌激素活性而对于裸鼠中的人类乳腺癌细胞ZR-75-1异种移植的成长没有任何刺激效果。

我们还注意到，SERM对于血清胆固醇的有益效果和对骨头的雌性激素或类性激素的效果的关联性。SERM也对高血压、胰岛素抵抗、糖尿病和肥胖症有有益效果(尤其是腹部肥胖)。不希望受理论的束缚，相信SERM，多数较佳的是有两个芳香环，其透过一或二个居间碳原子连接，并且预期会借助于分子的上述部分与雌性激素受器反应。较佳的SERM有支链，会选择性地造成在乳腺癌和子宫中拮抗性质而对其他组织没有拮抗性。因此，SERM会在乳腺癌中作为抗雌激素，而令人惊讶的是，在骨头以及血液(其血脂以及胆固醇受影响)是作为雌性激素(或提供类雌性激素活性)。对胆固醇和血脂的有利影响是对动脉粥样硬化的有利效果，其被认为是不利地、受胆固醇和脂质的不当水平影响(图10及11)。

心血管症状、阿尔茨海默氏病、认知功能和失眠损失与位于中央神经系统的特定雌性激素受体有关。可能的是，降低脑中雌性激素(或雄性激素)水平可以解释部分的情形。外源性雌激素，特别是那些(例如雌二醇)透过施用性类固醇前体所形成者，其可穿过血脑屏障并结合到雌性激素受体的，以恢复正常的雌性激素作用。另一方面，本发明的SERM，特别是阿考比芬家族，如图8所是无法穿过血脑屏障。因此，它们无法拮抗脑雌性激素的正面作用，但可以拮抗脑雌性激素在胸部的负面作用，认定此组合(SERM+性类固醇前体)对于治疗及降低获得上述情形的风险特别有吸引力。

如前所述，雄性激素作用也被认为与所有这些症状有关。事实上，DHEA可以根据生理需要在大脑中同时提供雌性激素和雄性激素。

结合性类固醇前体和SERM或抗雌激素的整体添加的好处

在任何参数上，EM-652(阿考比芬)无观察到不良效应，而它应该标记为对男子女性型乳房，乳腺癌和骨质疏松症的预防和治疗有益。

本处所讨论的较佳的SERM或抗雌激素关于:(1)所有本发明所述的易受感的疾病；(2)治疗性和预防性应用；以及(3)较佳的药学组合物及试剂盒。

需要治疗或减少给定疾病的发病风险的患者是诊断出这些疾病或者可能感染这些疾病的人。

除了另外说明，本发明活性化合物(浓度以及施用模式)的较佳剂量在治疗和预防目的上是相同的。无论所治疗的疾病为盒，所讨论的每一活性组成物的剂量而是相同的(或疾病发作的可能性被降低)。

除了当另有说明或者根据上下文明显表示，如示例中所示，本文的剂量是指未受药用赋形剂、稀释剂、载体或其它成分影响的活性化合物的重量，虽然这些额外的成分是所欲包含者。在制药工业中通常使用的任何剂型(胶囊剂、丸剂、片剂、注射剂等)适用于本发明使用，并且术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”如通常包括这样的非活性成分，在本产业内与活性成分一起在这样的剂型。例如，可包括典型的胶囊剂、丸剂、肠溶包衣、固体或液体稀释剂或赋形剂、调味剂、防腐剂、或类似物。

本处所讨论的任何疗法所使用的所有活性成分可以制成包含一或多种其他活性成分的要学组合物。可选的，它们可以各自单独施用但在时间上足够同时，使得患者最终提了血液水平或者另外同时享受每一活性成分(或策略)的益处。在本发明部分较佳实施例中，例如，一个或多个活性组成是制成单一药物组合物。在本发明其他实施例中，提供了包含至少两个单独的容器而每一容器的组成物相异，在全部或部分，从至少一个其它容器的相对于其中所含的活性成分的内容。

本文所讨论的联合疗法也包括使用一种活性成分(联合疗法的)在制备用于治疗(或降低风险)疾病的药物的用途，而治疗或预防还包含本发明联合疗法的另一活性成分。举例而言，在一实施例中，本发明提供了使用SERM于药物制备的用途，以与性类固醇前体在体内治疗任何本发明认为此联合疗法有效的疾病。

骨密度(BMD)量测的限制是已知的。举例而言，BMD量测在以类固醇抗雌激素ICI182780(Wakelinq 1993)对老鼠的治疗中没有发现改变，而在形态计量学(形态计量学)则发现了抑制(Gallagher,Chambers et al.1993)。他莫西芬(Tamoxifen)也有相似差异的报导(Jordan,Phelps et al.1987；Sibonqa,Evans et al.1996)。

应当指出的是，骨密度降低并不是与骨强度下降有关的唯一异常。因此，分析不同化合物和治疗诱导的骨代谢的生化参数的改变，以获得更多其作用的认识是重要的(表2)。

特别重要的是，DHEA和阿考比芬联合疗法在生化重要常数的骨生成上有未预期的有益效果。事实上，单独使用DHEA不会影响尿羟脯氨酸/肌酐比值，骨吸收标记。进一步而言，在每日血钙或磷排泄上无法侦测DHEA的效果(Luo,Sourla et ai.1997)。EM-800(阿考比芬的前药，游离盐)减少48％尿羟脯氨酸/肌酐比值，而与DHEA相似，EM-800(阿考比芬的前药，游离盐)对于血清碱性磷酸酶活性没有影像，骨生成标记，而DHEA则增加此数值75％(Luo.Sourla et al.1997)。

一未预期的效果是DHEA及EM-800的联合疗法相关的尿羟脯氨酸/肌酐比值，是骨吸收标记，当DHEA及EM-800联合施用时，其减少了69％，这数值与单独使用EM-800的48％抑制单独使用DHEA则没有效果，这在统计学上有差异(p<0.01)。因此，增加DHEA至EM-800在骨吸上增加了50％EM-800(阿考比芬的前药，游离盐)的抑制效果。最重要的是，另一增加DHEA至EM-800未预期的效果分别是尿钙的减少(从23.17±1.55至3.71±0.75μmmol/24h/100g(p<0.01))以及55％尿磷的减少(从132.7±6.08至59.06±4.76μmmol/24h/100g(p<0.01))(Luo,Sourla et ai 1997)。

重要的是，阿考比芬和DHEA对去卵巢老鼠的12个月的联合治疗对骨形态具有有利影响。骨小梁体积对于骨骼强度特别重要，并且防止骨折(图7)。因此，在上述研究中，单独以DHEA治疗，在去卵巢老鼠中胫骨骨小梁体积从4.1±0.7％增加到11.9±0.6％(p<0.01)，而加入EM-800至DHEA进一步增加骨小梁体积至14.7土1.4％，此数值与完整的对照组相近(图7)。

在去卵巢老鼠的0.57±0.08每mm的数值中，以DHEA治疗相较于去卵巢对照组增加了137％骨小梁数量(图8)。DHEA的刺激效果达到1.27±0.1每mm，而同时以EM-800及DHEA的治疗相较于单独使用DHEA则额外增加了28％(p<0.01)的骨小梁数量(图8)。同样地，加入EM-800至DHEA的治疗导致额外15％(p<0.05)骨小梁间距的减少，相较于单独使用DHEA，从而导致这数值与完整的对照组没有差异。

作为补充在图7和8提出的数字数据，图9说明了在卵巢切除处理动物DHEA诱导的在胫骨干骺端骨小梁体积的增加(C)与卵巢切除对照组(B)的比较，以及在加入氟他胺(氟他胺)至DHEA治疗后，DHEA刺激效果的部分抑制(D)。另一方面，与EM-800一起施用DHEA则会完全防止卵巢切除引发的骨量减少(E)，其骨小梁体积则与完整的对照组(A)相当。

