连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途
阅读说明：本技术 连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途 (Linker, antibody conjugate drug containing linker and use of linker ) 是由 周辛波 王彦明 樊士勇 李松 钟武 肖军海 郑志兵 李行舟 肖典 谢云德 王晓奎 于 2018-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学领域,具体涉及式I所示的连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途,还涉及包含抗体偶联药物的药物组合物,还涉及这些抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。<Image he="223" wi="582" file="DDA0001768752400000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the field of medicinal chemistry, and particularly relates to a linker shown in a formula I, an antibody conjugate drug containing the linker, application of the linker, a pharmaceutical composition containing the antibody conjugate drug, and application of the antibody conjugate drug in treatment and/or prevention of diseases.)
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途，还涉及包含抗体偶联药物的药物组合物，还涉及这些抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。
背景技术
肿瘤依旧是人类目前主要的疾病死亡原因。新疗法的不断出现正在为肿瘤治疗带来颠覆性变革。近年来CAR-T细胞疗法以及PD-1/PD-L1抗体免疫疗法均取得了突破性进展，但是CAR-T细胞疗法适应症仅局限于血液瘤，而PD-1/PD-L1抗体免疫疗法客观应答率仅20～30％。对于大多数恶性肿瘤而言，治疗手段依然有限，仍需不断创新并拓展现有的疗法并形成合力。
近年来恶性肿瘤治疗策略逐渐从传统化疗转向基于抗体的靶向治疗，但总体来说，传统治疗手段仍为临床第一选择，化疗药以产品数量计仍占有最大的癌症治疗市场。小分子化疗药物由于其较差的靶向性和生物分布，易产生严重的毒副作用，导致患者依从性差，难以获得满意的临床收益。与化疗药物相比，单克隆抗体药物具有较好的靶向性和药代动力学性质，已在恶性肿瘤治疗中承担着日益重要的角色；但其也存在组织渗透能力差、生物活性偏弱及易产生耐药等不足。
在新药研发整体优质靶标严重缺乏的背景下，抗体偶联药物 (antibody-drugconjugate，ADC)的出现，实现了小分子化疗药与抗体优势的强强联合，目前已成为除肿瘤免疫疗法之外最有发展前景的方向之一。抗体偶联药物结构包括3个部分：抗体(antibody)、小分子细胞毒药物(cytotoxin)以及实现前两者有机组合的连接子(linker)。ADC利用抗体的靶向性将细胞毒药物聚集在肿瘤靶部位以实现增效减毒，释放的细胞毒药物可进一步通过旁观者效应杀死周边肿瘤细胞。细胞毒药物IC50通常为10-10～10-12mol/L，常见的多为微管蛋白抑制剂MMAE、DM1等。与常规化疗药相比，ADC治疗指数得以大大提升。
除基于抗体实现靶向药物递送，ADC另一大优势在于可在一定程度上克服使用单抗产生的继发耐药，ADC起效主要依赖细胞毒药物而非抗体，一定程度的肿瘤突变并不影响其靶向结合。如由单抗Herceptin和细胞毒药物DM1组成的ADC药物Kadcyla，仍可有效治疗Herceptin耐药后的 HER2+乳腺癌，且较标准疗法卡培他滨/拉帕替尼实质性延长总生存期(OS) 近6个月。另外，代号为MARIANNE、KAMILLA等临床Ⅲ期循证医学研究证实，Kadcyla单药药效不劣于标准疗法，且具有更好的安全性，该药现已被乳腺癌指南纳入一线可选抗HER2方案。ADC的特征是活性高、毒副作用小、作用时间长等，该类药物的出现为肿瘤的“精准治疗”提供了一种全新的策略。
在抗体这种生物大分子中，重链和轻链之间往往通过位置确定的二硫键进行连接。选择性还原抗体分子轻重链间的二硫键产生游离的巯基，已经被广泛用作抗体修饰位点，得到以抗体半胱氨酸残基为偶联位点的ADC 药物。其中，首个成功的上市ADC药物Brentuximab Vedotin
硫代琥珀酰亚胺结构被广泛的应用于ADC的连接子之中，目前最主流的两个ADC上市药物
尽管硫代琥珀酰亚胺具有显而易见的优势以及广泛的适用性，但多个生物偶联领域的研究者均意识到，硫代琥珀酰亚胺自发进行的逆迈克尔加成反应会导致将近一半的偶联物发生缓慢分解(图2)，从而导致毒素脱靶。上述不稳定性特征所引起的毒素脱靶，无疑会导致ADC药效的降低以及毒副作用的上升(Nature Biotech.,2014,32(10):1059-1062.；Nature Biotech.,2012,30(2):184-189.；Bioconjugate Chem.,2008,19(3):759-765.；Bioconjug Chem.,2016,27(7):1588-1598.；J Med Chem.,2014,57(19): 7890-7899.)。
在纯化和制备上述包含硫代琥珀酰亚胺的各类ADC的过程中，也时刻伴随着上述逆迈克尔加成反应。由于逆迈克尔加成反应产生的马来酰亚胺会再次与硫醇进行快速加成，所以该过程一般情况下是不可检测的。然而，当其他硫醇存在时，脱靶的马来酰亚胺即从ADC的抗体中转移到任何其他可用硫醇。该过程已经证实发生在血浆中，其中ADC的马来酰亚胺转移到血清白蛋白的34位半胱氨酸之上(Bioconjugate Chem.,2008, 19(3):759-765.)。当半胱氨酸或谷胱甘肽等巯基物质存在时，ADC也将发生上述毒素脱靶过程(NatureBiotech.,2012,30(2):184-189.)。
研究人员对硫代琥珀酰亚胺所致的ADC毒素脱靶问题早有察觉，世界多家制药公司也均致力于寻找方案以解决上述问题。ADC制药公司 Genentech的研究人员Junutula JR的研究结果表明：硫代琥珀酰亚胺结构发生逆迈克尔加成反应的同时，也会发生水解开环竞争反应，而水解开环反应得到的产物结构是稳定的，其在较长时间内并不会发生毒素脱靶 (Nature Biotech.,2012,30(2):184-189.，图3)。进一步的研究发现，开环结构的稳定性极高，其降解半衰期可长达2年之久(Bioconjug Chem., 2015,26(1):145-152.)。但是，Genentech的上述工作只是在体内药代水平进行了研究分析，其并没能制得该稳定性ADC产品。通过文献调研及我们进一步的试验结论均证实，该结构稳定型的接头开环型偶联产物是无法直接通过偶联制备得到的(Biochem J.,1979,179(1):191-197.)。
由琥珀酰亚胺结构导致的ADC不稳定性问题仍未得到有效的解决方案，且具有开环型接头的稳定型ADC的制备依旧存在着巨大挑战。辉瑞公司的L.Nathan Tumey尝试在碱性条件下加热实现上述ADC结构中琥珀酰亚胺的开环过程，从而得到开环产物以克服琥珀酰亚胺不稳定性导致的毒素脱靶(图4)。然而，在接近抗体等电点的碱性环境(pH＝9.2)中长时间(48h)加热(45℃)造成了抗体结构和性质的破坏，其中约70％的抗体发生天冬酰胺脱酰胺突变(Bioconjug Chem.,2014,25(10): 1871-1880.,)。该方法在用于ADC研发仍具有显著的不足和局限性。
Seattle Genetics的研究人员Lyon RP在琥珀酰亚胺基团附近引入分子内的氨基以诱导加速琥珀酰亚胺开环过程(Nature Biotech.,2014,32(10): 1059-1062.,图5)。然而，该策略给制备过程带来了多种不可控因素，结构的改变可能对终产品的分布、代谢、药动学以及药效产生多方面的影响；而且诱导开环结构制备工艺复杂，得到的新化学实体的成药性以及用药安全性需要进一步进行确证。
目前的研究中，依旧没有可以较好的替代硫代琥珀酰亚胺接头结构的理想选择。如何解决主流ADC普遍存在的由硫代琥珀酰亚胺结构所致的毒素脱靶问题，目前依旧存在巨大挑战。
发明内容
本发明的第一方面涉及式I或式I’所示化合物，或其盐、溶剂化物，
其中：
W为
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
L2为
L3为
R2选自：
R’2为卤素；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；
q为0或1；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；
p为0、1、2、3或4；
Y为选自以下的二肽形成的氨基酸残基：Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys， Val-Gly，Val-Thr，Val-Val，Val-Leu，Val-Ile，Val-Asn和Phe-Lys，其中N末端与羰基相连，C末端与N原子相连；
Z为-CH2-，-CH(CH3)-或-C(CH3)2-。
本发明的第二方面涉及式II或式II’所示化合物，或盐、溶剂化物，
其中：
W为
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；
B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*上；或者B 通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至L3；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
L2为
L3为
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；
q为0或1；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；
p为0、1、2、3或4；
Y为选自以下的二肽形成的氨基酸残基：Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys， Val-Gly，Val-Thr，Val-Val，Val-Leu，Val-Ile，Val-Asn和Phe-Lys，其中N末端与羰基相连，C末端与N原子相连；
Z为-CH2-，-CH(CH3)-或-C(CH3)2-。
本发明的第三方面涉及式III或式III’所示化合物，或其盐、溶剂化物，
其中：
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#或##上；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；
B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*上；或者B 通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至L3；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2 至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5 至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或8；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
L2为
L3为
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；
q为0或1；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；
p为0、1、2、3或4；
Y为选自以下的二肽形成的氨基酸残基：Val-Cit，Val-Ala，Val-Lys， Val-Gly，Val-Thr，Val-Val，Val-Leu，Val-Ile，Val-Asn和Phe-Lys，其中N末端与羰基相连，C末端与N原子相连；
Z为-CH2-，-CH(CH3)-或-C(CH3)2-。
在某些实施方案中，本发明涉及式III或式III’化合物，或其盐、溶剂化物，其中：A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上，如式III-1 或式III’-1所示：
其中取代基的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明所述的式I、式I’、式II、式II’、式III、式III’、式III-1或式III’-1化合物，或其盐、溶剂化物，其中：
L1选自：-(CH2)m-，
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m选自0、1、2、3、4、5；优选地，m选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式I、式I’、式II、式II’、式III、式III’、式III-1或式III’-1化合物，或其盐、溶剂化物，其中：
L1选自：-(CH2)m-，
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式I、式II、式III、式III-1化合物，或其盐、溶剂化物，其中：
L2为其中：
Y为Val-Cit或Val-Ala形成的氨基酸残基，其中N末端与羰基相连， C末端与N原子相连；
Z为-CH2-；
R3和p的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明所述的式I化合物，或其盐、溶剂化物，其中：
R2为：
q为0；或者
R2为
q为1。
在某些实施方案中，本发明所述的式I化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式IV所示化合物，
其中，
W为
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中可变基团(R)中的取代基侧链；R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CONH2，R’优选为-CH3、 -(CH2)3NHCONH2；
R2选自：
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明涉及式I’化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式IV’所示化合物，
其中，
W为
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中可变基团(R)中的取代基侧链；R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CONH2，R’优选为-CH3、 -(CH2)3NHCONH2；
R’2为卤素；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式II化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式V所示化合物，
其中，
W为
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；
B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*上；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中可变基团(R)中的取代基侧链；R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CONH2，R’优选为-CH3、 -(CH2)3NHCONH2；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式II’化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式V’所示化合物，
其中，
W为
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；
B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点**上；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中可变基团(R)中的取代基侧链；R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CONH2，R’优选为-CH3、 -(CH2)3NHCONH2；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式III化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式VI所示化合物，