表2

表3

单独以脱氢表雄酮(DHEA)治疗或与氟他胺(flutamide，FLU)或EM-800共同施用12个月对于骨标志物和血脂的影响

*p<0.05；**p<0.01，实验相对于OVX对照组

在骨形态上，DHEA的刺激作用对雄激素组分的重要性由DHEA在骨形成和骨吸收的影响上得到支持。血清碱性磷酸酶的浓度，骨形成的标志(Lauffenburqer,Olah et al.1977；Meunier,Sajson et al.1987)从OVX对照组的51±4IU/L增加至DHEA-治疗动物的201±25IU/L，亦即展示了对DHEA在骨生成上的刺激效果(表3)。FLU在此参数上反转DHEA了65％的刺激效果，而EM-800则无明显效果。另一方面，因为胶原降解期间释放的羟脯氨酸并未在胶原蛋白的合成再次利用，这是胶原代谢或破骨细胞骨吸收的一个有用的标志。在本研究中，尿羟脯氨酸/肌酐比值从对照组的11.7±1.2μmol/mmol减少至DHEA-治疗老鼠的7.3±1.0μmol/mmol(p<0.05)(表3)。在此参数上施用FLU完全防止了DHEA的抑制效果，而EM-800则在统计学上对于DHEA没有任何显着的影响效果。

进一步而言，血清胆固醇透过DHEA治疗，通过联合治疗与单纯抗雄激素FLU中和的效果，而从2.29±0.16至1.78±0.16mmol/l减少22％。另一方面，添加纯抗雌激素EM-800进一步降低血清胆固醇至0.63±0.09mmol/l(p<0.01)，而达到65％的抑制效果。在血清甘油三酯水平方面，在任何使用的治疗中并未观察到统计上明显的改变。

有趣的是，EM-800(阿考比芬(acolbifene)的前药，游离盐)对血清胆固醇的强效抑制效果不会被同时治疗的DHEA阻止(Luo.Sourla et al.1997)。

松质骨的强度和随后的断裂阻力不仅取决于松质骨的总量也对小梁微结构，如由数量、尺寸和小梁的分布确定。失去卵巢功能的绝经后妇女伴随着总骨小梁体积显着的降低(Melsen,Melsen et al.1978；Kleerekoper,Villanueva et al.1985)，主要是数量的减少，并且在程度较轻下，小梁宽度的减少(Weinstein and Hutson 1987)。

为了便于本发明的组合疗法，任何本处所表示的内容，本发明考虑包含单独的SERM及性类固醇前体的药物组合物以同时施用。组成物可以是适于施用的传统方式，包含但不限于为口服施用、皮下注射、肌内注射或经皮给药。在其他实施例中，提供了包含单独或在同一容器内的一或多种SERM及性类固醇前底的试剂盒。试剂盒可包括适用合于口服给药的材料，例如片剂、胶囊剂、糖浆剂等，和用于经皮给药的材料，例如，软膏、洗剂、凝胶、乳膏、缓释贴片等。

申请人认为，SERM或抗雌激素及性类固醇前体的施用在治疗及/或降低上述症状上有效用。本发明的活性成分(无论为SERM、抗雌激素或前体或其他)可以制成并以不同方式施用。根据本发明，当一起施用时，活性成分可以同时或者分开的施用。

较佳的，透皮或黏膜的活性成分为0.01％至5％的DHEA或5-二醇。

SERM可以经皮施用代表阿考比芬类似物在子宫重量上拮抗雌二醇刺激相当的功效，无论阿考比芬类似物是以口服或者经皮给药予老鼠(图16)。

当配制成软膏剂、乳液、凝胶、乳膏、或栓剂或类似物，活性化合物与合适的载体混合，其可兼容于人的皮肤或粘膜，并且增强所述化合物透过皮肤或黏膜的经皮或经粘膜的渗透。合适的载体是本领域所熟知的，并且包含但不限于为Klucel HF and Glaxal base。一些是商业上可得的，例如Glaxal base可购自Glaxal Canada Limited Company。其他合适的媒介物可见Koller and Buri,S.T.P.Pharma(Koller and Buri 1987)。较佳的，在所使用的浓度下活性成分在环境温度是可溶于载体。载体有足够的黏性来将抑制剂维持在组成物施用的皮肤或粘膜的局部区域，而足够的时间下不会运行或蒸发而可允许前体实质性的穿过皮肤或粘膜的局部区域并进入血流，其所造成所希望的临床效果的地方。体通常是几种组分的混合物，例如药学上可接受的溶剂和增稠剂。有机和无机溶剂的混合物可以帮助亲水和亲脂的溶解性，例如水和醇类，例如乙醇。

当作为胚珠或直肠栓剂或类似配制，活性化合物与这与人类的直肠黏膜兼容的合适的载体混合。较佳的载体是硬脂肪(饱和脂肪酸甘油酯的混合物)，特别是的Witepsol，以及专门的Witepsol H-15基(购自Medisca,Montreal,Canada)。可以使用任何其它亲脂性基，如Fattibase、Wecobee、可可脂、可可油或的Witepsol基的其他组合。

较佳的性类固醇前体是脱氢表雄酮(DHEA)(可以购自例如Proquina,Orizaba,Veracruz,Mexico)。

所述载体还可以包括在化学以及医学领域中各种用在软膏剂，洗剂和栓剂的添加剂。例如，可以存在香料、抗氧化剂、香料、胶凝剂、增稠剂，例如羧甲基纤维素、表面活性剂、稳定剂、润肤剂、着色剂和其它类似试剂。

根据本发明的治疗，其适用于无限期延续。SERM、抗雌激素化合物及性类固醇前体可以透过口服路径施用，并且可以用传统药学赋形剂制造成片剂或胶囊以口服给药，例如喷雾干燥的乳糖、微晶纤维素及硬脂酸镁。

活性物质可以通过与固体粉状载体物质混合加工成片剂或糖衣丸芯，如柠檬酸钠、碳酸钙或磷酸二钙，且粘合剂例如为聚乙烯吡咯烷酮、明胶或纤维素衍生物，可能也增添润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠、"Carbowax"或聚乙二醇。当然，在口服形式的情形下，也可以加入口味改善物质。

进一步的形式，人们可以使用插塞胶囊，例如硬明胶以及封闭软胶囊，其包括软化剂或增塑剂，例如甘油。较佳的，插塞胶囊含有粒状形式的活性物质，例如与填料混合，如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉，如马铃薯淀粉或支链淀粉、纤维素衍生物或高度分散的硅酸。在软明胶胶囊，较佳的，活性物质溶解或悬浮在合适的液体，如植物油或液体聚乙二醇。

乳液、软膏、凝胶或乳膏应该彻底搓揉进入皮肤，而无清楚可见的多余部分，并且在大部分的经皮渗透发生前不应清洗此区域的皮肤，较佳的是至少4小时，并且更加的是至少6小时。

根据习知技术，经皮贴剂可以用来传递前体。这通常是应用在较长的时间，例如1至4天，但其一般语活性成分接触一较小的表面积，以令活性成分的传送缓慢而恒定。

本发明已经发展并且有多个经皮传药系统正在使用，其适于用来传递活性成分。释放率通成是由基质扩散或者是控制膜中的活性成分的通道所控制。

在机械方面，经皮装置是本领域所熟知的，并且例如在美国专利5,162,037,5,154,922,5,135,480,4,666,441,4,624,665,3,742,951,3,797,444,4,568,343,5,064,654,5,071,644,5,071,657中所描述，这些揭露内容通过引用并入本文。其他的背景技术由欧洲专利European Patent 0279982以及英国专利申请British Patent Application2185187提供。

装置可以是本领域所熟知的任何一般型态，包含粘合剂基质和贮库型透皮传送装置。装置可以包含含药基质结合纤维，其溪熟活性组分及/或。在储型器件，储存件可以由载体和活性成分不可渗透的高分子膜所定义。

在经皮装置，装置本身将活性成分与所想要的局部皮肤表面接触。在这装置中，载体对于活性成分的粘性相较于乳膏或凝胶则较少关注。经皮系统的溶剂系统可以包含，例如油酸、直链醇乳酸和二丙二醇或其它本领域所熟知的溶剂系统。活性成分可以溶解于或着悬浮于载体。

为了固定到皮肤上，经皮贴剂可以安装在中间打孔的外科胶带上。粘合剂较佳的由剥离衬垫覆盖，以使用前保护。一般适于释放的材料包含聚乙烯和涂布聚乙烯的纸，并且较佳的是涂布聚硅氧烷以便于移除。为了应用此装置，简单地剥离衬里并且粘合剂附着到患者的皮肤。在美国专利United States Patent 5,135,480中，此揭露内容通过引用并入本文，并且描述了具有非黏合手段已将装置确保于皮肤的替代设备。

只有SERM、抗雌激素和性类固醇前体是必须依照此方式以足够让血液血清的每一浓度达到所欲水平的剂量施用。根据本发明的联合治疗，SERM的浓度是维持在所欲的参数内，并且性类固醇前体的浓度是维持在所欲的参数内。