其中，
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#或##上；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*或**上；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2 至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数， 3.5至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或 8；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中的取代基侧链；优选地，R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3或-CH2-CONH2，R’优选为-CH3或 -(CH2)3NHCONH2；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式III’化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物为式VI’所示化合物，
其中，
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#或##上；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*或**上；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2 至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数， 3.5至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或 8；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中的取代基侧链；优选地，R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、-CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3或-CH2-CONH2，R’优选为-CH3或 -(CH2)3NHCONH2；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式VI或式VI’所示化合物，或其盐、溶剂化物，其中：A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上，如式VI-1或式VI’-1所示：
其中，
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上；
B为活性化合物，选自药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体；优选地，B为细胞毒素，抗肿瘤药物，抗病毒药物或抗感染药物；进一步优选地，B为细胞毒素，例如微管蛋白抑制剂、DNA烷化剂、DNA 嵌合剂、酶抑制剂、抗代谢药物、肽或核苷酸；B通过活性化合物分子中的N原子或O原子偶联至位点*或**上；
n为0.5至8.5之间的数，例如0.8至5之间的数，1至4之间的数，2 至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数，优选地n约为4、5、6、7或 8；
R1为C1-6的直链或支链烷基，R1任选地被以下取代基单取代或多取代：卤素、C1-4烷氧基；
L1选自：-(CH2)m-，-(CH2)mO-，-(CH2CH2O)r-，-O-，-NH-，-S-，-S(O)-， -S(O)2-，-NCH3-，-NH(CH2)2NH-，-C(O)-，
优选地，L1选自：-(CH2)m-，
R’是氨基酸残基中可变基团(R)中的取代基侧链；R’是-CH3、 -(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4-NH2、-H、-CH(CH3)-OH、-CH-(CH3)2、 -CH2-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CONH2，R’优选为-CH3、 -(CH2)3NHCONH2；
R3选自：氢、卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基；优选地， R3选自：氢、卤素、甲基、乙基；
m和r各自独立地选自0、1、2、3、4；
p为0、1、2、3或4；优选地，p为0、1、2或3；更优选地，p为0、 1或2；更优选地，p为0。
在某些实施方案中，本发明所述的式I、式II、式III、式I’、式II’、式III’、式III-1、式III’-1化合物，或其盐、溶剂化物，其中：R1为C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，优选为甲基。
在某些实施方案中，本发明所述的式II、式III、式II’、式III’化合物，或其盐、溶剂化物，其中B选自：奥里斯他汀(auristatin)，甲基奥里斯他汀E(MMAE)，美登木素(maytansine)或其衍生物(例如类美登木素、DM1、DM3、DM4)，紫杉醇，卡里奇霉素，倍癌霉素，多柔比星，喜树碱，PBD(pyrrolobenzodiazepines)类细胞毒素及其衍生物。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或式III、式II’、式III’、式 III-1、式III’-1化合物，或其盐、溶剂化物，其中B为单甲基奥里斯他汀 E(MMAE)。
在某些实施方案中，本发明所述的式III、式III’、式III-1、式III’-1 化合物，或其盐、溶剂化物，其中A为单克隆抗体(MAB)，或者
A中含有抗体片段或其替代物或其变体，蛋白质配体或蛋白质支架；
优选地，A通过A中的S原子偶联至位点#上，
优选地，A通过A中的半胱氨酸残基的S原子偶联至位点#上。
在某些实施方案中，本发明所述的式III、式III’、式III-1、式III’-1 化合物，或其盐、溶剂化物，其中，A是以巯基为偶联位点的单克隆抗体，或以巯基为偶联位点的定点突变或修饰的单克隆抗体)。
在某些实施方案中，本发明所述的式III、式III’、式III-1、式III’-1 化合物，或其盐、溶剂化物，其中，A选自抗HER2人源化单克隆抗体 mil40，抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(HERCEPTIN)和帕妥珠单抗 (PERJETA)、抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(ERBITUX)和帕尼单抗(VECTIBIX)、抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗(RITUXAN)、抗 CD52单克隆抗体阿仑单抗(CAMPATH)、抗CD20单克隆抗体替伊莫单抗(ZEVALIN)、抗CD20单克隆抗体托西莫单抗(BEXXAR)、抗 CD20单克隆抗体奥法木单抗(ARZERRA)、抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(AVASTIN)、抗CTLA-4单克隆抗体伊匹单抗(YERVOY)、抗 RANKL单克隆抗体地诺单抗(XGEVA)、抗PD-1单克隆抗体派姆单抗 (KEYTRUDA)、纳武单抗(Opdivo)和Avelumab(Bavencio)、抗 PD-L1单克隆抗体Atezolizumab(Tecentriq)和durvalumab(Imfinzi)、抗TROP-2的单克隆抗体sacituzumab、抗DLL-3的单克隆抗体 rovalpituzumab、及其生物类似物。
在某些实施方案中，本发明所述的式III、式III’、式III-1、式III’-1 化合物，或其盐、溶剂化物，其中，A为抗HER2人源化单克隆抗体mil40。
在某些实施方案中，本发明涉及式III、式III’、式III-1、式III’-1化合物或式VI、式VI’、式VI-1、式VI’-1所示化合物，或其盐、溶剂化物，其中：A为单克隆抗体(MAB)，n为DAR(药物/抗体摩尔比)。
在某些实施方案中，本发明涉及式I化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物选自：
在某些实施方案中，本发明涉及式II化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物选自：
在某些实施方案中，本发明涉及式III化合物，或其盐、溶剂化物，其中所述化合物选自：
其中MAB为抗体，n的定义如本发明所述，优选地n约为4或8，
优选地，MAB选自：抗HER2人源化单克隆抗体mil40，曲妥珠单抗 (HERCEPTIN)，帕妥珠单抗(PERJETA)，西妥昔单抗(ERBITUX)，帕尼单抗(VECTIBIX)，利妥昔单抗(RITUXAN)，阿仑单抗(CAMPATH)，替伊莫单抗(ZEVALIN)，托西莫单抗(BEXXAR)，奥法木单抗(ARZERRA)，贝伐单抗(AVASTIN)，伊匹单抗(YERVOY)，地诺单抗(XGEVA)，派姆单抗(KEYTRUDA)，纳武单抗(Opdivo)，Avelumab (Bavencio)，Atezolizumab(Tecentriq)，durvalumab(Imfinzi)， sacituzumab，rovalpituzumab，及其生物类似物，
更优选地，MAB为抗HER2人源化单克隆抗体mil40。
本发明的第四方面涉及本发明第一方面所述的式I或式I’化合物或第二方面所述的式II或式II’化合物，或其盐、溶剂化物在制备抗体偶联药物中的应用，优选地，所述抗体偶联药物为本发明第三方面所述的式III 或式III’化合物。
本发明还涉及本发明所述的式I’化合物或式II’化合物，或其盐、溶剂化物在制备抗体偶联药物中的应用，优选地，所述抗体偶联药物为本发明所述的式III-1或式III’-1化合物。
本发明的第五方面涉及制备本发明第一方面所述的式I化合物，或其盐、溶剂化物的方法，
1)如果q为0，R2为
a)马来酸酐与式i化合物反应生产式ii化合物；
b)式ii化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(SuOH)反应生成式iii化合物；
c)式iii化合物与碘代烷基R1-I反应生成目标化合物I-1；
2)如果q为1，R2为所述制备方法包括以下步骤：
a)Fmoc-Y-OH与式iv化合物反应生成式v化合物；
b)式v化合物脱去Fmoc保护基，得到式vi化合物；
c)化合物I-1与式vi化合物反应生成式vii化合物；
d)式vii化合物与式viii化合物反应生成目标化合物I-2；
其中L1、Y、Z、R1、R3和p的定义如本发明所述。
本发明的第六方面涉及制备本发明第二方面所述的式II化合物，或其盐、溶剂化物的方法，包括以下步骤：
本发明第一方面所述的式I化合物或其盐、溶剂化物与B代表的药物，细胞毒素，检测试剂，诊断试剂或靶向载体反应，得到式II化合物，
其中各个取代基的定义如本发明所述。
本发明第七方面涉及制备本发明第三方面所述的式III化合物，或其盐、溶剂化物的方法，包括以下步骤：
本发明第二方面所述的式II化合物或其盐、溶剂化物与A反应，其中A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上，得到式III所示的化合物，
优选地，所述反应在pH＝5～10，温度为0～40℃条件下进行；
其中各个取代基的定义如本发明所述。
本发明的第八方面涉及药物组合物，其包含至少一种本发明第三方面所述的式III或式III’化合物，或其盐、溶剂化物，以及一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明的第九方面涉及本发明第三方面所述的式III或式III’化合物，或其盐、溶剂化物在制备用于治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性的药物中的用途。
本发明的第十方面涉及治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式III或式III’所示化合物，或其的盐、溶剂化物。
本发明的第十一方面涉及式III或式III’所示化合物，或其盐、溶剂化物，其用于治疗疾病或病症或减轻所述疾病或病症严重性。
本发明还涉及诊断、预防或治疗疾病或病症的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式III或式III’所示化合物，或其的盐、溶剂化物。
在某些实施方案中，本发明所述疾病或病症选自肿瘤、感染性疾病、血液学疾病、代谢性疾病、炎症，
优选地，所述肿瘤选自癌症、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，
优选地，所述癌症选自：乳腺癌(例如，HER2阳性的乳腺癌)；鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌；胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；***；卵巢癌；肝癌；膀肮癌；尿道癌；肝细胞瘤；乳腺癌；肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾癌；***癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；***癌；***癌；黑色素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌；胆囊癌；食管癌；胆管癌；头颈癌和相关转移瘤。
定义
如本文所用，术语“抗体”是一种常见的免疫性球蛋白，是免疫系统用来识别并中和外来物(如细菌和病毒)的Y形蛋白。抗体可以特异性识别外来靶标的独特部分(称为抗原)，是由于Y形蛋白抗体的的每个尖端含有可对抗原特异性识别的位点，抗体对特异性抗原结合后，可以介导多种相关的生物效应。抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，各链间通过半肮氨酸残基中的巯基形成二硫键相连接。“单克隆抗体”是单一特异性抗体，其所有抗体分子均由均作为唯一亲代细胞的克隆的相同免疫细胞组成，因此所有抗体分子是相同的。
如本文所用，术语“细胞毒素”是指那些在癌细胞中释放后可对该细胞产生毒性的分子。在本发明中特别关注的毒素包括甲基奥里斯他汀E (MMAE)，奥里斯他汀、美登木素或其衍生物(例如类美登木素、DM1、 DM3、DM4)、卡里奇霉素、倍癌霉素、多柔比星、喜树碱或PBD类细胞毒素。
如本文所用，术语“连接子”是具有两个反应活性末端的分子，其一个末端可与抗体相偶联，另一个末端用于与活性化合物，例如细胞毒素相偶联。连接子的抗体偶联性末端通常为能够通过抗体上的半胱氨酸的巯基或赖氨酸胺基相偶联的位点，连接子的毒素的偶联性末端通常为能够通过毒素分子中的上的巯基、氨基、羧基或羟基等活性位点，当术语连接子用于描述偶联形式的连接子时，由于连接子已与抗体和细胞毒素中的一个或两个相反应形成共价键，因此，其可能将不再不包括一个或两个反应性末端反应位点(如巯基反应性基团的离去基团、胺基反应性基团的离去基团)。
如本文所用，术语“抗体偶联药物”或“ADC”是各自通过连接子偶联多分子(通常为1-8个)的细胞毒素于抗体分子上形成的产物。缀合于一个或多个细胞毒素的抗体。抗体通常为对癌症的特异抗原具有选择性的单克隆抗体。
如本文所用，术语“约”可理解为在所述值的+/-20％、+/-18％、+/-15％、 +/-12％、+/-10％、+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、 +/-2％、+/-1％、+/-0.5％、+/-0.4％、+/-0.3％、+/-0.2％、+/-0.1％以内。除非另外根据上下文显而易见，否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
本文中用到的缩略语的定义如下：
ADC(antibody-drug conjugate)：抗体偶联药物；
Ala(Alanine)：丙氨酸；
Boc(t-Butyloxy carbonyl)：叔丁氧羰基；
Cit(Citrulline)：瓜氨酸；
DAR(Drug-antibody ratio)：药物/抗体摩尔比；
DCC(Dicyclohexylcarbodiimide)：二环己基碳二亚胺；
DCM(Dichloromethane)：二氯甲烷；
DIPEA(N,N-Diisopropylethylamine)：N,N-二异丙基乙胺；
DMAC(Dimethylacetamide)：N,N-二甲基乙酰胺；
DMF(N,N-Dimethylformamide)：N,N-二甲基甲酰胺；
DMSO(Dimethyl Sulphoxide)：二甲基亚砜；
EEDQ(N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline)：N-乙氧酰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉；
Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl)：芴甲氧羰基；
HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)：人表皮生长因子受体2；
HIC(Hydrophobic Interaction Chromatography)：疏水作用色谱；
His(Histidine)：组氨酸；
mM(Millimoles)：毫摩尔；
Ma(Maleimide)：马来酰亚胺；
Maa(Maleic acid amide)：马来酸酰胺；
Mm(Methyl maleate)：马来酸甲酯；
Mf(Methyl fumarate)：富马酸甲酯；
MAB(Monoclonal Antibody)：单克隆抗体
MMAE(Monomethyl auristatin E)：单甲基奥里斯他汀E；
NHS/SuOH(N-Hydroxysuccinimide)：N-羟基琥珀酰亚胺；
NMM(N-Methylmorpholine)：N-甲基吗琳；
NAC(N-Acetyl-L-cysteine)：N-乙酰半胱氨酸；
PAB(p-Aminobenzyl alcohol)：对氨基苄基；
Su(Succinimide)：琥珀酰亚胺；
TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)：三(2-羧乙基)膦；
TFA(Trifluoroacetic acid)：三氟乙酸；
THF(Tetrahydrofuran)：四氢呋喃；
Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)：三羟甲基氨基甲烷；
VA(Valine-Alanine，Val-Ala)：缬氨酸-丙氨酸二肽；
Val(Valine)：缬氨酸；
VC(Valine-Citrulline，Val-Cit)：缬氨酸-瓜氨酸二肽；
DCU：二环己基脲；
HOBT：1-羟基苯并三氮唑；
EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
TEA：三乙胺；
Lys(Lysine)：赖氨酸；
Gly(Glycine)：甘氨酸；
Thr(Threonine)：苏氨酸；
Leu(Leucine)：亮氨酸；
Ile(Isoleucine)：异亮氨酸；
Asn(Asparagine)：天冬氨酸；
Phe(Phenylalanine)苯丙氨酸。
如本文所用，术语“盐”指保留某化合物的生物有效性和性质的盐。在许多情况下，本文所公开的化合物能够借助氨基和/或竣基或类似基团的存在形成酸和/或碱盐。酸加成盐可由无机酸和有机酸组成。可以衍生形成盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生形成盐的有机酸包括，例如，醋酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。碱加成盐可由无机碱和有机碱组成。可以衍生形成盐的无机碱包括，比如，钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、猛、铝等；特别优选的是铵，钾，钠，钙和镁盐。可以衍生形成盐的有机碱包括，例如，伯，仲和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺，环胺，碱性离子交换树脂等，具体地例如异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺和乙醇胺。
如本文所用，术语“C1-6直链或支链烷基”中“1和6”是指在基团中碳原子的数目。也就是说，“C1-6直链或支链烷基”可以包含从“1”到“6”的碳原子数。因此，例如，“C1-4烷基”指的是具有1～4个碳原子的所有烷基，即，CH3、CH3CH2、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。
如本文所用，术语“C1-6烷氧基”是指具有“C1-6烷基-O-”结构的基团，其中C1-6烷基与前述“C1-6直链或支链烷基”具有相同的含义。例如 C1-4烷氧基、C1-2烷氧基、C1烷氧基、C2烷氧基、C3烷氧基、C4烷氧基、 C5烷氧基或C6烷氧基，优选为C1-4烷氧基。具体的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、2-丁氧基、异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基等。
如本文所用，术语“卤素”或“卤”，是指该元素周期表第7列中的放射性稳定的原子中的任何一个，例如，氟、氯、溴、碘等。
如本文所述的药物组合物包含本发明式III或式III’所示化合物，或其盐、溶剂化物，与常规药用载体或赋形剂。该药物组合物可通过例如口服或非肠道等途径给药。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需治疗效果的量，例如，实现减轻与待治疗疾病相关的症状的量。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01－100mg/kg体重/天。
在某些实施方案中，本发明涉及的包含Val-Cit二肽的开环型ADC典型合成路线如下：
N-Fmoc-L-Val在DCC缩合剂的作用下与SuOH(NHS)发生缩合生成活性酯Fmoc-Val-OSu，活性酯Fmoc-Val-OSu与L-Cit发生酰化反应得到Fmoc-Val-Cit，Fmoc-Val-Cit在EEDQ的作用下，与对氨基苄醇(PAB) 发生缩合生成Fmoc-Val-Cit-PAB，Fmoc-Val-Cit-PAB在碱性条件下脱除保护基得到Val-Cit-PAB，Val-Cit-PAB与包含马来酸甲酯结构的活泼酯接头Mm-C6-OSu反应，得到Mm-C6-Val-Cit-PAB，Mm-C6-Val-Cit-PAB进一步与二(对硝基苯基)碳酸酯反应，得到连接子Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP，连接子与细胞毒素MMAE反应，得到ADC的小分子荷载物 Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，最后Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE与抗体进行偶联得到具有稳定接头W’的ADC MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE。
在某些实施方案中，本发明涉及的包含Val-Cit二肽的闭环型ADC对照物通用合成路线如下：
N-Fmoc-L-Val在DCC缩合剂的作用下与SuOH(NHS)发生缩合生成活性酯Fmoc-Val-OSu，活性酯Fmoc-Val-OSu与L-Cit发生酰化反应得到Fmoc-Val-Cit，Fmoc-Val-Cit在EEDQ的作用下，与对氨基苄醇(PAB) 发生缩合生成Fmoc-Val-Cit-PAB，Fmoc-Val-Cit-PAB在碱性条件下脱除保护基得到Val-Cit-PAB，Val-Cit-PAB与包含马来酰亚胺结构的活泼酯接头Ma-C6-OSu反应，得到Ma-C6-Val-Cit-PAB，Ma-C6-Val-Cit-PAB进一步与二(对硝基苯基)碳酸酯反应，得到连接子Ma-C6-Val-Cit-PAB-PNP，连接子与细胞毒素MMAE反应，得到ADC的小分子荷载物 Ma-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，最后Ma-C6-Val-Cit-PAB-MMAE与抗体进行偶联得到具有稳定接头结构的ADC MAB-Su-C6-Val-Cit-PAB-MMAE。
在某些实施方案中，本发明涉及的包含Val-Ala二肽的基于稳定性开环ADC的制备路线还可以为：
N-Fmoc-L-Val在DCC缩合剂的作用下与SuOH(NHS)发生缩合生成活性酯Fmoc-Val-OSu，活性酯Fmoc-Val-OSu与L-Ala发生酰化反应得到Fmoc-Val-Ala，Fmoc-Val-Ala在EEDQ的作用下，与对氨基苄醇(PAB) 发生缩合生成Fmoc-Val-Ala-PAB，Fmoc-Val-Ala-PAB在碱性条件下脱除保护基得到Val-Ala-PAB，Val-Ala-PAB与包含马来酸甲酯结构的活泼酯接头Mm-C6-OSu或Mm-C3-OSu反应，得到Mm-C6-Val-Ala-PAB或 Mm-C3-Val-Ala-PAB，Mm-C6-Val-Ala-PAB或Mm-C3-Val-Ala-PAB进一步与二(对硝基苯基)碳酸酯反应，得到连接子Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP 或Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP，上述连接子与细胞毒素MMAE反应，得到 ADC的小分子荷载物Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE，最后Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE与抗体进行偶联得到具有稳定接头结构的 ADCMAB-Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 MAB-Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE。
在某些实施方案中，本发明涉及的包含Val-Ala二肽的包含闭环ADC 对照物的制备路线为：
N-Fmoc-L-Val在DCC缩合剂的作用下与SuOH(NHS)发生缩合生成活性酯Fmoc-Val-OSu，活性酯Fmoc-Val-OSu与L-Ala发生酰化反应得到Fmoc-Val-Ala，Fmoc-Val-Ala在EEDQ的作用下，与对氨基苄醇(PAB) 发生缩合生成Fmoc-Val-Ala-PAB，Fmoc-Val-Ala-PAB在碱性条件下脱除保护基得到Val-Ala-PAB，Val-Ala-PAB与包含马来酸甲酯结构的活泼酯接头Ma-C6-OSu或Ma-C3-OSu反应，得到Ma-C6-Val-Ala-PAB或 Ma-C3-Val-Ala-PAB，Ma-C6-Val-Ala-PAB或Ma-C3-Val-Ala-PAB进一步与二(对硝基苯基)碳酸酯反应，得到连接子Ma-C6-Val-Ala-PAB-PNP或 Ma-C3-Val-Ala-PAB-PNP，上述连接子与细胞毒素MMAE反应，得到ADC的小分子荷载物Ma-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 Ma-C3-Val-Ala-PAB-MMAE，最后Ma-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 Ma-C3-Val-Ala-PAB-MMAE与抗体进行偶联得到具有稳定接头结构的 ADCMAB-Su-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 MAB-Su-C3-Val-Ala-PAB-MMAE。
有益技术效果
本发明提供了一类具有开环型连接子的式III或式III’所示化合物，该化合物在温和的类似于生物学特征的条件下可以快速地制备得到。该化合物具备着较高的稳定性，可以有效的克服现阶段ADC普遍存在的因硫代琥珀酰亚胺不稳定所导致的毒素脱靶问题。
附图说明
图1为抗体偶联过程中生成硫代琥珀酰亚胺的过程示意图；
图2为硫代琥珀酰亚胺结构不稳定性导致的毒素脱靶示意图；
图3为硫代琥珀酰亚胺结构的两种降解方式示意图；
图4为非温和条件下琥珀酰亚胺的水解示意图；
图5为在琥珀酰亚胺基团附近引入氨基以诱导加速琥珀酰亚胺开环过程的示意图；
图6为基于不同结构的连接子的ADC的DAR随时间的变化曲线，其中DAR初始值约为8。结果表明，基于马来酸甲酯连接子(W’)的ADC 具有显著的优于基于琥珀酰亚胺(Su)连接子的ADC的体外稳定性，在捕获剂NAC存在的情况下，21天内未发生明显的毒素脱靶；相比之下，具有琥珀酰亚胺连接子(Su)的ADC在相同的条件下毒素脱靶约35％。
图7为给药后肿瘤体积随时间的变化曲线。结果显示，与溶剂对照组相比，阳性对照1组中所有动物的肿瘤发生萎缩，但只是出现部分抑制，所有动物的肿瘤依旧存在；而在受试化合物治疗组(2.5mg/kg)中，所有受试动物体内肿瘤均全部消失并且持久消退，在停药一个月后没有动物发生肿瘤复发。
图8为相同给药剂量下，基于不同结构连接子的ADC的抑瘤效果。结果显示，在2.5mg/kg剂量下，阳性对照2组中小鼠肿瘤未完全消失，而受试化合物治疗组中小鼠肿瘤完全消失(治疗结束时，p＝0.0061)，这表面本发明提供的基于开环的马来酸甲酯连接子的ADC与基于闭环的琥珀酰亚胺连接子的ADC相比，具有更优的药效。
图9为不同给药剂量下，ADC的抑瘤效果。结果显示，本发明的基于开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC的抑瘤活性表现出明显的剂量依赖性，其中，中高剂量组均出现肿瘤消失。
图10为接受本发明的包含开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC治疗后，动物体重变化曲线。结果显示，受试化合物治疗组与溶剂对照组基本不存在明显差异，所有受试动物均呈现体重稳步上升，说明本发明提供的基于开环型马来酸甲酯连接子的ADC副作用小。
图11为接受本发明的包含开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC治疗后，三个受试剂量组(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg)动物的血液学分析结果，其中数字“1”和“2”分别代表在给药后第28天和第58天时受试动物全血分析的结果。结果显示，空白对照组和受试化合物治疗组(1mg/kg、 2.5mg/kg和5mg/kg)之间并没有表现出显著的差异。上述结论表明，本发明提供的基于开环型马来酸甲酯连接子的ADC具有低的血液毒性和脱靶骨髓毒性，这也很有可能是其被良好耐受的主要原因。
图12为组织切片和骨髓涂片在显微镜下拍摄的结果，其中每个给药组包含6只动物，图片原始尺寸为425×320μm。结果显示，与溶剂对照组相比，受试化合物治疗组没有表现出显著性差异，该实验这进一步证实了本发明提供的ADC的用药安全性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：连接子Mm-C3-OSu的合成：
1)Maa-C3-OH的制备：
将3-氨基丙酸(4.13g，46.35mM)溶于乙酸(200mL)中，搅拌溶解，加入马来酸酐(5.0g，51mM)，室温搅拌，反应液为澄清透明状；搅拌下反应一小时后，有白色不溶物析出，继续反应10h，然后过滤，滤饼采用乙腈洗涤，得到白色粉末状固体，称重7.72g，收率为89％。1H-NMR (400M，DMSO-d6)：δ14.28(br，1H)，12.72(br，1H)，9.09(s， 1H)，6.40(d，J＝12.6Hz，1H)，6.24(d，J＝12.6，1H)，3.37(t， 2H)，2.47(t，2H)。MS m/z 186.04([M-H]-)。
2)Maa-C3-OSu的制备：
将Maa-C3-OH(2.0g，10.68mM，1eq)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF， 45mL)中，搅拌溶解后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(SuOH，2.46g，21.37 mM，2eq)，室温搅拌，放于-5℃冷阱中降温20min，然后加入2,4,6- 三甲基吡啶(4.21mL，32.04mM，3eq)并于-5℃下继续搅拌20min。缓慢滴入三氟乙酸酐(4.50mL，3eq)半小时滴完。完成后，将反应液滴入1mol/L盐酸溶液(HCl)中，采用氯仿萃取3～4次。合并有机相，水洗3次，1mol/L HCl洗2次，饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，浓缩有机相，得目标产物为无色油状物，低温放置变为白色固体，干燥后，称重2.5g，收率81％。1H-NMR(400M，DMSO-d6)：δ8.22(t，1H)， 6.39(d，J＝12.6Hz，1H)，6.33(d，J＝12.6Hz，1H)，2.95(q，2H)， 2.89(s，4H)。MS m/z 283.2([M-H]-)；285.2([M+H]+)。
3)Mm-C3-OSu的制备：
将Maa-C3-OSu(2.4g，9.27mM，1eq)溶于DMF(30mL)中，搅拌溶解，加入无水碳酸钾(2.56g，18.53mM，2eq)；滴入碘甲烷(2.63 g，18.53mM，2eq)，室温反应2h。反应结束后，过滤除去不溶物。减压浓缩去除溶剂，加入乙酸乙酯溶解残渣，过滤后采用饱和饱和食盐水洗 3次，无水硫酸镁干燥，浓缩得到白色半固体状物质，为Mm-C3-OSu粗品。