一较佳的性类固醇前体是DHEA，即使如以下所述DEHA-S及其类似物根据下述理由是特别有效的。

本发明的选择性雌激素受体调节剂具有以下特征的分子结构：a)间隔1至2的居间碳原子的两个芳香环，两个芳香环被羟基或在体内转化成羟的基团取代或未取代；以及b)具有芳香环及三级胺功能或其盐类的支链。

本发明一较佳的SERM是阿考比芬(acolbifene):

阿考比芬(acolbifene)(又称作EM-652.HCl；EM-1538)是强大的抗雌激素EM-652的盐酸盐。这揭露于美国专利US patent 6,710,059 B1。另一较佳的SERM是拉索昔芬(Lasofoxifene)(Oporia；CP-336，156；(-)-cis-(5R,6S)-6-phenyl-5-[4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-ol,D-(-)-tartrate salt)(可从Pfizer Inc.,USA获得)。

另一个较佳的抗雌激素是Wyeth Ayers(USA)发展的巴多昔芬(Bazedoxifene)(TSE 424；WAY-TSE 424；WAY 140424；1-[[4-[2-(hexahydro-1H-azepin-1-yl)ethoxy]phenyl]methyl]-2-(4-hydroxy phenyl)-3-methyl-1H-indol-5-ol，acetate)，其也揭露于JP10036347(美国家用产品公司)并且被美国批准用于预防绝经后骨质疏松以及WO 97/32837描述的非类固醇雌性激素衍生物。本发明其他较佳的SERM包含他莫西芬(Tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethanamine)(可从Zeneca,UK取得)、托瑞米芬(Toremifene)((Z)-2-[4-(4-Chloro-1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethanamine))(可从Orion,Finland取得，商标为Fareston or Schering-Plough)、Eli Lilly and Co.,USA的屈洛昔芬(Droloxifene)((E)-3-[1-[4-[2-(Dimethylamino)ethoxy]phenyl]-2-phenyl-1-butenyl]phenol)、雷洛昔芬(Raloxifene)(([2-(4-hydroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-methanone hydrochloride))、LY 335124、LY 326315、LY335563(6-hydroxy-3-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenoxyl]-2-(4-hydroxyphenyl)benzo[b]thiopene hydrochloride)和阿佐昔芬(Arzoxifene)(LY 353381,6-hydroxy-3-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenoxyl]-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenehydrochloride)。其他较佳的SERM是艾多昔芬(Idoxifene)((E)-1-[2-[4-[1-(4-lodophenyl)-2-phenyl-1-butenyl]pheno xy]ethyl]pyrrolidine)(SmithKlineBeecham，USA)、左美洛昔芬(Levormeloxifene)(3，4-trans-2，2-dimethyl-3-phenyl-4-[4-(2-(pyrrolidin-1-yl)ethoxy)phenyl]-7-methoxychroman)(Novo Nordisk，A/S，Denmark)，其揭露于Shalmi et al.WO 97/25034、WO 97/25035、WO 97/25037、WO 97/25038；及Korsgaard et al.WO 97/25036、GW5638(如Willson et al.，1997所述)及吲哚衍生物(如Miller et al.，EP 0802183A1所揭露)。还包含Taiho(Japan)的Iproxifen磷酸二氢(E)-4-[1-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-[4-(1-甲基乙基)苯基]-1-丁烯基]苯酚(TAT 59；(E)-4-[1-[4-[2-dimethylamino)ethoxy]phenyl]-2-[4-(1-methylethyl)phenyl]-1-butenyl]phenol dihydrogen phosphate)、Orion-Farmos Pharmaceutica,Finland的奥培米芬(Ospemifene)(FC 1271；((Z)-2-[4-(4-chloro-1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxyl]ethanol)、Sanofi-Aventis(France)的SERM 3471、HMR 3339及HMR3656、Wyeth-Ayers发展的哌喷昔芬(pipendoxifene)(ERA 923)、WO 97/3283所述的非类固醇雌激素的衍生物、QuatRx(USA)发展的非培米芬(Fispemifene)及美国Celgene发展的CC8490。

如制造商推荐的，任何根据所需功效使用的SERM都可以使用。适当的剂量是所属技术领域所熟知的。根据本发明，可以使用任何其他商用非固醇类抗雌激素。任何具有与SERM相似活性(范例：雷洛昔芬(Raloxifene)可以使用)。

根据本发明，当使用口服施用时，对平均体重的人而言，SERM施用的较佳剂量是每天0.01至5mg/kg体重(较佳的，0.1至1.0mg/kg)，与以每天5mg/kg，特别是每天10mg/kg分成二等分，或者是当使用肠胃施用(即肌内，皮下或经皮给药)时，对平均体重的人而言，SERM施用的较佳剂量是每天0.003至3.0mg/kg体重(较佳的，0.015至0.3mg/kg)，与以每天1.5mg/kg，特别是每天3.0mg/kg分成二等分。较佳的，SERM是以如下所述药学上可接受的稀释剂或载体一起施用。

本发明的一个较佳的抗雌激素是氟维司群(fulvestrant)(法洛德(Faslodex)；ICl 182 780；7a-[9-(4,4，5,5,5-pentafluoro-pentylsulphinyl)nonyl]oestra-1,3,5(10)-triene-3,17p-diol)，其每月以250mg的剂量肌内施用，其可自AstraZenecaCanadaInc.,Mississauga,Ontario,Canada获得。其他较佳的抗雌激素是ScheringAG,Germany的SH646。

对于本文所建议的所有剂量，主治医师应监测患者个体回应，并相应地调整剂量。

示例

示例1

本发明优选化合物的合成的示例。

阿考比芬(acolbifene)(S)-(+)-7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2”’-哌啶子基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐(((S)-(+)-7-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4，，-(2"′-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyranhydrochloride)，EM-01538,(EM-652.HCl)的合成

流程1

步骤A(StepA):BF₃ Et₂O、甲苯；100℃；1小时。

步骤C(Step C):3,4-二氢吡喃(3,4-dihydropyran)、对甲苯磺酸一水合物(p-toluenesulfonic acid monohydrate、乙酸乙酯；25℃氮气下、16小时，然后于异丙醇结晶。

步骤D,E.和F(StepsD,E.andF):

(1)哌啶、甲苯,Dean&Stark apparatus,氮气下回流；

(2)1,8-二氮杂双环[5,4,0]十一碳-7-烯(1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene),二甲基甲酰胺,回流3小时；

(3)CH₃MgCl,四氢呋喃,-20至0℃然后室温24小时；

步骤G.H(Steps G.H):(1S)-(+)-10-樟脑磺酸((1S)-(+)-10-camphorsulfonicacid)、丙酮、水、甲苯,室温,48小时。

步骤HH(StepHH):95％乙醇,70℃,然后室温3天。

步骤HHR(StepHHR):母液及步骤HH洗液的回收

(S)-10-樟脑磺酸((S)-10-camphorsulfonic acid),回流；36小时,然后室温16小时。

步骤I(StepI):

(1)二甲基甲酰胺(DMF aq.)、碳酸钠(Na₂CO₃)、乙酸乙酯(ethyl acetate)；

(2)乙醇、稀释HCl；

(3)水。

2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2′–(4”-四氢吡喃基氧基苯基)乙酰苯(2-tetrahydropyranyl oxy-4-hydroxy-2′-(4"tetrahydropyranyl oxy phenyl)acetophenone)(4)的合成。2,4-二羟基-2′–(4”-羟基苯基)乙酰苯3(97.6g,0.4mole)(可购自Chemsyn Science Laboratories,Lenexa,Kansas)的悬浮液在3,4-二氢吡喃(218mL,3.39mole)和乙酸乙酯(520mL)下于约25℃以对甲苯磺酸一水合物(0.03g,0.158mmole)处理。在氮气以及无外界加热下搅拌反应混合物约16小时。然后以碳酸氢钠(1g)及氯化钠(5g)水溶液(100mL)清洗混合物。分层并且以盐水(20mL)清洗有机层。每一清洗后再以50mL乙酸乙酯萃取。合并所有的有机层并且通过硫酸钠过滤。在常压下移除溶剂(约600mL)，并且加入异丙醇(250mL)。在常压下蒸除加入的溶剂(约275mL)，并且加入异丙醇(250mL)。将溶液冷却并搅拌至25℃，然后在约12小时候，过滤结晶的固体，以异丙醇清洗并干燥。