实施例2：连接子Mm-C6-OSu的合成：
1)Maa-C6-OH的制备：
将6-氨基己酸(3.94g，30mM)溶于乙酸(100mL)中，搅拌溶解，加入马来酸酐(2.94g，30mM)，室温搅拌，反应液为澄清透明状；室温下继续搅拌反应一小时后，有白色不溶物析出，继续反应10h后，过滤，滤饼采用乙腈洗涤，得到白色粉末状固体，称重5.7g，收率为82％。1H-NMR (400M，DMSO-d6)：δ15.08(br，1H)，11.92(br，1H)，9.12(t， 1H)，6.40(d，J＝12.6Hz，1H)，6.25(d，J＝12.6Hz，1H)，3.16 (t，2H)，2.20(t，2H)，1.54-1.43(m，4H)，1.29(m，2H)。MS m/z 228([M-H]-)。
2)Maa-C6-OSu的制备：
将Maa-C6-OH(4.00g，17.45mM，1eq)溶于DMF(70mL)中，搅拌溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺(8.03g，69.80mM，4eq)，室温搅拌，放于-5℃冷阱中降温20min，然后加入2,4,6-三甲基吡啶(9.31mL， 69.80mM，4eq)并于-5℃下继续搅拌20min。缓慢滴入三氟乙酸酐(9.80mL，4eq)半小时滴完。完成后，将反应液滴入1mol/L HCl中，采用氯仿萃取3-4次。合并有机相，水洗3次，1mol/L HCl洗2次，饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，浓缩有机相，得目标产物为白色固体，干燥后，称重5.11g，收率89.74％。1H-NMR(400M，DMSO-d6)：δ15.13(1H)，9.11(t，1H)，6.40(d，J＝12.6Hz，1H)，6.25(d，J＝12.6Hz，1H)， 3.17(q，2H)，2.81(s，4H)，2.76(t，2H)，1.639(m，2H)，1.50 (m，2H)，1.38(m，2H)。MS m/z 325.4([M-H]-)；327.5([M+H]+)。
3)Mm-C6-OSu的制备：
将Maa-C6-OSu(1.50g，4.6mM，1eq)溶于DMF(25mL)中，搅拌溶解，加入无水碳酸钾(1.27g，9.2mM，2eq)；滴入碘甲烷(1.3g， 9.2mM，2eq)，室温反应2h。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩去除溶剂，加入乙酸乙酯溶解残渣，过滤后采用饱和饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，采用乙酸乙酯再次溶解后使用硅胶拌样，柱层析纯化，得目标产物为白色固体，干燥后，称重1.1g，收率66％。1H-NMR (400M，CDCl3)：δ8.21(br，1H)，6.35(d，J＝12.6Hz，1H)，6.13 (d，J＝12.6Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.35(q，2H)，2.84(s，4H)， 2.63(t，2H)，1.80(m，2H)，1.63(m，2H)，1.49(m，2H)。MS m/z 341.2([M+H]+)；363.2([M+Na]+)。
实施例3：连接子Mm-CR-OSu的合成：
1)Maa-CR-OH的制备：
将4-(氨基甲基)环己烷-1-羧酸(2.0g，20.4mM)溶于乙酸(100mL) 中，搅拌溶解，加入马来酸酐(3.2g，20.4mM)，室温搅拌，反应液为澄清透明状；室温下继续搅拌反应一小时后，有白色不溶物析出，继续反应10h后，过滤，滤饼采用乙腈洗涤，得到白色粉末状固体，称重2.91g，收率为56％。1H-NMR(400M，DMSO-d6)：δ14.92(br，1H)，12.13 (br，1H)，9.08(t，1H)，6.42(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝ 12.6Hz，1H)，3.03(t，2H)，2.13(tt，1H)，1.90(dd，2H)，1.74 (dd，2H)，1.43(m，1H)，1.26(qd，2H)，0.94(qd，2H)。MS m/z 254.3([M-H]-)。
2)Maa-CR-OSu的制备：
将Maa-CR-OH(0.64g，2.5mM)溶于DMF(15mL)中，全部溶解后加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.58g，5.0mM)，搅拌使其溶解，置于-5℃的冷阱中降温，加入2,4,6-三甲基吡啶(1.3mL，10mM)继续搅拌10min，缓慢滴入三氟乙酸酐(1.40mL，10mM)。反应结束后，将反应液滴入1mol/L HCl中，析出白色细粉状固体0.69g，收率为78％。1H-NMR(400M， DMSO-d6)：δ14.99(br，1H)，9.09(t，1H)，6.42(d，J＝12.6Hz， 1H)，6.23(d，J＝12.6Hz，1H)，3.06(t，2H)，2.80(s，4H)，2.69 (tt，1H)，2.02(dd，2H)，1.79(dd，2H)，1.43(m，1H)，1.50 (m，1H)，1.42(qd，2H)，1.03(qd，2H)。
3)Mm-CR-OSu的制备：
将Maa-CR-OSu(1.62g，4.6mM)溶于DMF(15mL)中，搅拌溶解，加入无水碳酸钾(1.27g，9.2mM，2eq)；滴入碘甲烷(1.3g，9.2mM， 2eq)，室温反应2h。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩去除溶剂，加入乙酸乙酯溶解残渣，过滤后采用饱和饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，采用乙酸乙酯再次溶解后使用硅胶拌样，柱层析纯化，得目标产物为白色固体，干燥后，称重0.91g，收率54％。1H-NMR(400M， DMSO-d6)：δ9.09(t，1H)，6.40(d，J＝12.6Hz，1H)，6.18(d，J ＝12.6Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.06(t，2H)，2.80(s，4H)，2.69(tt，1H)，2.02(dd，2H)，1.79(dd，2H)，1.43(m，1H)，1.50 (m，1H)，1.42(qd，2H)，1.03(qd，2H)。
实施例1-3制备的包含马来酸甲酯的连接子的结构如下表所示：
实施例4：连接子Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP的合成：
1)Fmoc-Val-Ala的制备：
将Fmoc-Val(25.0g，74.0mM)、SuOH(NHS，8.52g，74.0mM) 和二环己基碳二亚胺(DCC，15.27g，74.0mM)的THF溶液(250mL) 在室温下搅拌16h。将反应混合物冷却至0℃搅拌反应2h，然后过滤除去不溶性固体副产物二环己基脲(DCU)，收集滤液，滤饼进一步采用THF洗涤，将洗涤液与滤液合并，减压浓缩得到粗产物，为玻璃状固体，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。
将玻璃状固体再溶于DME(200mL)和THF(100mL)的混合物中，然后加入L-丙氨酸(6.95g，78mM)的碳酸氢钠水溶液。将反应混合物在室温下搅拌16h，倒入15％柠檬酸水溶液中(400mL)，过滤，滤饼在减压下干燥，得到粗产物。将粗产物分散在***中，通过超声和过滤三次进行纯化，得到白色固体(16.2g，53％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ12.48(s，1H)，8.25(d，J＝6.7Hz，1H)，7.89(d， J＝7.6Hz，2H)，7.74(t，2H)，7.43(m，3H)，7.33(m，2H)，4.22 (m，4H)，3.89(q，1H)，1.96(m，1H)，1.27(d，3H)，0.88(dd， 6H)。MS(ESI)m/z：411.3[M+H]+；433.4[M+Na]+。
2)Fmoc-Val-Ala-PAB的制备：
将Fmoc-Val-Ala(2g，4.87mM)和4-氨基苄醇(1.2g，9.75mM) 溶于二氯甲烷/甲醇混合溶液(100mL，二氯甲烷/甲醇的体积比为2:1)中，然后加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ，2.41g，9.75mM)，混合溶液在室温下置于暗处避光搅拌12h。减压蒸出溶剂，得白色固态残渣，将其加入***(300mL)中，悬浮液超声五分钟后，静置三十分钟，过滤并采用***洗涤滤饼，得到白色固体(1.92g，77％yield)。1H-NMR (400MHz，DMSO-d6)δ9.96(s，1H)，8.22(d，J＝6.7Hz，1H)， 7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.75(t，2H)，7.52(q，3H)，7.41(t，2H)，7.34(t，2H)，7.24(t，2H)，5.13(t，J＝5.6Hz，1H)，4.42 (d，J＝5.6Hz，2H)，4.40(br，1H)，4.30(t，1H)，4.22(q，2H)， 3.91(t，J＝8.4Hz，1H)，2.00(m，1H)，1.30(d，J＝7.0Hz，3H)， 0.88(dd，6H)。MS(ESI)m/z：516.4[M+H]+；538.3[M+Na]+。
3)Val-Ala-PAB的制备：
将Fmoc-Val-Ala-PAB(4.0g，7.76mM)溶解于DMF(40mL)之中，全部溶解后加入哌啶(2mL)。混合物在室温下搅拌2h后，减压蒸出溶剂得到粗产品。采用硅胶柱层析(DCM/MeOH(v/v)＝20:1)进行纯化，得白色固体(2.1g，90％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.0(s，1H)，8.18(s，1H)，7.53(d，2H)，7.24(d，2H)，5.13 (s，1H)，4.48(t，1H)，4.43(s，1H)，3.00(d，1H)，2.80(d， 1H)，1.92(m，1H)，1.29(d，J＝7.0Hz，3H)，0.85(dd，6H)。 MS(ESI)m/z：294.2[M+H]+；316.2[M+Na]+。
4)Mm-C3-Val-Ala-PAB的制备：
将Mm-C3-OSu(0.6g，2.0mM)粗品溶于无水DMF(20mL)之中，全溶后加入Val-Ala-PAB(0.59g，2.0mM)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，减压浓缩去除DMF得粗品，进一步经柱层析纯化得白色粉末状固体(0.59g，62％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.85(s，1H)，8.24(t，J＝5.7Hz，1H)，8.19(d，J＝7.3Hz，2H)，7.96(d， J＝8.4Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，2H)，6.27(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝12.6Hz，1H)，5.11(t，J＝5.7 Hz，1H)，4.42(d，J＝5.6Hz，2H)，4.39(t，J＝7.0Hz，1H)，4.19 (t，J＝7.6Hz，1H)，3.64(s，3H)，3.27(q，J＝5.9Hz，2H)，2.38 (t，J＝7.0Hz，2H)，1.97(m，J＝6.8Hz，1H)，1.30(d，J＝7.0Hz， 3H)，0.85(dd，J1＝15.7Hz，J2＝6.8Hz，6H).MS(ESI)m/z：477.24 [M+H]+；499.22[M+Na]+；975.45[2M+Na]+。
5)Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP的制备：
将Mm-C3-Val-Ala-PAB溶解于无水DMF(15mL)中，全部溶解后依次加入二(对硝基苯基)碳酸酯(360mg，1.2mM)和DIPEA(104mg， 0.9mM)，室温下搅拌反应12h。反应结束后，减压浓缩去除溶剂，残渣采用***分散打浆后过滤得产物粗品，进一步经柱层析纯化得到目标产物为白色固体粉末(55％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.01 (s，1H)，8.31(d，J＝9.2Hz，2H)，8.24(m，1H)，7.97(d，J＝8.4 Hz，1H)，7.64(d，J＝8.7Hz，2H)，7.57(d，J＝9.3Hz，2H)，7.41 (d，J＝8.7Hz，2H)，6.27(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝12.6 Hz，1H)，5.24(s，2H)，4.39(m，1H)，4.19(t，J＝15.1Hz，1H)， 3.64(s，3H)，3.28(q，J＝7.0Hz，2H)，2.39(t，J＝7.2Hz，2H)， 1.96(m，1H)，1.31(d，J＝7.0Hz，3H)，0.86(dd，J＝6.7Hz，6H).MS(ESI)m/z:642.4[M+H]+；664.5[M+Na]+；680.4[M+K]+.
实施例5：连接子Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP的合成：
1)Mm-C6-Val-Ala-PAB的制备：
以Mm-C6-OSu为原料，采用与Mm-C3-Val-Ala-PAB的类似方法合成 Mm-C6-Val-Ala-PAB，得到淡黄色固体粉末(60％yield)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ9.99(s，1H)，8.12(d，J＝6.7Hz，1H)，7.89(d，J＝6.7Hz，2H)，7.74(t，2H)，7.54(d，2H)，7.46(d，1H)，7.41 (m，2H)，7.32(m，2H)，7.23(d，2H)，5.98(t，J＝5.5Hz，1H)， 5.42(s，2H)，5.12(t，1H)，4.41(q，3H)，4.30(q，1H)，4.23 (q，2H)，3.92(q，1H)，3.00(m，2H)，1.98(m，1H)，1.69(m， 1H)，1.57(m，1H)，1.41(m，2H)，0.86(dd，6H)。MS(ESI) m/z：602.7[M+H]+；624.5[M+Na]+。
2)Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP的制备：
以中间体Mm-C6-Val-Ala-PAB为原料，采用与 Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP类似的制备方法合成Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP，得到淡黄色固体粉末(86％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 10.03(s，1H)，8.31(d，J＝9.3Hz，2H)，8.20(m，1H)，7.84(d， J＝6.7Hz，1H)，7.64(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57(d，J＝9.0Hz，2H)， 7.41(d，J＝8.4Hz，2H)，6.28(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝12.6 Hz，1H)，5.24(s，2H)，4.38(t，J＝7.0Hz，1H)，4.18(t，J＝7.6Hz，1H)，3.62(s，3H)，3.05(q，J＝6.3Hz，2H)，2.15(m，2H)， 1.96(m，1H)，1.49(m，2H)，1.40(m，2H)，1.31(d，J＝7.0Hz， 3H)，1.25(m，2H)，0.86(m，6H)。MS(ESI)m/z：684.30[M+H]+；706.28[M+Na]+。
实施例6：连接子Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP的合成：
1)Fmoc-Val-Cit的制备：
采用与Fmoc-Val-Ala类似的制备方法合成Fmoc-Val-Cit，得到淡黄色固体(70％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.61(s，1H)， 8.21(d，J＝6.7Hz，1H)，7.89(d，J＝6.7Hz，2H)，7.76(t，2H)， 7.43(q，3H)，7.33(t，2H)，5.98(t，J＝5.2Hz，1H)，5.43(s， 2H)，4.25(m，3H)，4.16(q，1H)，3.94(t，1H)，2.96(q，2H)， 1.98(m，1H)，1.72(m，1H)，1.58(m，1H)，1.42(m，2H)，0.89 (dd，6H)。MS(ESI)m/z：497.6[M+H]+；519.6[M+Na]+。
2)Fmoc-Val-Cit-PAB的制备：