4-羟基-4-甲基-2-(4′-[2“哌啶子基]-乙氧基)苯基-3-(4”’-四氢吡喃基氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基苯并二氢吡喃(10)(4-hydroxy-4-methyl-2-(4′-[2"-piperidino]-ethoxy)phenyl-3-(4′"-tetrahydropyranyl oxy)phenyl-7-tetrahydropyranyloxy-chromane)(10)的合成。2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2′–(4”-四氢吡喃基氧基苯基)乙酰苯(2-tetrahydropyranyl oxy-4-hydroxy-2′-(4"tetrahydropyranyl oxyphenyl)acetophenone)4(1kg,2.42mole)、4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲醛(4-[2-(1-piperidino)ethoxy]benzaldehyde)5(594g,2.55mole)(可从available from Chemsyn ScienceLaboratories,Lenexa,Kansas获得)及哌啶(82.4g,0.97mole)(可从Aldrich ChemicalCompany Inc.,Milwaukee,Wis.获得)的溶液在氮气下以Dean&Stark apparatus于甲苯(8L)回流直到收集到一当量的水(44mL)。透过常压蒸馏从溶液中移除甲苯(6.5L)。加入二甲基甲酰胺甲苯(6.5L)及1,8-二氮杂双环[5.4,0]十一-7-烯(110.5g,0.726mole)。在常温下溶液搅拌约8小时，以将chalcone 8异构化成chalcone 9，并且加入水及冰(8L)及甲苯(4L)。分层并且以水(5L)清洗甲苯层。合并的洗涤水用甲苯(3×4L)萃取。合并的甲苯萃取液以盐水(3x 4L)清洗并且在常压下浓缩至5.5L，接着冷却至^-10℃。在持续透过通入外界氮气冷却以及搅拌下，加入3M的氯化甲基镁THF(2.5L,7.5mole)(可从Aldrich ChemicalCompany Inc.,Milwaukee,Wis.获得)溶液，维持在低于0℃。待加入所有的Grignard试剂，移除外界冷却并且让溶液回温至室温。混合物在此温度下搅拌24小时。混合然后冷却至约-20℃并且持续外界冷却以及搅拌，缓慢加入饱和氯化铵溶液(200mL)，温度维持在低于20℃。混合物搅拌2小时然后加入饱和氯化铵溶液(2L)以及甲苯(4L)并且搅拌5分钟。分层并且以甲苯萃取水层(2x4L)。合并的甲苯萃取液以稀释的盐酸清洗直到溶液成为匀相，然后以盐水清洗(3x4L)。甲苯溶液最后在常压下浓缩至2L。直接用于下一步骤。

(2R，S)-7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2”′-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(±12)((2R，S)-7-hydroxy-3-(4’-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4"-[2”’-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran(1S)-10-camphorsulphonicacid salt(±12))的合成。(2R,S)-7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-4-甲基4-羟基-4-甲基-2-(4′-[-2”-哌啶子基]-乙氧基)-苯基-3-(4”’-四氢丙炔氧基(苯基-7-四氢吡喃氧基苯并二氢吡喃(4-hydroxy-4-methyl-2-(4′-[-2"-piperidino]-ethoxy)-phenyl-3-(4"’-tetrahydropropynyloxy)phenyl-7-tetrahydropyranyl oxychromane)(10)的甲苯溶液加入丙酮(6L)、水(0.3L)以及(S)-10-樟脑磺酸(561g,2.42mole)(可从Aldrich Chemical Company Inc.Milwaukee Wis获得)，混合物在氮气下搅动48小时，然后过滤(2R,S)-7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2”’-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃(1)-10-樟脑磺酸盐((2R,S)-7-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4"-[2′"-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-benzopyran(1S)-10-camphorsulphonicacidsalt)(12)固体，以丙酮清洗并干燥(883g)。此材料在为纯化下用于下一步骤(HH)。

(2S)-7-羟基-3-4′-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2”’-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(13,(+)-EM-652(1S)-CSA盐)((2S)-7-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4"-[2"′-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran(1S)-10-camphorsulphonic acidsalt(13,(+)-EM-652(1S)-CSAsalt))的合成。(2R，S)-7-羟基-3-(4′-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2”’-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃(1)-10-樟脑磺酸盐((2R，S)-7-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4"-[2′"-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-benzopyran(1S)-10-camphorsulphonicacidsalt)±12的悬浮液(759g)于乙醇中加热搅拌至70℃直到固体溶解。溶液冷却搅拌至室温，然后加入少数晶种(2S)-7-羟基-3-(4’羟苯基)-4-甲基-2-(4”-[2”’-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1)-10-樟脑磺酸盐((2S)-7-hydroxy-3-(4’-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4”-[2”’-piperidino]ethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyran(1S)-10-camphorsulphonic acidsalt)13。溶液在室温下搅拌共3天。过滤晶体，以95％乙醇清洗并且干燥(291g,76％)。产物de为94.2％并且纯度为98.8％。

(S)-(+)-7-羟基-3-(4'-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2”’-哌啶子基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐(((S)-(+)-7-hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)-4-methyl-2-(4,,-(2"'-piperidinoethoxy)phenyl)-2H-1-benzopyranhydrochloride)，EM-01538,(EM-652.HCl)的合成。化合物13(EM-652-(+)-CSA盐,500mg,0.726mmol)的悬浮液在二甲基甲酰胺(11μL,0.15mmol)以0.5M碳酸钠水溶液(7.0mL,3.6mmol处理，并且搅拌15分钟。悬浮液以乙酸乙酯(7.0mL)处理并且搅拌4小时。有机相使用饱和碳酸钠水溶液(2x5mL)以及盐水(1x5mL)清洗，以硫酸镁干燥，浓缩。乙醇(2mL)中所产生的粉红色泡沫(EM-652)的溶液以2当量的盐酸(400μL,0.80mmol)处理，搅拌1小时，使用蒸馏水(5mL)处理，并且搅拌30分钟。过滤所得到的悬浮液，使用蒸馏水(5mL)清洗，在空气以及高真空(65℃)下干燥，获得乳脂状粉末(276mg,77％)。精致灰白色粉末；ScanningCalorimetry:熔点发生在219℃,ΔH＝83J/g；[α]²⁴ _D＝154°于10mg/mL甲醇；¹H NMR(300MHz(CD₃OD)δ(ppm)1.6(broad,2H,H-4”’)，1.85(broad,4H,H-3””and5””),2.03(s,3H,CH₃),3.0and 3.45(broad,4H,H-2””and6””),3.47(t,J＝4.9Hz,2H,H-3’”),4.26(t,J＝4.9Hz,2H,H-2”’),5.82(s,1H,H-2),6.10(d,J＝2.3Hz,1H,H-8),6.35(dd,J＝8.4,2.43Hz,1H,H-6),6.70(d,J＝8.6Hz,2H,H-3',and H-5'),6.83(d,J＝8.7Hz,2H,H-3”and H-5"),7.01(d,J＝8.5Hz,2H,H-2’and H-6’),7.12(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),7.24(d,J＝8.6Hz,2H,H-2”and H-6”)；¹³CRMN(CD₃OD,75MHz)δppm14.84,22.50,23.99,54.78,57.03,62.97,81.22,104.38,109.11,115.35,116.01,118.68,125.78,126.33,130.26,130.72,131.29,131.59,134.26，154.42,157.56,158.96,159.33.元素组成:C,H,N,Cl:理论；70.51,6.53,2.84,7.18,％,实际:70.31,6.75,2.65,6.89％。

示例2

材料及方法

动物

体重18-20g的雌性BALB/c老鼠(BALB/cAnNCrlBR)从Charles-River,Inc.(St-Constant，Quebec，Canada)获得，并且以每笼5只安置在控制的环境(温度(23±1℃)及光照(12小时光照12小时黑暗，在07:15开灯))。老鼠自由采食喂食啮齿动物食物和自来水。在异氟烷麻醉下通过双边侧面切口将动物切除卵巢(OVX)并随机分配到10只动物的组别。十只老鼠保持完好作为对照。

治疗

在第一个实验中，测试的化合物(图17和18)，亦即EM-652 HCl(阿考比芬(acolbifene))、拉索昔芬(Lasofoxifene)(游离盐，活性和非活性消旋物)和雷洛昔芬(Raloxifene)每天以灌胃方式口服给药1、3或10μg/动物的剂量共9天，在卵巢切除2天后开始。在第二个实验中(表4)，TSE 424每天以灌胃方式口服给药1、3、10或30μg/动物的剂量共9天，在卵巢切除2天后开始。在二实验中，为了评价抗雌激素活性，在卵巢切除后5天开始施用雌酮(E₁,0.06μg,s.c.注射，每天2次)，并且施用共6天。化合物溶解于乙醇(4％最终浓度)并且施用于0.4％甲基纤维素。在9天内，完整及OVX对照组的老鼠则单独接受载体(4％乙醇-0.4％甲基纤维素)。在卵巢切除后11天，动物腹主动脉进行放血处死。子宫和阴道迅速解剖、称重，并保持在10％的缓冲福尔马林中，以用于进一步的组织学检查。

条文1:结果

实验1

如图17所示，每日口服施用1μg、3μg及10μg EM-652 HCl(阿考比芬(acolbifene))分别造成24％、48％及72％雌酮刺激子宫重量(对于所有剂量相较于对照组p<0.01)的抑制，而雷洛昔芬(Raloxifene)在相同剂量下则在此参数造成6％(NS)、14％(p<0.01)及43％(p<0.01)的抑制。另一方面，拉索昔芬(Lasofoxifene)(作为游离碱)在最低剂量下没有抑制效果，而其在每日3μg及10μg剂量下造成25％(p<0.01)及44％(p<0.01)雌酮刺激子宫重量的抑制。施用拉索昔芬(Lasofoxifene)的非活性消旋物在任何剂量下都没有抑制效果。

当化合物每日以1μg及10μg单独施用(缺乏雌酮)于被切除卵巢的老鼠，两个剂量下EM-652 HCl对于子宫重量没有显着的刺激效果，而拉索昔芬(Lasofoxifene)及雷洛昔芬(Raloxifene)则分别造成93％(p<0.01)及85％(p<0.01)子宫重量的刺激(图18)，这代表后者的雌性激素效果。相似的，EM-652HCl对于阴道重量没有显着的刺激效果(图18)，而拉索昔芬(Lasofoxifene)及雷洛昔芬(Raloxifene)则分别造成73％(p<0.01)及56％(p<0.01)阴道重量的刺激(图18)。另一方面，拉索昔芬(Lasofoxifene)的非活性消旋物对于子宫及阴道重量没有刺激效果。

实验2:

如表4所示，每日口服施用1μg、3μg、10μg或30μgTSE424分别造成12％(NS)、47％、74％及94％雌酮刺激子宫重量(对于3最高剂量vsE₁对照组p<0.01)的抑制。当化合物每日以3μg及30μg单独施用(缺乏雌酮)于被切除卵巢的老鼠，两个剂量下TSE 424对于子宫重量没有显着的刺激效果。

表4

增加TSE 424浓度口服施用至被切除卵巢的老鼠9天同时施用/不施用雌酮对子公众量的影响

示例3

骨质流失失，血脂和全身脂肪的预防效果

动物及治疗

在治疗开始，使用10-12周龄、体重约220-270克的雌性Sprague-Dawley老鼠(Crl:CD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant,Canada)。开始实验的至少1周前，将动物驯化的环境条件(温度：22±3℃；湿度：50±20％；12小时光照12小时黑暗，在07:15开灯)。动物单独饲养，并允许自由饮用自来水和认证的颗粒状啮齿动物饲料(Lab Diet5002,Ralston Purina,St-Louis，MO)。实验是根据CCAC指南实验动物护理和使用在由加拿大委员会动物护理(CCAC)以及协会评估和实验动物保健的认证(AAALAC)批准的动物设施进行。

在第一个实验中，154只老鼠每14只随机分配至11组，各自如下1)完整的对照组；2)OVX对照组；3)OVX+E₂(1mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+E₂+EM-652.HCl；6)OVX+脱氢表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCl；8)OVX+DHEA+E₂；9)OVX+DHEA+E₂+EM-652.HCl；10)OVX+GW 5638；11)OVX+E₂+GW 5638。在研究的第1天，各组的动物在异氟烷麻醉下进行双侧卵巢切除术(OVX)。DHEA以50％乙醇-50％丙二醇溶液局部施用于背部皮肤，而其他测试的化合物分别悬浮在0.4％甲基纤维素通过口服管饲法施用。治疗在研究的第2天开始，每天执行一次共3月。

在第二个实验中，132只老鼠每14或15之随机分配至9组，各自如下1)完整的对照组；2)OVX对照组；3)OVX+普力马林(Premarin)(0.25mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCI(2.5mg/kg)；5)OVX+普力马林+EM-652.HCI；6)OVX+TSE 424(2.5mg/kg)；7)OVX+普力马林+TSE 424；8)OVX+lasofoxifene(tartrate salt；racemate；2.5mg/kg)；9)OVX+普力马林+lasofoxifene。在研究的第1天，各组的动物在异氟烷麻醉下进行双侧卵巢切除术。测试的化合物分别悬浮在0.4％甲基纤维素通过口服管饲法施用。治疗在研究的第2天开始，每天执行一次共26周。在两个实验中，没有接收到测试品动物用单独的适当手段在同一时期进行处理。

骨密度测量

在治疗后3个月(实验1)或26周(实验2)，使用双能X线骨密度腰椎吸收仪(DEXA；QDR4500A，Hologic，Waltham，MA)及Regional High Resolution Scan software扫描异氟烷麻醉下的每只老鼠。测定骨密度腰椎(BMD)(椎骨L2至L4)和总体组合物(脂肪百分比)。

血清试验

在治疗后3个月(实验1)或26周(实验2)，从禁食过夜动物颈静脉收集血液样品(异氟烷麻醉下)。样品用于血清制备并且在-80℃下冻结直至测定。血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性(ALP)利用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911Analyzer(Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)测定。

统计分析

数据表示为平均±SEM。统计学意义根据Duncan-Kramer{Kramer，1956#37421多重范围试验测定。

结果

如表5所示，在卵巢切除后3个月后，腰椎骨密度较完整对照组(P<0.01)较完整对照组(P<0.01)降低10％。在所用的剂量中，单独施用雌二醇和EM-652.HCl防止腰椎骨密度流失分别达98％(p<0.01)和65％(p<0.05)，而同时用E₂和EM-652.HCl治疗则防止OVX诱导的腰椎骨密度流失达61％(P<0.05)。另一方面，单独施用DHEA防止腰椎骨密度流失达43％(P<0.05)，而与DHEA+E₂+EM-652.HCl的联合治疗则防止OVX诱导的腰椎骨密度流失达91％并使得骨密度值与完整的对照组无差异。

在表6，在卵巢切除后26周后，腰椎骨密度较完整对照组(P<0.01)降低18％，单独施用EM-652.HCl、TSE 424和拉索昔芬分别防止腰椎骨密度损失54％、62％、49％和61％(P均<0.01vs OVX对照)。加入普力马林至EM-652.HCl、TSE424和拉索昔芬的腰椎骨密度损失并未与单独施用这些SERM的值有明显差异(表6)。类似地，加入DHEA至E₂或EM-652。盐酸.HCl完全防止的OVX引起腰椎骨密度的下降(表5)。DHEA对骨密度的积极效果也通过其对血清碱性磷酸酶活性效应得到支持(ALP)，在DHEA、DHEA+EM-652.HCl、DHEA+E₂-和DHEA+E₂+EM-652.HCl中的骨形成标记和ALP活性翻转分别从OVX对照动物的73±6IU/L增加至224±18IU/L、290±27IU/L、123±8IU/L和61±20IU/L(全部p<0，01)，从而表明DHEA对骨形成(表7)有刺激作用。

除了对骨损失的预防效果，施用EM-652.HCl、TSE424、拉索昔芬、GW5638、DHEA和E₂对总的身体脂肪比例和血脂一些有益的作用。卵巢切除后三个月后，身体的总脂肪增加了22％(P<0.05；表7)。施用EM-652.HCl完全防止了OVX诱导的脂肪率增加，而加入DHEA及/或E₂至SERM则导致脂肪比率值低于完整的对照动物所观察到的。卵巢切除后26周后，在施用普力马林、EM-652.HCl、TSE 424或拉索昔芬则将雌性激素缺乏诱导的40％的脂肪增加分别逆转为74％、78％、75％和114％，而加入普力马林至SERM则完全预防OVX诱导的脂肪增加。