以Fmoc-Val-Cit为原料，采用与Fmoc-Val-Ala-PAB类似的制备方法合成Fmoc-Val-Cit-PAB，得到淡黄色固体粉末(60％yield)。1H-NMR (400MHz，DMSO-d6)：δ9.99(s，1H)，8.12(d，J＝6.7Hz，1H)， 7.89(d，J＝6.7Hz，2H)，7.74(t，2H)，7.54(d，2H)，7.46(d，1H)，7.41(m，2H)，7.32(m，2H)，7.23(d，2H)，5.98(t，J＝5.5Hz，1H)，5.42(s，2H)，5.12(t，1H)，4.41(q，3H)，4.30(q，1H)， 4.23(q，2H)，3.92(q，1H)，3.00(m，2H)，1.98(m，1H)，1.69(m，1H)，1.57(m，1H)，1.41(m，2H)，0.86(dd，6H)。MS(ESI) m/z：602.7[M+H]+；624.5[M+Na]+。
3)Val-Cit-PAB的制备：
以Fmoc-Val-Cit-PAB为原料，采用与Val-Ala-PAB类似的制备方法制备Val-Cit-PAB，得到淡黄色固体粉末(84％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ10.07(s，1H)，8.17(br，1H)，7.54(d，2H)，7.23(d， 2H)，6.01(br，1H)，5.44(d，2H)，5.13(br，1H)，4.47(s，1H)，4.43(s，2H)，3.05(d，1H)，2.95(m，2H)，1.94(m，1H)，1.64 (m，2H)，1.38(m，2H)，0.86(dd，6H)。MS(ESI)m/z：380.3[M+H]+； 402.3[M+Na]+。
4)Mm-C6-Val-Cit-PAB的制备：
将Mm-C6-OSu(1.0g，2.94mM)溶于无水DMF(30mL)之中，全溶后加入Val-Cit-PAB(1.11g，2.94mM)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，减压浓缩去除DMF，得粗品为黄色粘稠状物质，进一步经柱层析纯化得淡黄色粉末状固体(1.19g，41％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.92(s，1H)，8.20(t，1H)，8.09(d，1H)，7.85(d， 1H)，7.54(d，2H)，7.22(d，2H)，6.27(d，J＝12.6Hz，1H)， 6.23(d，J＝12.6Hz，1H)，5.99(br，1H)，5.43(s，2H)，5.11(t，1H)，4.42(d，2H)，4.37(m，1H)，4.19(t，1H)，3.63(s，3H)， 3.05(q，2H)，2.95(m，2H)，2.17(m，2H)，1.95(m，1H)，1.74-1.55 (m，2H)，1.51-1.48(m，2H)，1.45-1.37(m，4H)，1.24(m，2H)， 0.85(dd，6H)。MS(ESI)m/z：605.7[M+H]+；627.7[M+Na]+。
5)Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP的制备：
以中间体Mm-C6-Val-Cit-PAB为原料，采用与 Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP类似的制备方法合成Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP，得到淡黄色固体粉末(85％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.08(s，1H)，8.31(d，J＝9.0Hz，2H)，8.20(t，J＝5.2Hz，1H)， 8.13(d，J＝7.3Hz，2H)，7.83(d，J＝8.4Hz，1H)，7.65(d，J＝8.4 Hz，2H)，7.57(d，J＝9.24Hz，2H)，7.41(d，J＝8.4Hz，2H)， 6.28(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝12.6Hz，1H)，5.99(s，1H)， 5.43(s，2H)，5.24(s，2H)，4.38(t，J＝6.8Hz，1H)，4.19(t，J＝ 7.6Hz，1H)，3.63(s，3H)，3.08-2.92(m，4H)，2.17(m，2H)， 1.71(m，1H)，1.60(m，2H)，1.52-1.37(m，6H)，1.25(q，2H)，0.85(dd，6H)。MS(ESI)m/z：770.7[M+H]+；792.6[M+Na]+。
实施例4-6制备的包含马来酸甲酯的连接子的结构如下表所示：
实施例7：连接子-细胞毒素偶联物的合成：
1)Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE的制备：
以连接子Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP为原料，将其溶解于无水DMF(3 mL)中，全部溶解后依次加入HOBt(8.28mg，0.06mM)、MMAE(40 mg，0.06mM)和DIPEA(10.68μL)，室温下搅拌反应18h。反应结束后，减压浓缩去除溶剂，残渣进一步经柱层析纯化，得到目标产物为白色固体粉末(69％yield)。MS(ESI)m/z：1220.72[M+H]+；610.87[M+2H]2+。
2)Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE的制备：
以连接子Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP为原料，采用与 Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE类似的制备方法合成 Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE，得到白色固体粉末(75％yield)。MS(ESI) m/z：1284.75[M+H]+；642.88[M+2H]2+。
3)Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE的制备：
以连接子Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP为原料，采用与 Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE类似的制备方法合成 Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，得到白色固体粉末(68％yield)。MS(ESI) m/z：1349.6[M+H]+；1371.3[M+Na]+；675.6[M+2H]2+。
实施例7制备的包含马来酸甲酯的连接子和MMAE的偶联物的结构如下表所示：
实施例8：连接子-MMAE替代物偶联物的合成：
8.1MMAE替代物(Val’-Val-An)的合成
合成路线如下：
1)Boc-Val-An的制备：
将N-Boc-缬氨酸(Boc-Val，2.17g，10mM)溶解于无水THF(30mL) 中，然后向其中加入苯胺(0.93g，10mM)和DCC(2.39g，11mM)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，过滤除去不溶物(DCU)，所得到的滤液减压浓缩后进一步经柱层析纯化，得目标产物为白色固体粉末(2.2g， 75％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.98(s，1H)，7.60 (d，J＝7.6Hz，2H)，7.30(d，J＝8.0Hz，2H)，7.04(t，J＝7.4Hz， 1H)，6.90(d，J＝8.4Hz，1H)，3.91(t，J＝7.0Hz，1H)，1.96(m， 1H)，1.39(s，9H)，0.88(d，J＝6.7Hz，6H)。MS(ESI)m/z：293.1 [M+H]+；315.2[M+Na]+。
2)Val-An的制备：
将步骤1)得到的产物Boc-Val-An(5.85g，20mM)溶解于DCM(50 mL)中，然后向反应液中加入TFA(12.5mL)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，减压浓缩后进一步经柱层析纯化，得目标产物为浅黄色油状液体(2.8g，88％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.84(br， 1H)，7.63(dd，J＝8.7Hz，2H)，7.30(d，J＝8.0Hz，2H)，7.03(td， J＝7.4Hz，1H)，3.10(d，J＝5.6Hz，1H)，1.93(m，1H)，0.88(d， J＝6.7Hz，6H)。MS(ESI)m/z：193.1[M+H]+；215.1[M+Na]+。
3)Boc-Val’-Val-An的制备：
将N-甲基-N-Boc-缬氨酸(Val’，0.58g，2.5mM)溶解于DCM(10mL) 中，然后依次加入EDCI(0.58g，3mM)、HOBt(0.41g，3mM)、DIPEA (0.51mL，3.0mM)，室温下搅拌反应1h后，加入Val-An(0.48g，2.5 mM)，室温下继续搅拌反应过夜。反应结束后，浓缩去除溶剂得粗品，进一步干燥得到类浅粉色固体粉末(0.43g，42％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ10.11(d，1H)，7.95(d，J＝8.3Hz，2H)，7.58(d， J＝7.6Hz，2H)，7.31(t，J＝8.0Hz，2H)，7.05(t，J＝7.4Hz，3H)， 4.23(t，J＝9.4Hz，2H)，2.77(s，1H)，2.04(m，2H)，1.43(s， 9H)，0.87-0.78(m，12H)。MS(ESI)m/z：406.2[M+H]+；428.3[M+Na]+。
4)Val’-Val-An的制备：
将步骤3)得到的Boc-Val’-Val-An(0.42g，1.04mM)溶解于DCM (5mL)中，然后向反应液中加入TFA(1.25mL)，室温下搅拌反应3h。反应结束后，减压浓缩后，残渣用乙酸乙酯复溶，采用饱和碳酸氢钠洗涤 2次，浓缩后产品经乙酸乙酯重结晶，得到产物为白色粉末状固体(0.31g， 99％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.03 (d，J＝9.0Hz，1H)，7.59(d，J＝8.7Hz，2H)，7.30(t，J＝7.1Hz， 2H)，7.04(t，J＝7.4Hz，1H)，4.39(t，J＝8.0Hz，1H)，2.69(d， J＝6.2Hz，1H)，2.20(s，3H)，2.03(m，1H)，1.76(m，1H)， 0.89(m，12H)。MS(ESI)m/z：306.22[M+H]+；328.20[M+Na]+。
8.2连接子-MMAE替代物偶联物的合成
以连接子Mm-C6-Val-Cit-PAB-PNP为原料，将其溶解于无水DMF(10 mL)中，全部溶解后依次加入HOBt(44.6mg，0.33mM)、MMAE替代物(Val’-Val-An，100mg，0.33mM)和DIPEA(85.3mg，0.66mM)，室温下搅拌反应18h。反应结束后，减压浓缩去除溶剂，残渣进一步经柱层析纯化得到目标产物为白色固体粉末(86％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ10.07-9.97(m，2H)，8.19(t，J＝5.7Hz，1H)，8.12 (d，J＝7.3Hz，1H)，7.94(d，J＝7.8Hz，1H)，7.83(d，J＝8.4Hz， 2H)，7.60-7.57(m，4H)，7.34-7.28(m，4H)，7.05(t，J＝7.4Hz， 1H)，6.27(d，J＝12.6Hz，2H)，6.23(d，J＝12.6Hz，2H)，5.98 (t，J＝5.6Hz，1H)，5.43(s，1H)，5.11-5.01(m，2H)，4.39(m， 2H)，4.18(q，J＝8.2Hz，2H)，3.63(s，3H)，3.08-2.95(m，4H)， 2.85(s，3H)，2.17(m，2H)，2.09(s，1H)，1.97(m，1H)，1.69 (m，1H)，1.61(m，1H)，1.53-1.31(m，6H)，1.23(m，2H)， 0.87-0.77(m，18H)。MS(ESI)m/z：936.8[M+H]+；959.1[M+Na]+。
实施例8制备的包含马来酸甲酯的连接子和MMAE替代物的偶联物结构如下表所示：
实施例7和8证明本发明提供的链接子能够与细胞毒素偶联。
实施例9：连接子-巯基小分子偶联物的合成
9.1含W’基团连接子-巯基小分子偶联物按照以下路线合成：
其中，R为：
R-SH为：
1)Maa-C6-An的制备：
将Maa-C6-OH(3.0g，13.1mM)溶解于THF(50mL)中，全溶后，置于-20℃的低温反应槽中搅拌10min使之降温。分别滴入NMM(1.59g， 15.7mM)和氯甲酸异丁酯(2.14g，15.7mM)，-20℃的低温下反应20 min，然后滴入苯胺(An，1.83g，19.6mM)，继续搅拌反应2h。反应结束后，向反应液中加入1mol/L HCl，并采用乙酸乙酯萃取，合并有机相，采用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得残渣经硅胶柱层析进行纯化，得纯品为白色固体(3.2g，81％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ11.98(br，1H)，11.35(s，1H)，8.68(t，1H)，7.61 (d，J＝7.6Hz，2H)，7.32(t，J＝7.8Hz，2H)，7.07(t，J＝7.4Hz， 2H)，6.26(dd，2H)，3.12(q，2H)，1.54-1.42(m，4H)，1.30(m， 2H)。
2)Mm-C6-An的制备：
将Maa-C6-An(0.33g，1.1mM)溶解于DMF中，加入碳酸钾(0.23 g，1.63mM)和碘甲烷(0.23g，1.63mM)，室温下搅拌反应4h。反应结束后，过滤去除不溶性盐，乙酸乙酯分散后，采用硅胶拌样，经柱层析纯化得白色粉末状固体(0.32g，93％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ11.33(s，1H)，8.67(t，1H)，7.61(d，J＝7.6Hz， 2H)，7.32(t，J＝7.8Hz，2H)，7.07(t，J＝7.4Hz，2H)，6.26(dd， 2H)，3.57(s，3H)，3.12(q，2H)，2.29(t，2H)，1.57-1.41(m， 4H)，1.30(m，2H)。
3)S1-W’-C6-An的制备：
将Mm-C6-An(0.11g，0.35mM)溶于甲醇中，之后加入S1(0.1g， 0.38mM)及催化量的三乙胺(TEA)，反应。30min后，反应结束，减压浓缩去除溶剂，残渣经柱层析纯化，得到一对对映异构体产物为白色固体粉末(0.2g，～100％yield)，含量约为1:1。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.00(s，1H)，8.53(t，1H)，8.23(d，2H)，7.97(t，1H)，7.55 (d，2H)，7.32-7.21(m，7H)，7.02(t，1H)，4.49(q，1H)，4.27 (m，2H)，3.75(t，2H)，3.57(s，3H)，3.03(q，2H)，2.98-2.88 (m，2H)，2.80(m，1H)，2.66(dd，1H)，2.24(t，2H)，1.87(s，
3H)，1.48(m，2H)，1.38(m，2H)，1.23(m，2H)。
4)S2-W’-C6-An的制备：
将Mm-C6-An(0.15g，0.47mM)溶于甲醇中，之后加入S2(52μL， 0.7mM)，反应。30min后，反应结束，减压浓缩去除溶剂，残渣经柱层析纯化，得到产物为白色固体粉末(0.2g，80％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ10.00(s，1H)，8.09(d，2H)，7.28(t，2H)，7.01(t，1H)，4.83(br，1H)，3.70(t，1H)，3.57(s，3H)，3.51(t， 2H)，3.02(m，2H)，2.80(m，1H)，2.67(m，3H)，2.25(t，2H)， 1.49(m，2H)，1.38(m，2H)，1.25(m，2H)。
5)S3-W’-C6-An的制备：
将Mm-C6-An(0.15g，0.47mM)溶于甲醇中，之后加入S3(164μL， 1.41mM)，反应。30min后，反应结束，减压浓缩去除溶剂，残渣经柱层析纯化，得到产物为白色固体粉末(0.17g，82％yield)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)：δ10.02(s，1H)，8.09(t，2H)，7.57(d，2H)，7.32-7.22(m，7H)，7.02(t，1H)，3.86(m，2H)，3.76(t，1H)， 3.56(s，3H)，3.05(m，2H)，2.91(m，1H)，2.67(m，1H)，2.24 (m，2H)，1.49(m，2H)，1.38(m，2H)，1.25(m，2H)。