如表7所示，卵巢切除后三个月后，观察到OVX对照组老鼠的血清胆固醇水平较完整的对照组(P<0.01)增加了22％。事实上，血清胆固醇从在完整的动物的2.01±0.11mmol/L增加至OVX对照的2.46V0.08mmol/L。单独施用E₂或DHEA分别降低血清胆固醇水平1.37±0.18mmol/L和1.59±0.10mmol/L，而单独施用EM-652.HCl或与E₂和/或DHEA组合施用导致胆固醇水平相较于完整的动物(2.01±0.11mmol/L)显着低级(间为0.65～0.96mmol/L)。同样地，GW5638、TSE424拉索昔芬(lasofoxifene)的单独或与E₂或普力马林组合施用完全防止对的OVX诱导的血清胆固醇水平的增加，并导致数值比在完整的动物中还低(表7和8)。

表5

在单独或联合以雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治疗去卵巢雌性老鼠3月对预防骨质流失的影响

*p<0.5；**p<0.01，实验相对于OVX对照老鼠

表6

在单独以普力马林、EM-652.HCl、TSE 424或拉索昔芬或和普力马林治疗去卵巢雌性老鼠26周对预防骨质流失的影响

p*<0.01，实验相对于OVX对照老鼠

表7

在单独或联合以雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治疗去卵巢雌性老鼠3月对身体脂肪比例、血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性的影响

*p<0.5；**p<0.01，实验相对于OVX对照老鼠

表8

在单独以普力马林、EM-652.HCl、TSE 424或拉索昔芬或和普力马林治疗去卵巢雌性老鼠26周对身体脂肪比例、血清胆固醇水平和碱性磷酸酶活性的影响

*p<0.5；**p<0.01，实验相对于OVX对照老鼠

示例4

在施用EM-652.HCl阿考比芬(acolbifene)、TSE 424及ERA-923单独及与DHEA于去卵巢雌性老鼠后对于骨丢失的预防效果

动物及治疗

在治疗开始，使用10-12周龄、体重约220-270克的雌性Sprague-Dawley老鼠(Crl:CD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。开始实验的至少1周前，将动物驯化的环境条件(温度：22±3℃；湿度：50±20％；12小时光照12小时黑暗，在07:15开灯)。动物单独饲养，并允许自由饮用自来水和认证的颗粒状啮齿动物饲料(Lab Diet5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。实验是根据CCAC指南实验动物护理和使用在由加拿大委员会动物护理(CCAC)以及协会评估和实验动物保健的认证(AAALAC)批准的动物设施进行。

126只老鼠每14只随机分配至9组，各自如下1)完整的对照；2)OVX对照；3)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；4)OVX+TSE-424(EM-4803，2.5mg/kg)；5)OVX+ERA-923(EM-3527，2.5mg/kg)；6)OVX+脱氢表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCI；8)OVX+DHEA+TSE-424；9)OVX+DHEA+ERA-923。在研究的第1天，各组的动物在异氟烷麻醉下进行双侧卵巢切除术(OVX)。DHEA以50％乙醇-50％丙二醇溶液局部施用于背部皮肤，而进行测试的SERM分别悬浮在0.4％甲基纤维素通过口服管饲法施用。治疗在研究的第2天开始，每天执行一次共5周。

骨密度测量

治疗5周后，异氟烷麻醉下使用双能X线骨密度扫描及Regional High ResolutionScan software每只老鼠的腰椎、股骨及胫骨(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)。测定骨密度腰椎(BMD)(L2椎体至L4)、股骨远端干骺端(DFM)和胫骨干骺端(PTM)。

统计分析

数据表示为平均±SEM。统计学意义根据Duncan-Kramer{Kramer,1956#37421多重范围试验测定。

如表9所示，5周卵巢切除后，卵巢切除对照动物的腰椎骨密度比完整对照减少9％。单独施用SERM：EM-652.HCl、TSE-424或ERA-923分别预防腰椎骨密度损失86％、53％及78％。另一方面，单独施用DHEA防止腰椎骨密度损失44％，而同时使用DHEA+EM-652.HCl、DHEA+TSE-424或DHEA+ERA-923完全阻止OVX诱导的腰椎骨密度损失，并导致并导致腰椎骨密度损失值均较完整的对照动物中所观察到的高。相似的结果可在腰椎骨密度损失94％、105％及105％。

卵巢切除5周后，股骨远端干骺端(DFM)的骨密度减少了10％(表9)。单独施用SERM：EM-652.HCl、TSE-424或ERA-923分别预防了股骨远端干骺端的骨密度的损失95％、70％及83％。另一方面，单独施用脱氢表雄酮防止股骨远端干骺端骨密度损失71％，而同时使用DHEA+EM-652.HCl、DHEA+TSE-424或DHEA+ERA-923完全阻止OVX诱导在远端干骺端的骨密度损失，并导致并导致DFM BMD值均较完整的对照动物中所观察到的高。相似的结果可在胫骨干骺端骨密度获得(表9)。

表9

在以5周SERM单独或与DHEA结合施用治疗后对于去卵巢雌鼠骨质流失预防的影响：EM-652.HCI、TSE-424及ERA-923

实验5

本发明化合物对人类子宫内膜腺癌Ishikawa细胞内碱性磷酸酶活性的影响

材料

储备细胞培养的维持

来自高分化子宫内膜腺癌源性人类Ishikawa细胞系由Erlio Gurpide博士提供，The Mount Sinai Medical Center,New York,NY。Ishikawa细胞系常规保持在Eagle氏最低必需培养基(MEM)，其含有5％(v/v)FBS(胎牛血清)和补充有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.1mM非必需氨基酸溶液。细胞在37℃下放置在Falcon T75烧瓶，密度为1.5x10⁶细胞。

细胞培养实验

在实验的开始24小时前，邻近汇合Ishikawa细胞系的培养基用新鲜的无雌激素基础培养基(EFBM)由1:1(v)的无酚红的Ham′s F-12和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)混合物，补充有用葡聚糖包被的活性炭处理两次100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和5％FBS以除去内源性类固醇。然后将细胞用0.1％胰酶(Sigma)和0.25mM的HEPES收集，再悬浮于EFBM并接种在Falcon96，以及在2.2×10⁴细胞/孔密度的100μL平底微量滴定板，并使其附着于板的表面24小时。此后，将培养基用含有终体积200μL化合物的所示浓度的新鲜EFBM取代。细胞培养五天，48小时后更换培养基。

碱性磷酸酶检测

在培养期结束时，倒置微滴定板，并且滗析生长培养基。将培养板通过孔以200μLPBS(0.15MNaCl,10mM磷酸钠,pH 7.4)润洗。然后从板移除PBS，小心留下一些残余的PBS，并再重复一次洗涤过程。然后将缓冲盐水倾析，并且反相板在纸巾轻轻吸干。然后更换盖，将培养板置于-80℃15分钟，随后在室温下解冻10分钟。然后将板置于冰上，并加入50μL含有5mM磷酸对硝基苯酯、0.24mMMgCl2和1M二乙醇胺(pH9.8)的冰冷溶液。然后将板加热到室温，并产生黄色的对硝基苯基(8分钟)。板以酶联免疫吸附试验板计数器(BIO-RAD，型号2550EIA计数器)在405nm侦测。

计算

剂量-反应曲线及IC50是透过加权迭代非线性最小平方回归计算。

表10

*％1nM E₂刺激＝

OD 405nm化合物基线/OD 405nm1nM E₂-OD 405nm化合物基线还请见Labrie etal.1999。

实验6

EM-652、HCl阿考比芬、TSE424及拉索昔芬对人类乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

方法:

储备细胞培养的维持

人类乳腺癌MCF-7细胞从美国典型培养物保藏中心#HTB22的传代147获得并且在不含酚红的Dulbecco氏改良Eagle′s-Ham的F12培养基、上述悬浮液和5％的FBS常规培养。上面的MCF-7人乳腺癌细胞系和5％FBS是来自一个白人69岁的女病人的胸腔积液。MCF-7细胞在传代148-165之间使用并且每周传代培养。

细胞增殖研究

在对数生长期后期的细胞用0.1％胰酶(Sigma)收集并再悬浮在含有50ng牛胰岛素/mL和5％(V/V)FBS的适当培养基，以葡聚糖涂覆的活性炭处理两次以内源性的类固醇治疗。细胞在24孔Falcon塑料培养板(2cm²/孔)在所指示的密度铺板并使其附着在板的表面72小时。此后，培养基用指定浓度的新鲜培养基替换，其含有在存在或缺乏E₂下从99％再蒸馏乙醇的1000×储备液稀释的化合物。控制细胞只有接收乙醇载体(0.1％的乙醇,v/v)。细胞在在指定的时间间隔培养，且每2天或3天更换培养基。细胞数量通过DNA含量测量来确定。

计算及统计分析

剂量-反应曲线及IC50是透过加权迭代非线性最小平方回归计算。所有结果是以平均±SEM表示。

表11

实验1

实验2

示例7

EM-652.HCl(阿考比芬)、他莫西芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬、GW-5638和雷洛昔芬对裸鼠中人类ZR-75-1乳腺癌生长的影响的比较

本示例的目的是比较EM-652.HCl和其他6种口服抗雌激素(SERM)在良好表征的性激素敏感的ZR-75-1乳腺癌移植瘤切除卵巢的裸鼠生长的激动和拮抗作用。

材料及方法

人类ZR-75-1乳腺癌细胞

从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)取得ZR-75-1人类乳腺癌细胞并且在不含酚红的RPMI-1640培养基培养。细胞补充了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100IU青霉素/mL，100μg链霉素/mL和10％(v/v)胎牛血清并且在37℃、95％/5％C0₂的空气/潮湿气氛培养。细胞每周传代并用0.083％胰酶/0.3mM EDTA在85-90％汇合收获。

动物和肿瘤接种

纯合型雌性nu/nu Br无胸腺小鼠(28-42日龄)从Charles River,Inc.(Saint-Constant,Quebec,Canada)获得。小鼠(每笼5只)被安置在装有空气过滤器盖的乙烯基笼中，其保持在层流气流罩并且维持在病原体限制性条件下维持。光照期间为12小时光照和12小时黑暗(在07:15开灯)。笼、寝具和食品(Agway Pro-Lab R-M-H Diet#4018)使用前高压灭菌。水以高压灭菌并使其自由摄取。在异氟烷诱导的麻醉下切除双侧卵巢。在卵巢切除时，雌二醇(E₂)的植入物插入皮下刺激初始的肿瘤生长。E₂以1厘米长包含0.5cm的1:10(w/w)雌二醇和胆固醇的混合物的硅橡胶管(内径:0.062英寸；外径:0.095英寸))准备。卵巢切除一周后，2×10⁶ZR-75-1(传代93)细胞通过2.5厘米长的22号针于每个卵巢切除(OVX)小鼠的两个侧腹部皮下接种0.1mLRPMI-1640的培养基+30％基质胶。四周后，在所有动物中，E₂植入物由相同尺寸(E₁：chol,1:25,w:w)含有雌酮的植入物取代。随机化和治疗则于一周后开始。

治疗

在治疗开始的前一天，有ZR-75-1肿瘤、平均面积24.4±0.4mm²(5.7mm²至50.7mm²)的255只老鼠随机分配至17组(关于肿瘤尺寸)，每一组别包含15只老鼠(总共29或30肿瘤)。17组中包含2对照组(OVX及OVX+雌酮)、7组补充雌酮植入物并与抗雌激素治疗而另外8组则单独接受抗雌激素。然后，卵巢切除对照组(OVX)以及单独接受抗雌激素得组别的雌酮植入物自动物分离。此后每6周变化其他含有含雌酮植入物的9组。EM-652HCl、雷洛昔芬、屈洛昔芬、艾多昔芬及GW 5638在肿瘤学和分子内分泌学研究中心的药物化学分部合成。他莫西芬从Plantex(Netanya,Israel)购买而托瑞米芬从Orion(Espoo,Finland)购买。在雌酮的刺激下，抗雌激素每天以口服50μg(平均2mg/kg)的剂量悬浮于0.2mL的0.4％(w/v)甲基纤维素。在缺乏雌酮的刺激下，每一抗雌激素动物以口服方式每日以200μg(平均8mg/kg)治疗。二对照组的动物单独接受0.2mL的媒介物。每个月制备适当浓度的抗雌激素悬浮液，储存于4℃并且在不断搅拌下使用。粉末库存在4℃(艾多昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、GW 5638、屈洛昔芬)或者在室温(他莫西芬、EM-652.HCl)被气密保存。

肿瘤测量和剖检

纪录二垂直的直径并且使用公式:L/2×W/2×π计算肿瘤面积。在治疗第一天量测的直径作为100％。

在治疗161天时，剩下的动物用异氟烷麻醉并放血处死。为了进一步表征雌性激素和抗雌激素的作用，立即从结缔组织和脂肪组织中取出并称重雌性激素-反应的组织，例如子宫和阴道。子宫是准备以Image Pro-Plus(Media Cybernetics,Maryland,USA)执行影像分析来评估子宫内膜厚度。简言之，子宫是固定在10％福尔马林并包埋于石蜡。分析老鼠子宫的苏木和曙红染色的切片。每一子宫分析4张影像(2/子宫角)。量测每一组别中所有动物的平均上皮细胞高度。

反应标准

若在实验过程中发生，肿瘤反应在研究结束或者动物死亡时评估。在这种情形下，对肿瘤反应分析而言，只有研究存活超过实验(84天)一半的老鼠的数据。简言之，完全消退即代表这些肿瘤在实验结束后无法侦测；部分消退则对应相对于其原始尺寸消退≥50％的肿瘤；稳定反应涉及消退≤50％或进展≤50％的肿瘤；且进展涉及相对于其原始尺寸进展≥50％的肿瘤。

统计分析

根据ANOVA重复测量从第1天至第161天总肿瘤表面积的变化进行分析。模型包含了治疗、时间及时间-治疗交互作用影响再加上说明随机化地层的样木。在161天，不同处理效果的重要性由此透过时间-治疗交互作用进行测试。残值分析说明原有规模的测量与ANOVA或任何尝试的转换的分析并不搭配。因此，级别被选来分析。对上皮厚度治疗的效果透过包含ANOVA还包括随机地层进行评估。使用最小二乘法的统计方法进行后验两两比较。总体1型误差率控制在5％以宣示的差异的重要性。所有计算是使用Proc MIXED在SAS软件(SAS Institute，Carry,NC)上执行。

结果

对ZR-75-1肿瘤成长的拮抗作用

在23周的治疗过程中，单独使用雌酮(OVX+E₁)会造成ZR-751-1肿瘤尺寸的增加(图19)。以每天50μg剂量施用纯抗雌激素EM而*HCl(阿考比芬(acolbifene))至雌酮刺激的老鼠则完全防止了肿瘤的成长。事实上，不只防止了肿瘤的成长，在治疗23周以后肿瘤尺寸较开始治疗的初始值减少26％(p<0.04)。以EM-652*HCl治疗所得到的数值与单独卵巢切除(OVX)后所观测者在统计上并无差别，其肿瘤尺寸较初始肿瘤尺寸减少61％。在相同剂量(50μg)及治疗期间下，其他六个抗雌激素并未较初始肿瘤尺寸减少。这些组别的肿瘤较OVX对照组及EM-652*HCl治疗组(p<0.01)明显的大。事实上，与预处理值相比，以屈洛昔芬(Droloxifene)、托瑞米芬(Toremifene)、GW 5638、雷洛昔芬(Raloxifene)、他莫西芬(Tamoxifen)及艾多昔芬(Idoxifene)治疗23周造成平均肿瘤尺寸分别较预处理值高478％、230％、227％、191％、87％及86％(图19)。

对ZR-75-1肿瘤成长的激动作用

在每天以200μg剂量的他莫西芬治疗161天后，在缺乏雌酮补充下，平均肿瘤尺寸增加到超过基线196％(p<0.01vs OVX)(图20)。另一方面，以艾多昔芬治疗的老鼠的平均肿瘤尺寸增加(125％)(p<0.01)而以托瑞米芬治疗的老鼠的平均肿瘤尺寸增加86％(p<0.01)(图20)。将200μgEM-652*HCl加至200μg他莫西芬完全抑制了单独使用他莫西芬所观察到的扩散(图15)。另一方面，在实验的最后，单独以EM-652.HCI(p＝0.44)、雷洛昔芬(p＝0.11)、屈洛昔芬(p＝0.36)或GW 5638(p＝0.17)治疗相较于OVX对照组并未明显改变ZR-75-1肿瘤的尺寸(图20)。