6)S4-W’-C6-An的制备：
将Mm-C6-An(0.15g，0.47mM)溶于甲醇/二氯甲烷的混合溶液中(二者的体积比为1:2)中，之后加入S4(0.23g，1.41mM)和催化量的三乙胺，反应。4h后，反应结束，减压浓缩去除溶剂，残渣经柱层析纯化，得到产物为白色固体粉末(0.17g，75％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ12.77(br，1H)，10.00(s，1H)，8.23(s，1H)，7.55 (d，2H)，7.22(m，2H)，7.02(t，1H)，4.49(q，1H)，4.27(m， 2H)，3.75(t，2H)，3.57(s，3H)，3.03(q，2H)，2.98-2.88(m， 2H)，2.80(m，1H)，2.66(dd，1H)，2.24(t，2H)，1.87(s，3H)， 1.48(m，2H)，1.38(m，2H)，1.23(m，2H)。
实施例9制备的基于马来酸甲酯的连接子与小分子的偶联物结构如下表所示：
实施例9.1证明本发明提供的接头中的马来酸甲酯基团(Mm)可以与多种类型的巯基发生有效的偶联。
9.2含琥珀酰亚胺(Su)连接子-巯基小分子偶联物按照以下路线合成：
其中，R为：
1)Ma-C6-OH的制备：
将马来酸酐(4.86g，49.55mM)溶解于乙酸(150mL)中，全溶后加入6-氨基己酸(5.0g，38.11mM)，反应液加热到120℃回流6h。反应结束后，反应液冷却至室温后将其倾倒入蒸馏水之中，并采用乙酸乙酯多次萃取后合并有机相，乙酸乙酯有机相采用饱和NaCl溶液洗涤后，经无水Na2SO4干燥过夜。减压浓缩去除溶剂后，采用柱层析法纯化得到白色粉末状固体(5.92g，74％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 11.98(br，1H)，7.01(s，2H)，3.39(t，J＝7.3Hz，2H)，2.17(t， J＝7.3Hz，2H)，1.51-1.44(m，2H)，1.24-1.17(m，2H)。MS(ESI)m/z：210.0[M-H]-。
2)Ma-C6-An的制备：
将Ma-C6-OH(1.0g，4.73mM)溶解于四氢呋喃(15mL)中，全部溶解后置于-20℃的低温反应槽中降温，搅拌10min后，依次滴入NMM (0.63mL，5.68mM)和氯甲酸异丁酯(0.74mL，5.68mM)，滴加完毕后继续在-20℃下搅拌反应30min。之后滴入苯胺(0.65mL，7.1mM)，继续在-20℃下反应2h。反应结束后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)，并采用乙酸乙酯多次萃取后合并有机相，有机相采用饱和 NaCl溶液洗涤后，经无水Na2SO4干燥过夜。减压浓缩去除溶剂后，采用柱层析法纯化得到白色粉末状固体(0.8g，59％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)：δ9.85(s，1H)，7.57(d，2H)，7.28(t，3H)，7.03-6.99 (m，3H)，3.40(t，2H)，2.28(t，2H)，1.61-1.47(m，4H)，1.28-1.20 (m，2H)。
3)S1-Su-C6-An的制备：
将Ma-C6-An(150mg，0.52mM)溶解于甲醇/二氯甲烷混合溶液中 (15mL，体积比为1:2)，全部溶解后加入S1(140mg，0.55mM)，室温下反应10min后，减压蒸除溶剂得粗产品，粗品分散于***中(10mL) 打浆纯化，得产品为白色固体粉末(0.3g，82％yield)。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)：δ9.87(s，1H)，8.63(m，1H)，8.28(t，1H)，7.58 (d，2H)，7.33-7.21(m，7H)，7.01(t，1H)，4.52(q，1H)，4.29 (d，2H)，4.00(m，1H)，3.37(t，2H)，3.19-3.11(m，2H)，3.00 (d，1H)，2.82(t，1H)，2.28(m，2H)，1.87(t，3H)，1.61-1.46 (m，4H)，1.26(m，2H)。
4)S2-Su-C6-An的制备：
将Ma-C6-An(200mg，0.69mM)溶解于甲醇/二氯甲烷混合溶液中 (15mL，体积比为1:2)，全部溶解后加入S2(77μL，1.05mM)，室温下反应10min后，减压蒸除溶剂得粗产品，采用柱层析法纯化得到白色粉末状固体(0.24g，99％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.86(s，1H)，7.57(d，2H)，7.28(t，2H)，7.01(t，1H)，4.90 (s，1H)，3.58(t，2H)，3.37(t，2H)，3.16(m，1H)，2.87(m， 1H)，2.71(m，1H)，2.52(t，1H)，2.48(t，1H)，2.28(t，2H)， 1.58(m，2H)，1.49(m，2H)，1.26(m，2H)。
5)S3-Su-C6-An的制备：
将Ma-C6-An(200mg，0.69mM)溶解于甲醇/二氯甲烷混合溶液中 (15mL，体积比为1:2)，全部溶解后加入S3(123μL，1.05mM)，室温下反应10min后，减压蒸除溶剂得粗产品，采用柱层析法纯化得到白色粉末状固体(0.27g，95％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.86(s，1H)，7.58(d，2H)，7.37-7.24(m，7H)，7.01(t，1H)， 4.05-4.00(m，2H)，3.91(d，1H)，3.75(dd，1H)，3.35(t，2H)， 3.09(m，1H)，2.28(t，2H)，1.58(m，2H)，1.49(m，2H)，1.26 (m，2H)。
6)S4-Su-C6-An的制备：
将Ma-C6-An(100mg，0.35mM)溶解于甲醇/二氯甲烷混合溶液中 (15mL，体积比为1:2)，全部溶解后加入S4(57mg，0.35mM)，室温下反应10min后，减压蒸除溶剂得粗产品，采用柱层析法纯化得到白色粉末状固体(120mg，76％yield)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ12.57(br，1H)，9.86(s，1H)，8.32(t，1H)，7.58(d，2H)，7.27 (d，2H)，7.01(t，1H)，4.43(m，1H)，4.00(m，1H)，3.29(t， 2H)，3.15(m，1H)，3.04(m，0.5H)，2.85(m，0.5H)，2.28(d， 4H)，1.61-1.46(m，4H)，1.26(m，2H)。
实施例9制备的基于琥珀酰亚胺的连接子与小分子的偶联物结构如下表所示：
实施例10：包含马来酸酰胺结构(Maa)的连接子与细胞毒素MMAE 偶联物的制备
10.1 Maa-C6-Val-Ala-PAB-MMAE的制备
1)Maa-C6-Val-Ala-PAB的制备
以Maa-C6-OSu为原料，采用与Mm-C6-Val-Ala-PAB的类似方法合成 Maa-C6-Val-Ala-PAB，得到淡黄色固体粉末(78％yield)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ15.09(br，1H)，12.03(br，1H)，9.86(s，1H)， 9.43(s，1H)，8.12(d，J＝6.7Hz，1H)，7.84(d，J＝6.7Hz，2H)，7.53(t，2H)，7.23(d，2H)，6.31(d，1H)，6.21(d，1H)，5.12 (t，1H)，4.42(s，2H)，4.37(q，1H)，4.17(t，1H)，3.14(q， 2H)，2.24-2.10(m，2H)，1.97(m，1H)，1.48(m，4H)，1.31-1.24(m，5H)，0.85(dd，6H)。
2)Maa-C6-Val-Ala-PAB-PNP的制备：
以中间体Maa-C6-Val-Ala-PAB为原料，采用与 Mm-C3-Val-Ala-PAB-PNP类似的制备方法合成 Maa-C6-Val-Ala-PAB-PNP，得到淡黄色固体粉末(20％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ15.22(br，1H)，10.03(s，1H)，9.18(br， 1H)，8.32(d，J＝9.3Hz，2H)，8.22(d，1H)，7.84(d，J＝6.7Hz， 1H)，7.64(d，J＝8.4Hz，2H)，7.57(d，J＝9.0Hz，2H)，7.41(d， J＝8.4Hz，2H)，6.37(d，J＝12.6Hz，1H)，6.24(d，J＝12.6Hz， 1H)，5.24(s，2H)，4.40(m，1H)，4.18(t，J＝7.6Hz，1H)，3.16 (q，2H)，2.22-2.18(m，2H)，1.96(m，1H)，1.47(m，4H)，1.28 (m，5H)，0.86(m，6H)。
3)Maa-C6-Val-Ala-PAB-MMAE的制备
以连接子Maa-C6-Val-Ala-PAB-PNP为原料，采用与 Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE类似的制备方法合成 Maa-C6-Val-Ala-PAB-MMAE，得到白色固体粉末(57％yield)。MS(ESI) m/z：1249.2[M+H]+；1266.2[M+NH4]+；625.3[M+2H]2+；1247.1[M-H]-。
10.2 Maa-C6-Val-Cit-PAB-MMAE的制备
1)Maa-C6-Val-Cit-PAB的制备
以Maa-C6-OSu为原料，采用与Mm-C6-Val-Cit-PAB的类似方法合成 Maa-C6-Val-Cit-PAB，得到淡黄色固体粉末(84％yield)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ11.60(br，1H)，9.91(s，1H)，9.62(br，1H)， 8.11(d，J＝6.7Hz，1H)，7.89(d，J＝6.7Hz，1H)，7.54(d，2H)，7.23(d，2H)，6.21(m，1H)，6.05(m，1H)，5.45(d，2H)，5.11 (br，1H)，4.42(s，2H)，4.37(t，1H)，4.19(t，1H)，3.14(m， 2H)，3.05-2.91(m，2H)，2.23-2.11(m，2H)，1.96(m，1H)，1.70(m，1H)，1.59(m，1H)，1.54-1.33(m，6H)，1.26(m，2H)， 0.84(dd，6H)。
2)Maa-C6-Val-Cit-PAB-PNP的制备
以中间体Maa-C6-Val-Cit-PAB为原料，采用与 Mm-C6-Val-Ala-PAB-PNP类似的制备方法合成Maa-C6-Val-Cit-PAB-PNP，得到淡黄色固体粉末(16％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ15.22(br，1H)，10.10(s，1H)，9.31(br，1H)，8.31(d，J＝9.0 Hz，2H)，8.15(t，J＝5.2Hz，1H)，7.86(d，J＝8.4Hz，1H)，7.65 (d，J＝8.4Hz，2H)，7.57(d，J＝9.24Hz，2H)，7.41(d，J＝8.4Hz， 2H)，7.22(d，1H)，6.36(d，J＝12.6Hz，1H)，6.23(d，J＝12.6Hz， 1H)，6.03(s，1H)，5.46(s，2H)，5.24(s，2H)，4.42(m，1H)， 4.19(m，1H)，3.16(q，2H)，3.05-2.92(m，2H)，2.17(m，2H)， 1.97(m，1H)，1.73-1.57(m，2H)，1.52-1.44(m，6H)，1.27(m， 2H)，0.85(dd，6H)。MS(ESI)m/z：756.7[M+H]+；778.4[M+Na]+； 754.6[M-H]-。
3)Maa-C6-Val-Cit-PAB-MMAE的制备
以连接子Maa-C6-Val-Cit-PAB-PNP为原料，采用与 Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE类似的制备方法合成 Maa-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，得到白色固体粉末(57％yield)。MS(ESI) m/z：1334.3[M+H]+；689.5[M+2Na]2+。
实施例10制备的包含马来酸酰胺(Maa)的连接子和MMAE的偶联物的结构如下表所示：
实施例11：包含富马酸甲酯结构(Mf)的连接子与细胞毒素MMAE 偶联物的制备
11.1 Mf-C6-Val-Ala-PAB-MMAE的制备
1)Mf-C6-OH的制备
将富马酸单甲酯(2.0g，15.37mM)溶于二氯甲烷(50mL)中，加入4-甲基吗啉(2.54mL，23.06mM)，将溶液降温至-20℃。逐滴加入氯甲酸异丁酯(2mL)，-20℃搅拌3h。加入超声处理过的6-氨基己酸(2.02 g，15.37mM)的DMF(60mL)的悬浮液。在-20℃搅拌1h后，升温至室温，搅拌2h。蒸干溶剂，残余物为橙色油状物，加水(150mL)，使用浓盐酸将pH调至1，有固体析出。抽滤，干燥后，得到浅粉色固体(3.33 g，89％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.02(s，1H)， 8.54(t，1H)，7.00(d，1H)，6.57(d，1H)，3.72(s，3H)，3.15 (m，2H)，2.19(t，2H)，1.49(m，2H)，1.43(m，2H)，1.27(m， 2H)。MS(ESI)m/z：242.10[M-H]-。
2)Mf-C6-VA-PAB的制备
将Mf-C6-OH(0.61g，2.5mM)溶于DMF(8mL)中，加入EDCI (0.71g，3.7mM)、HOBt(0.5g，3.7mM)、DIPEA(0.61mL，3.7mM)，室温搅拌1h。加入Val-Cit-PABOH(0.87g，3.0mM)的DMF(12mL) 溶液，室温搅拌10h后，蒸干溶剂，使用粗硅胶拌样，硅胶柱分离，得到白色固体产物(1.05g，81％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.91(s，1H)，8.56(t，1H)，8.19(d，1H)，7.86(d，1H)，7.54 (d，2H)，7.23(d，2H)，7.01(d，1H)，6.56(d，1H)，5.13(br， 1H)，4.42(s，2H)，4.38(m，1H)，4.17(q，1H)，3.72(s，3H)， 3.12(m，2H)，2.16(m，2H)，1.96(m，1H)，1.43(m，4H)，1.31 (s，2H)，1.30(s，3H)，0.85(dd，6H)。MS(ESI)m/z：541.26[M+H]+。
3)Mf-C6-VA-PAB-PNP的制备
将Mf-C6-VA-PAB(0.5g，0.96mM)溶于DMF(8mL)中，加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(0.88g，2.89mM)、DIPEA(0.34mL，1.92mM)，室温搅拌10h后，蒸干溶剂。使用无水***超声处理，抽滤。干燥后研碎，按照20mL/g的比例加入乙酸乙酯，室温搅拌3h，抽滤，得到固体(0.49g，75％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.04(s，1H)， 8.53(br，1H)，8.31(d，2H)，8.22(d，1H)，7.85(d，1H)，7.64 (d，2H)，7.57(d，2H)，7.41(d，2H)，7.01(d，1H)，6.56(d， 1H)，5.24(s，2H)，4.39(t，1H)，4.18(t，1H)，3.71(s，3H)， 3.13(q，2H)，2.16(m，2H)，1.95(m，1H)，1.49(br，2H)，1.43 (t，2H)，1.31(d，3H)，1.24(m，2H)，0.85(dd，6H)。MS(ESI) m/z：684.29[M+H]+；706.27[M+Na]+；722.24[M+K]+。
4)Mf-C6-VA-PAB-MMAE的制备
将Mf-C6-Val-Ala-PAB-PNP(29.99mg，0.04387mM)溶于DMF(2 mL)中，依次加入HOBt(5.93mg，0.04387mM)、MMAE(30mg，0.04178 mM)、DIPEA(0.0056g，0.04387mM)，室温搅拌8h。将反应液转移至分液漏斗中，加入15mL水，使用20mL乙酸乙酯萃取4次。合并有机相，使用饱和氯化钠溶液冲洗有机相2次，将有机相静置1h后，蒸干溶剂，使用100mg粗硅胶拌样，硅胶柱分离，梯度洗脱得到产物为白色固体 (37mg，71％yield)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.21(br，1H)， 7.52(t，4H)，7.31(m，5H)，7.21(m，3H)，6.84(dd，1H)，6.74 (m，1H)，6.56(m，0.5H)，5.06(m，2H)，4.91(s，1H)，4.73 (m，3H)，4.46(t，1H)，4.23(m，1H)，4.12(m，1H)，4.02(m， 1H)，3.79(s，4H)，3.46(m，1H)，3.36(s，5H)，3.25(d，4H)， 3.12(d，1H)，2.99(s，2H)，2.88(d，3H)，2.73(d，0.5H)，2.43 (m，2H)，2.28(s，2H)，2.17(m，1H)，2.02(m，3H)，1.81(s， 2H)，1.63(m，3H)，1.51(m，2H)，1.38(d，2H)，1.30(t，3H)， 1.21(d，4H)，1.01(m，8H)，0.79(m，24H)。MS(ESI)m/z：1280.3 [M+NH4]+；1285.0[M+Na]+。