抗雌激素对于子宫内膜上皮细胞厚度的影响

子宫内膜上皮细胞的高度是以子宫内膜中每一化合物激动作用和拮抗作用最直接的参数量测。

在雌酮刺激下每日50μg抗雌激素对于子宫上皮细胞厚度的影响

在50μg的口服剂量下，EM-652*HCl(阿考比芬)抑制雌酮对上皮高度的刺激作用达70％。所测试的其他六个抗雌激素的有效性则明显较低(p<0.01)。事实上，屈洛昔芬、GW5638、雷洛昔芬、他莫西芬、托瑞米芬及艾多昔芬抑制雌酮的刺激达分别达17％、24％、26％、32％、41％及50％(表12)。

在缺乏雌酮刺激下每日200μg抗雌激素对于子宫上皮细胞厚度的影响在缺乏雌酮刺激下，EM-652*HCl及屈洛昔芬是上皮细胞高度的化合物(分别为114％及101％的OVX对照组值)。他莫西芬(155％)、托瑞米芬(135％)及艾多昔芬(176％)对子宫上皮高度有显着的刺激(p<0.01vs OVX对照组)(表12)。每一抗雌激素的激动作用和拮抗作用依据子宫上皮细胞厚度所观测的模式以子宫和阴道重量测量(未显示数据)。

表12

a,b实验对照OVX对照组老鼠:^aP<0.05；^bP<0.01

c,d实验对照EM-652HCl处理老鼠:^cP<0.05；^dP<0.01

示例8

¹⁴C-EM-800(20mg/kg)至雌鼠的单口服剂量后于脑中的放射性

示例8是老鼠在¹⁴C-EM-800(20mg/kg)的单口服剂量后的放射性，本发明的SERM。基于比较目的，其包含了这些动物的血液、血浆、肝及子宫的值(表14)。组织分布及¹⁴C-EM-800(20mg/2mL/kg)至雄性及雌性Long-Evans大鼠的单口服剂量后的排泄放射性。这些数字指出，在Long-Evans雌鼠中，源自药物的总放射性非常低(ng当量/g组织)并且在剂量12小时候未被侦测。在2小时的时候，脑中的放射性较肝低412、较子宫低21倍、较血液低8.4倍并且较血浆低13倍。因为未知比例的总脑放射性被血液放射性污染，表13中所显示的脑放射性值是高估的¹⁴C(EM-800)水平-脑本身相关的放射性。这些数据建议抗雌激素在脑中的水平过低，而无法抵消外源性雌性激素的影响。重要的是，脑组织中所侦测的部分放射性可归因于残留血液(表14)。另外，本研究所使用的¹⁴C-EM-800的放射性化学纯度最小为96.25％。

表13

表14

示例9

动物

从Charles-River,Inc.(St-Constant,Quebec,Canada)取得的约50日并且重18-20克雌性BALB/c老鼠(BALB/cAnNCrlBR)以4-5/笼收容在控制的环境下，其温度(23±1℃)以及光照(每日12小时光照，7:15开灯)。老鼠以自由采食啮齿动物饲料和自来水饲养。动物在全身麻醉(Avertin)下以双边侧面切口切除卵巢，并且随机分配至9-10动物的组。

治疗

每日一次以不同剂量，亦即0.75、2.5、7.5、25或75nmol化合物/灌胃或应用/动物，将CS-115-1(消旋EM-652)及EM-762(消旋EM-800)透过口服灌胃给药或局部应用于背部皮肤。在卵巢切除术后2天，开始以抗雌激素(0.2mL/鼠/灌胃或应用)治疗，而以雌酮治疗(0.06μg，皮下注射(s.c.)，每日两次)则于三天后开始(卵巢切除术后5天)。此后，雌酮及抗雌激素联合施用6天。对口服施用而言，化合物是溶解于50:50(vol/vol)聚乙二醇600(PEG-600)及乙醇，并且于1％(w/v)明胶-0.9％NaCl溶液施用(聚乙二醇600:乙醇的最终浓度为8％)，而对于经皮施用而言，化合物是溶解于50％乙醇-50％聚乙二醇。OVX对照组的老鼠在9天内接受口服的媒介物。在卵巢切除术后的第11天上午以颈椎脱位法(cervicaldislocation)处死动物。迅速解剖并称重子宫。

如图16所示，在口服或经皮途径施用阿考比芬衍生物后，可以观察到类似的效果。

药学组合物示例

如下所述，其是非限制的示例，是数个利用较佳的活性SERM阿考比芬(EM-652HCl；EM-1538)及较佳的活性性类固醇前体脱氢表雄酮(DHEA，普拉睾酮(Prasterone))的药学组合物。本发明其他化合物或其组合可以用来取代(或添加)阿考比芬或脱氢表雄酮。活性成分的浓度可以在本处所述的宽广范围内变化。其他本领域所熟知的成分的数量及种类可包含于此。

示例A

口服的药学组合物(胶囊)

示例B

口服的药学组合物(片剂)

示例C

局部给药(乳膏剂)

示例D

直肠给药

直肠栓剂或胚珠

DHEA栓剂是以Witepsol H-15base(Medisca,Montreal,Canada)制备。可以使用任何其他亲脂性基底，例如硬脂肪、Fattibase、Wecobee、可可脂、可可油或其他Witepsol基底的组合。较佳的SERM是EM-800及阿考比芬。

试剂盒示例

如下所述，其是非限制的示例，是数个利用较佳的活性SERM阿考比芬的试剂盒，较佳的抗雌激素是法洛德(Faslodex)及较佳的性类固醇前体是DHEA。活性成分的浓度可以在本处所述的宽广范围内变化。其他本领域所熟知的成分的数量及种类可包含于此。

示例D

试剂盒

SERM及性类固醇前体是口服给药

口服给药的SERM组合物(胶囊)

+

口服给药的DHEA组合物(明胶胶囊)

在上述配方中，其他SERM可用来取代阿考比芬，并且其他性类固醇前体可用来取代DHEA。多于一种SERM或多于一种前体可被包括在这种情况下，其总重量百分比较佳的是上述示例中的单一的前体或单一的SERM的重量百分比。

示例E

试剂盒

SERM是口服给药并且性类固醇前体是直肠给药

口服给药的SERM组合物(胶囊)

+

直肠栓剂

DHEA栓剂是以Witepsol H-15base(Medisca,Montreal,Canada)制备。可以使用任何其他亲脂性基底，例如硬脂肪、Fattibase、Wecobee、可可脂、可可油或其他Witepsol基底的组合。

示例F

试剂盒

SERM及性类固醇前体是直肠给药

直肠栓剂

+

直肠栓剂

阿考比芬栓剂是以硬脂肪(Witepsol)制备。可以使用任何其他基底，例如Fattibase、Wecobee、可可脂、可可油或其他硬脂肪的组合。

示例G

SERM是口服给药并且性类固醇前体是经皮给药

口服给药的SERM组合物(胶囊)

+

透皮给药的性类固醇前体组合物(凝胶)

或

透皮给药的性类固醇前体组合物(乳膏剂)

示例H

试剂盒

抗雌激素是肌肉注射并且性类固醇前体是口服给药

市售的类固醇抗雌激素法洛德(Faslodex)

+

口服给药的DHEA组合物(明胶胶囊)

在上述配方中，其他SERM(他莫西芬(tamoxifen)、奥培米芬(ospemifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、TSE-424、ERA-923、EM-800、SERM 3339、GW-5638)可用来取代阿考比芬，并且其他性类固醇前体可用来取代DHEA。多于一种SERM或多于一种前体可被包括在这种情况下，其总重量百分比较佳的是上述示例中的单一的前体或单一的SERM的重量百分比。

本发明是以较佳实施例及示例描述，但并不限于此。本领域的技术人员很容易地认识到本发明的更广泛的适用和范围，其仅限于本发明的权利要求。

建议

如Endocrine Society的指导(Bhasin,Cunningham et al.2006)所建议者，我们建议在治疗前，有可触及前列腺结节(palpable prostatic nodule)或硬结(nduration)或具有高于3ng/mL的血清PSA的男性进行进一步的泌尿系统评价。

相似的，治疗不建议用于患有红细胞增多症(erythrocytosis)的男性(红细胞压积(hematocrit)>50％)、未经治疗的阻塞性睡眠呼吸暂停、IPSS分数>19的重度未经治疗的良性前列腺增生症或不受控制的心脏衰竭。

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