11.2Mf-C3-Val-Ala-PAB-MMAE的制备
1)Mf-C3-OH的制备
将富马酸单甲酯(2.0g，15.37mM)溶于二氯甲烷(50mL)中，加入4-甲基吗啉(2.54mL，23.06mM)，将溶液降温至-20℃。逐滴加入氯甲酸异丁酯(2mL)，-20℃搅拌3h。加入超声处理过的β-丙氨酸(1.37 g，15.37mM)的DMF(60mL)的悬浮液。在-20℃搅拌1h后，升温至室温搅拌2h。蒸干溶剂，使用无水***超声处理后，抽滤，得到棕色固体，使用粗硅胶拌样，硅胶柱柱层析，得到白色粉末状固体(0.72g，23％ yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.32(s，1H)，8.68(t， 1H)，7.01(d，1H)，6.60(d，1H)，3.72(s，3H)，3.36(t，2H)， 2.44(t，2H)。MS(ESI)m/z：200.06[M-H]-。
2)Mf-C3-Val-Ala-PAB的制备
将Mf-C3-OH(0.51g，2.53mM)溶于DMF(10mL)中，依次加入 EDCI(0.73g，3.79mM)、HOBt(0.51g，3.75mM)、DIPEA(0.66mL，
3.79mM)，室温搅拌1h后，加入Val-Ala-PABOH(0.89g，3.03mM) 的DMF溶液(20mL)。室温搅拌12h后，蒸干溶剂。使用粗硅胶拌样，硅胶柱分离，得到淡黄色固体(0.7g，58％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ9.86(s，1H)，8.63(t，1H)，8.21(d，1H)，7.98(d， 1H)，7.54(d，2H)，7.23(d，2H)，7.01(d，1H)，6.56(d，1H)， 5.12(t，1H)，4.42(d，2H)，4.39(m，1H)，4.19(t，1H)，3.71 (s，3H)，2.41(m，2H)，1.96(m，1H)，1.30(d，3H)，0.85(q， 6H)。MS(ESI)m/z：477.3[M+H]+；494.4[M+NH4]+；499.4[M+Na]+。
3)Mf-C3-Val-Ala-PAB-PNP的制备
将Mf-C3-VA-PAB(0.3g，0.63mM)溶于DMF(6mL)中，加入双 (4-硝基苯基)碳酸酯(0.57g，1.89mM)、DIPEA(0.22mL，1.26mM)，室温搅拌10h。将反应液逐滴加入到蒸馏水(60mL)中，抽滤，得到灰色固体。干燥后，使用无水***(15mL)超声处理，抽滤，再使用乙酸乙酯(15mL)室温搅拌三小时，得到深红色固体(0.3g，74％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.02(s，1H)，8.62(br，1H)， 8.32(d，2H)，8.26(d，1H)，8.00(d，1H)，7.64(d，2H)，7.57 (d，2H)，7.41(d，2H)，7.01(d，1H)，6.56(d，1H)，5.24(s，2H)，4.38(m，1H)，4.20(t，1H)，3.71(s，3H)，2.41(br，2H)， 1.96(m，1H)，1.31(d，3H)，0.86(dd，6H)。MS(ESI)m/z：642.3 [M+H]+；659.6[M+NH4]+；664.4[M+Na]+。
4)Mf-C3-Val-Ala-PAB-MMAE的制备
将Mf-C3-VA-PAB-PNP(46.89mg，0.07312mM)溶于DMF(4mL) 中，依次加入HOBt(9.88mg，0.07312mM)、MMAE(50mg，0.07312 mM)、DIPEA(13μL，0.07312mM)，室温搅拌8h。将反应液倒入分液漏斗中，加入40mL的水，使用20mL乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，使用饱和氯化钠溶液冲洗有机相两次，用乙酸乙酯萃取饱和氯化钠溶液一次。合并有机相，将有机相静置1h后，蒸干溶剂，使用180mg粗硅胶拌样，硅胶柱分离，得到产物为白色固体(61mg，68％yield)。1H-NMR (400MHz，CDCl3)：δ7.63(m，1H)，7.34(m，6H)，7.16(d，1H)， 6.78(d，1H)，5.30(s，2H)，5.01(m，0.5H)，4.92(m，1H)，4.73 (m，1H)，4.64(m，1H)，4.42(m，0.5H)，4.21(m，3H)，4.03 (m，0.5H)，3.88(m，0.5H)，3.76(s，4H)，3.54(m，3H)，3.40 (s，5H)，3.36(m，1H)，3.29(s，3H)，3.01(s，2H)，2.89(t， 4H)，2.64(m，2H)，2.42(m，2H)，2.19(m，1H)，2.03(m，5H)， 1.84(br，6H)，1.45(m，4H)，0.98(m，8H)，0.84(m，24H)。 MS(ESI)m/z：1221.0[M+H]+；1238.0[M+NH4]+；1243.1[M+Na]+。
11.3 Mf-C6-Val-Cit-PAB-MMAE的制备
1)Mf-C6-VC-PAB的制备
将Mf-C6-OH(0.53g，2.20mM)溶于DMF(10mL)中，加入EDCI (0.63g，3.29mM)、HOBt(0.44g，3.29mM)、DIPEA(0.57mL，3.29 mM)，室温搅拌1h。加入Val-Cit-PABOH(1g，2.64mM)的DMF溶液(20mL)，室温搅拌10h后，蒸干溶剂，使用粗硅胶拌样，硅胶柱分离，得到白色固体产物(0.52g，39％yield)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.93(s，1H)，8.54(t，1H)，8.07(d，1H)，7.83(d，1H)，7.55 (d，2H)，7.22(d，2H)，7.01(d，1H)，6.56(d，1H)，6.03(t， 1H)，5.42(s，2H)，5.10(t，1H)，4.42(d，2H)，4.37(m，1H)， 4.19(m，1H)，3.72(s，3H)，3.15(m，2H)，2.99(m，2H)，2.16 (m，2H)，1.98(m，1H)，1.66(m，2H)，1.44(m，6H)，1.25(m， 2H)，0.84(dd，6H)。MS(ESI)m/z：605.5[M+H]+；627.5[M+Na]+。
2)Mf-C6-VC-PAB-PNP的制备
将Mf-C6-Vit-Cit-PAB(0.3g，0.496mM)溶于DMF(8mL)中，加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(0.45g，1.49mM)、DIPEA(0.17mL，0.99 mM)，室温搅拌12h。将反应液逐滴加入到70mL蒸馏水中，抽滤，得到固体干燥后，使用无水***处理，按照20mL/g的比例使用乙酸乙酯室温搅拌3h，抽滤，得到浅黄色固体(0.27g，71％yield)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ10.09(s，1H)，8.53(br，1H)，8.32(d，2H)， 8.15(d，1H)，7.84(d，1H)，7.65(d，2H)，7.57(d，2H)，7.41(d，2H)，6.98(d，1H)，6.56(d，1H)，5.99(br，1H)，5.45(s， 2H)，5.24(s，2H)，4.38(br，1H)，4.19(t，1H)，3.71(s，3H)， 3.13(d，2H)，3.03(m，1H)，2.93(m，1H)，2.16(m，2H)，1.99 (s，1H)，1.93(m，1H)，1.69(m，1H)，1.60(m，1H)，1.49(m， 1H)，1.43(t，2H)，1.25(m，4H)，0.84(dd，6H)。MS(ESI) m/z：770.6[M+H]+；792.4[M+Na]+。
3)Mf-C6-Vit-Cit-PAB-MMAE的制备
将Mf-C6-Val-Cit-PAB-PNP(68mg，0.0877mM)溶于DMF(6mL) 中，依次加入HOBt(11.86mg，0.0877mM)、MMAE(60mg，0.0836mM)、 DIPEA(15μL，0.0877mM)，室温搅拌8h。将反应液倒入分液漏斗中，加入40mL水，使用20mL乙酸乙酯萃取6次。合并有机相，使用饱和氯化钠溶液冲洗有机相2次，用乙酸乙酯萃取饱和氯化钠溶液2次。合并有机相，将有机相静置1h后，蒸干溶剂，使用200mg粗硅胶拌样，硅胶柱分离，得到产物为白色固体。(63mg，56％yield)。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ10.01(br，1H)，8.54(t，1H)，8.13(d，1H)，7.92 (d，0.5H)，7.84(d，1H)，7.67(d，0.5H)，7.58(d，2H)，7.30 (m，6H)，7.16(m，1H)，7.01(d，1H)，6.57(d，1H)，6.00(br， 1H)，5.45(br，2H)，5.37(d，0.5H)，5.01(m，2H)，4.74(m， 0.5H)，4.64(m，0.5H)，4.42(m，3H)，4.23(m，2H)，3.98(m， 2H)，3.71(s，3H)，2.91(m，8H)，2.41(d，1H)，2.21(m，6H)， 1.98(m，4H)，1.74(m，4H)，1.49(m，8H)，1.26(m，6H)，1.02 (m，9H)，0.91(m，4H)，0.82(m，24H)。MS(ESI)m/z：1349.3 [M+H]+；1371.0[M+Na]+。
实施例11制备的包含富马酸甲酯的连接子和MMAE的偶联物的结构如下表所示：
实施例12：ADC的制备
将实施例7制备的连接子-MMAE偶联物偶联于抗HER2人源化单克隆抗体上。
1)常用缓冲盐溶液的配制：
缓冲盐溶液-1(buffer-1)：取3.11g的L-组氨酸，溶于1L二次蒸馏水中，全部溶解后，采用医用冰醋酸调其pH＝5.50左右(±0.05)；经0.22 μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
缓冲盐溶液-2(buffer-2)：称取TRIS·base 6.06g、EDTA·2Na 0.93g 溶解后，定容到100mL；另称取TRIS·HCl 7.88g、EDTA·2Na 0.93g溶解后，同样也定容到100mL；向TRIS·base溶液中加入TRIS·HCl溶液，互调使其pH＝8.50(±0.05)；经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
缓冲盐溶液-3(buffer-3)：采用移液枪量取医用冰醋酸1.715mL，溶解于200mL二次蒸馏水中，充分混匀后，经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
2)抗体偶联反应：
①药用抗体的置换：偶联所采用的抗HER2人源化单克隆抗体mil40 (购买于浙江海正药业股份有限公司)，为赫赛汀的生物仿制药，其初始的制剂溶液中包含盐酸组氨酸(一水)0.616mg/ml、L-组氨酸0.364mg/ml、海藻糖22.727mg/mL、吐温-20 100mg/mL等药用辅料，为去除辅料干扰，首先将冻融的抗体原液置于室温缓慢融化，并经G25葡聚糖凝胶柱，将其置换到缓冲液-1中。置换完成后，通过超滤离心进行浓缩(终浓度＞5 mg/mL)，并通过紫外分光光度计对其浓度进行测定。
②偶联反应液的准备：根据所需偶联抗体的量(1eq)，采用移液枪精确移取抗体的buffer-1溶液，并补加一定量的buffer-1，使得抗体浓度约为10mg/mL。采用buffer-2调其pH＝6～8左右，并用移液枪将其转移至洁净的反应小瓶中。
③抗体的还原：缓慢搅拌小瓶中的反应液(100rpm)，并加入2～5 eq的2.87mg/mL的TCEP·HCl溶液，加完后，室温下徐徐搅拌，反应60 ～180min。
④抗体的偶联：计算需要加入有机溶剂(DMAC或DMSO)的体积，使其占总体积的5％～15％；同时计算需要加入的小分子荷载(连接子 -MMAE偶联物)的质量，通常小分子荷载需要稍微过量(通常为8eq)，进而计算出所需加入的荷载的有机溶剂的浓度。精确配制荷载的溶液后，将其缓慢滴加到已经还原的抗体反应液中。室温下继续缓慢搅拌，根据具体偶联情况反应0.5～5h。
⑤反应的终止：反应液达到预定的偶联时间后，加入过量的包含还原性巯基的水溶性小分子N-乙酰基半胱氨酸溶液(1.63mg/mL)，缓慢搅拌继续反应30min。
⑥产物初步纯化：待偶联的终止反应结束后，加入buffer-3回调反应液的pH约为5.50；所得的反应液经过滤后，采用G25葡聚糖凝胶柱进行初步纯化，收集前段(约为80％)的组分流出液，再次经超滤浓缩后，无菌过滤并进行样品分装；除预留的用于产品分析的部分样品置于4℃下短期存储外，其它产品置于-80℃下存储待用。
采用上述方法，将Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE、 Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE、Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE和 Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE替代物分别偶联于抗体之上，制备得到以下 ADC：
ADC-I：MAB-W’-C3-Val-Ala-PAB-MMAE：
其中：MAB为抗体，n约为4或8。
ADC-II：MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE：
其中：MAB为抗体，n约为4或8。
ADC-III：MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE：
其中：MAB为抗体，n约为4或8。
ADC-IV：MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE替代物：
其中：MAB为抗体，n约为4或8。
实施例13：基于不同结构连接子的ADC(DAR约为8)的稳定性实验
本实施例评估了基于琥珀酰亚胺连接子的ADC (MAB-Su-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，Su-E8；其制备方法请参照Int J Mol Sci.,2017,18(9):1860.)和基于马来酸甲酯连接子的ADC(实施例12制备的MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE，W’-E8)在过量游离巯基物质N-乙酰半胱氨酸(NAC)存在的情况下的毒素脱靶情况，监测指标为两种ADC 的DAR随时间的变化。将受试ADCs置换于PBS缓冲液中(内含NAC， 0.41mg/mL，pH＝7.4)并放置于37℃恒温箱之中孵育，在设定的各时间点(0,1,2,4,8,12,24,48,72h,and 7 days)分别取样200μL，取样后冷冻于-20℃，待取样结束后，统一采用HPLC-HIC检测ADC的DAR随时间的变化(图6)，其中DAR初始值约为8。
图6所示试验数据表明，基于马来酸甲酯连接子(W’)的ADC具有显著的优于基于琥珀酰亚胺(Su)连接子的ADC的体外稳定性，在捕获剂NAC存在的情况下，21天内未发生明显的毒素脱靶；相比之下，具有琥珀酰亚胺连接子(Su)的ADC在相同的条件下毒素脱靶约35％。
本实施例中用到的化合物MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE和 MAB-Su-C6-Val-Cit-PAB-MMAE(DAR约为8)的结构式如下：
实施例14：不同结构的连接子与小分子的偶联物的稳定性实验
本实施例评估了基于马来酸甲酯连接子的小分子偶联物(实施例9制备的Conjugate-1、Conjugate-2和Conjugate-3)和基于琥珀酰亚胺连接子的小分子偶联物(实施例9制备的Conjugate-1’、Conjugate-2’和 Conjugate-3’)在过量游离巯基(Cys)存在的情况下的稳定性情况，监测指标为基于两种不同连接子的小分子偶联物在溶液中的剩余含量随时间的变化。将各受试物溶解于DMSO之中，并10倍体积稀释于包含半胱氨酸的PBS缓冲液中(Cys浓度为0.41mg/mL，pH＝7.4)并放置于37℃恒温箱之中孵育；t＝0另取各样品200μL置于-80℃储存以作对照。各溶液孵育7天后，分别取样，统一采用RP-HPLC检测底物剩余量随时间的变化，其中t＝0时的底物峰面积定义为100％。实验结果见下表。
上述稳定性试验数据表明，在捕获剂Cys存在条件下，基于开环马来酰单甲酯的连接子(W’)的小分子偶联物(Conjugate-1、Conjugate-2和 Conjugate-3)与基于琥珀酰亚胺连接子(Su)的小分子偶联物(Conjugate-1’、 Conjugate-2’和Conjugate-3’)相比，具有显著体外稳定性优势。在37℃， pH＝7.4的温和条件下，经过7天的孵育，基于马来酰亚胺连接子的小分子偶联物未发生明显的脱靶(＜10％)；相比之下，具有琥珀酰亚胺连接子的小分子偶联物在相同的条件下脱靶率约为50％。
实施例15：不同结构的连接子与抗体的偶联实验
15.1基于马来酸酰胺结构(Maa)的连接子与抗体的偶联
具有Maa连接子的ADC
本发明尝试采用马来酰亚胺开环后的得到的马来酸酰胺结构(Maa) 的接头进行抗体偶联，以通过一步法实现制备得到稳定的具有Maa连接子的ADC。首先合成具有马来酸酰胺(Maa)结构的连接子，将其与毒素 MMAE偶联得到相应荷载共2个：Maa-C6-Val-Ala-PAB-MMAE和 Maa-C6-Val-Cit-PAB-MMAE(按照实施例10描述的方法制备得到)。将上述的两个具有马来酸酰胺结构(Maa)的两个偶联物荷载，分别与抗体进行偶联，希望通过工艺优化得到稳定性羧酸型接头的目标ADC。然而，在磷酸盐缓冲液(PBS)、组氨酸缓冲液(L-His)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TRIS)等多个体系中，经过pH、温度、反应时间、物料比等条件的优化，仍只能实现将极少量的Maa-C6-Val-Ala-PAB-MMAE或 Maa-C6-Val-Cit-PAB-MMAE偶联于抗体之上，偶联结果见表1。得到的 ADC毒素MMAE携带量过低，产品是不满足要求的，而理想DAR(Drug -Antibody ratio，DAR)约为4。
表1 基于马来酸酰胺(Maa)结构的连接子与抗体的偶联结果
上述实验说明，基于马来酸酰胺结构(Maa)的连接子的ADC，即，具有琥珀酰亚胺开环结构连接子的ADC，无法通过制备直接得到。
15.2基于富马酸甲酯(Mf)结构的连接子与抗体的偶联
通过逆合成分析，我们进一步设计了具有富马酸甲酯连接子(Mf)和马来酸甲酯连接子(Mm)的偶联物，以期可以得到合成易得，且结构稳定的包含新型稳定性连接子结构的ADC。理论上，富马酸甲酯接头(Mf) 和马来酸甲酯连接子(Mm)均可以与巯基发生迈克尔加成反应(Michael addition reaction)，得到具有开环接头结构的甲酯型产物。
本实施例中，首先制备了3种基于富马酸甲酯结构(Mf)的连接子- 细胞毒素偶联物：Mf-C6-Val-Ala-PAB-MMAE、 Mf-C3-Val-Ala-PAB-MMAE、Mf-C6-Val-Cit-PAB-MMAE(按照实施例11 描述的方法制备得到)，分别将其与抗体进行偶联，偶联结果见表2。同 14.1相似，经过多种偶联条件的优化也只能实现将少量的连接子-细胞毒素偶联物修饰于抗体之上，证明富马酸甲酯连接子同样无法实现开环ADC 的偶联。偶联模式如下：
表2 基于富马酸甲酯(Mf)结构的连接子与抗体的偶联结果
15.3基于马来酸甲酯(Mm)结构的连接子与抗体的偶联
将本发明实施例7制备的基于马来酸甲酯结构(Mm)的连接子-细胞毒素偶联物：Mm-C6-Val-Ala-PAB-MMAE、Mm-C3-Val-Ala-PAB-MMAE、 Mm-C6-Val-Cit-PAB-MMAE分别与抗体进行偶联。偶联结果与实施例1 和实施2完全不同，马来酸甲酯连接子结构(Mm)具有理想的抗体偶联性能，在多种缓冲液体系中(PBS、L-His、TRIS)，在温和的条件下(pH ＝5～10，0～40℃)可以快速有效的实现偶联，偶联结果见表3，其偶联模式如下：
表3 基于马来酸甲酯(Mm)结构的连接子与抗体的偶联结果
上述实验结果表明，本发明提供的具有马来酸甲酯连接子结构(Mm) 的连接子取得了令人意想不到的效果。马来酸甲酯连接子结构(Mm)可以在温和的生物学条件下与抗体中的巯基发生快速的偶联，通过一步法制得具有开环甲酯连接子结构(W’)的活性剂偶联物。其中，偶联过程是快速有效的，而且具有马来酸甲酯连接子结构(Mm)的连接子以及相关的连接子-细胞毒素偶联物的制备过程简单，很容易实现工艺放大过程。
实施例16：具有开闭环连接子的ADC(DAR约为4)的体外细胞毒性测试
受试化合物包括3对：MAB-W’-C6-Val-Cit-PAB-MMAE(W’-C6-VC) 和MAB-Su-C6-Val-Cit-PAB-MMAE(Su-C6-VC)、 MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE(W’-C6-VA)和 MAB-Su-C6-Val-Ala-PAB-MMAE(Su-C6-VA)、 MAB-W’-C3-Val-Ala-PAB-MMAE(W’-C3-VA)和 MAB-Su-C3-Val-Ala-PAB-MMAE(Su-C3-VA)。结构分别如下：
阳性对照药为抗HER2人源化单克隆抗体mil40(MAB)(购买于浙江海正药业股份有限公司)，细胞毒素MMAE(购买于Concortis Biosystems)。选取的细胞系包括HER2抗原阳性的乳腺癌细胞系BT-474 和HCC1954，HER2抗原阳性的卵巢癌细胞系SK-OV-3，HER2抗原阳性的胃癌细胞系NCI-N87，HER2抗原弱阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，HER2抗原阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-468(购自ATCC)。
试验过程中的试剂、仪器和消耗品如下表所述：
试验过程如下所述：
1)细胞解冻
a)在37℃的水浴中轻轻晃动小瓶进行解冻；b)内容物全部解冻后，从水浴中取出小瓶，通过浸入或用70％乙醇喷洒进行净化消毒；c)将小瓶内容物转移到含有9mL完全培养基(细胞系BT-474、MCF-7使用 DMEM培养基，细胞系NCI-N87、HCC1954和MDA-MB-468使用RPMI1640培养基，细胞系SK-OV-3使用Mccoy’s 5A培养基；下文所述的培养基与此处相同)的离心管中，并以约200×g转速离心5分钟；d) 用培养基重悬细胞沉淀并分配到75cm2培养瓶中；e)将培养物在37℃， 5％CO2培养箱中进行培养。
2)展开细胞
a)细胞在含有10％FBS(热灭活)和1％青霉素/链霉素溶液 (Penicillin-Streptomycin)的培养基中以1:4的比例每周传代三次；b)对于传代细胞，首先用0.05％的胰蛋白酶/EDTA溶液(3mL)冲洗贴壁细胞，然后加入胰蛋白酶/EDTA(3mL)并涡旋以均匀涂覆细胞。培养物在37℃下培养直到细胞分离(在显微镜下验证细胞已分离)。加入等体积的细胞培养基灭活胰蛋白酶，收集分离的细胞，并采用200×g离心细胞5分钟，之后重新悬于新鲜培养基中。
3)准备化合物
a)以1：3比例串联稀释化合物以产生10点稀释(化合物母液为浓度约为2mg/mL的L-His缓冲盐溶液，采用PBS进行稀释，测试点初始最大浓度约为500μg/mL)；b)将4μL化合物分配到384孔板中。
4)细胞播种
a)收获细胞并计数细胞数量；b)将36μL具有调整密度的细胞悬液加入到指定的384孔细胞培养板中。最终细胞密度约为1,000个细胞/孔；c) 盖上盖子，置于37℃，5％CO2和0.1％O2培养箱中孵育96小时。
5)读板
a)96小时后，从培养箱中取出平板并在室温下平衡10分钟；b) CellTiter Glo试剂在实验前在37℃孵育；c)将40μL的CellTiter-Glo试剂加入待检测的每个孔中(与培养基1：1)；d)然后将板放置在室温下 30分钟，然后在EnSpire阅读器上阅读，进行细胞计数。
6)数据分析
采用以下公式计算Remaining activity：
Remaining activity(％)＝100％×(S–M)/(V–M)
S:Readout of test sample
V:Readout of vehicle sample
M:Readout of well with compounds treatment
应用Xlfit(v5.3.1.3),equation 201拟合曲线，计算IC50值。
7)实验结果
实验结果见表4。结果表明基于开环的马来酸甲酯连接子的ADC与基于闭环的琥珀酰亚胺连接子的ADC具有基本相当的体外细胞毒性。
表4 体外细胞毒性实验结果
实施例17：具有开闭环连接子的ADC(DAR约为4)的体内药效实验
本实验采用HER2表达的人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型(购自ATCC)对受试化合物进行药效评价。其中，受试化合物为 MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE(W’-C6-VA，ADC-II)，设置3个剂量组，给药剂量分别为1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg。同时设置阳性对照组和空白对照组。阳性对照1组给于等剂量的抗HER2人源化单克隆抗体 mil40(MAB)和MMAE的混合物，阳性对照2组给于等计量的包含闭环型琥珀酰亚胺连接子(Su)的ADC(MAB-Su-C6-Val-Ala-PAB-MMAE (Su-C6-VA))。溶剂对照组给予等剂量的生理盐水。将受试药物溶解于生理盐水经尾静脉注射给药。由于MMAE不溶于水，因此在配置抗HER2 人源化单克隆抗体mil40(MAB)和MMAE的混合物溶液时，先将MMAE 溶解于DMSO中配制得到1mg/mL的溶液，然后将该溶液溶解于含有 mil40抗体的生理盐水中混匀，即得。
将BT-474人乳腺癌细胞(购买于ATCC)用含有灭活的10％胎牛血清，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素以及2mM谷氨酰胺的 DMEM培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养。细胞培养起始浓度为1 ×106个/毫升，每隔3～4天待细胞长满后分瓶传代。将处于对数生长期的癌细胞接种到SCID小鼠(雌性，6-8周龄，18-22g，购买于北京安凯毅博生物技术有限公司)的右侧胁肋部皮下，待肿瘤生长至150立方毫米体积时，造模成功。然后开始给药，每个剂量组6只小鼠，每周按设定剂量给药1次，给药体积均为5mL/kg，共给药4次。所有小鼠接种癌细胞的前一天开始皮下注射***(兽用苯甲酸***注射液，4mg/2mL，购自四川蓝晟制药有限公司)直到实验结束，每周两次，每次40μg/20μL。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行两次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2。在进行肿瘤体积测量的同时，称量小鼠体重。记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动、进食等一般状态。
为给药后肿瘤体积随时间的变化曲线如图7所示，结果显示，与溶剂对照组相比，阳性对照1组中所有动物的肿瘤发生萎缩，但只是出现部分抑制，所有动物的肿瘤依旧存在；而在受试化合物治疗组(2.5mg/kg)中，所有受试动物体内肿瘤均全部消失并且持久消退，在停药一个月后没有动物发生肿瘤复发。
相同给药剂量下，基于不同结构连接子的ADC的抑瘤效果如图8所示，结果显示，在2.5mg/kg剂量下，阳性对照2组中小鼠肿瘤未完全消失，而受试化合物治疗组中小鼠肿瘤完全消失，这表面本发明提供的基于开环的马来酸甲酯连接子的ADC与基于闭环的琥珀酰亚胺连接子的ADC 相比，具有更优的药效(p＝0.0061)。
在剂量依赖关系的研究中，受试化合物共设置了1.0mg/kg、2.5mg/kg、 5.0mg/kg三个剂量组。不同给药剂量下，ADC的抑瘤效果见图9，结果显示，本发明的包含开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC的抑瘤活性表现出明显的剂量依赖性，其中，中高剂量组均出现肿瘤消失。
接受本发明的包含开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC治疗后，动物体重变化曲线见图10。结果显示，受试化合物治疗组与溶剂对照组基本不存在明显差异，所有受试动物均呈现体重稳步上升，说明本发明提供的ADC副作用小。
实施例18：MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE在异种移植模型治疗剂量下的血液学分析
为了进一步验证基于马来酸甲酯连接子(W’)的ADC (MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE)的用药安全性，在BT-474异种移植模型给药结束(即第一次给药后的第28天)和观察期结束(即第一次给药后的第58天)时，分别对受试动物进行了取血并进行全血分析。主要的血液学测试指标包括白细胞(WBC)，红细胞(RBC)，血小板(PLT)，嗜中性粒细胞(Neuts)和淋巴细胞(Lymph)等。从每只受试动物体内抽取100μL全血。由于体积限制，这些样品被稀释3倍以实现最终的血细胞计数。基于修正的稀释因子的数量分析数据，结果以平均值±SD表示。
接受本发明的基于开环型马来酸甲酯连接子(W’)的ADC治疗后，三个受试剂量组(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg)动物的血液学分析结果见图11，其中数字“1”和“2”分别代表在给药后第28天和第58天时受试动物全血分析的结果。对两批血样的各血液学参数的ANOVA分析结果显示，空白对照组和受试化合物治疗组(1mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)之间并没有表现出显著的差异。上述结论表明，本发明提供的基于开环型马来酸甲酯连接子的ADC具有低的血液毒性和脱靶骨髓毒性，这也很有可能是其被良好耐受的主要原因。
实施例19：MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE在异种移植模型治疗剂量下的组织病理学分析
在BT-474异种移植物模型测试结束时，发明人对基于开环型甲酯接头(W’)的ADC(MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE)受试动物进行了组织病理学研究。检测器官主要包括骨髓、心脏，肝脏和肺脏。将心脏，肝脏和肺脏的组织样品在10％***中固定24小时并转移至70％乙醇中。通过70％乙醇，85％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，100％乙醇进行脱水，然后使用二甲苯处理3次，而后用石蜡进行包埋，切片并进行H&E染色。将骨髓制成涂片。用放大镜观察和观察组织切片和骨髓涂片，并在显微镜下拍摄，结果见图12，其中每个给药组包含6只动物，图片原始尺寸为425 ×320μm。
结果显示，与溶剂对照组相比，受试化合物治疗组同样没有表现出显著性差异，该实验这进一步证实了本发明提供的ADC的用药安全性。
实施例20：MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE(DAR约为4)的大剂量耐受试验
本实施例在正常CD-1小鼠模型上，评估了基于开环型甲酯连接子(W’) 的ADC(MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE，DAR约为4)的最大耐受剂量。
试验所用CD-1小鼠[Crl:CD-1(ICR)]购买于维通利华实验动物技术有限公司，大约7-9周龄，雄性大约22-40g，雌性大约20-35g。每个受试药剂量组6只动物(雌雄各半)；动物单笼饲养在聚碳酸酯实底鼠盒中，垫料为玉米芯，动物自由采食啮齿类饲料、自由摄入水瓶中的饮水，受控环境温度维持在20-26℃，相对湿度设定维持在40-70％，动物房照明保持12小时明/暗交替。
受试药溶解于生理盐水后经尾静脉注射进行给药，给药设置五个剂量组：10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、120mg/kg，给药体积为 5mL/kg。动物给药后观察期为15天，试验终止时或试验过程中的濒死动物采用吸入70％CO2/30％O2的方式进行安乐死。给药后的观察期内，每日 2次进行笼旁观察(包括动物死亡或濒死、动物一般健康状态和药物毒性反应症状)；给药前1天，以及此后的连续14天，每天进行1次受试动物的体重测试和详细临床观察(包括动物的皮肤、被毛、眼睛和粘膜的变化，呼吸系统、循环系统、自主和中枢神经系统、躯体运动和行为模式等的改变)。
在上述受试药物耐受性试验研究中，在10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg等剂量组中的所有动物经受试药物ADC-II (MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE)给药后，均未发生显著的耐受性毒性和动物死亡。在最大给药剂量组120mg/kg给药组中，给药后小鼠1-5 天体重出现持续下降，并且受试动物出现死亡(6只受试动物死亡2只)；另外，所有120mg/kg受试组的存活动物从给药后的第9天起颈部、腹部侧面以及四肢出现不同程度的脱毛现象，部分受试动物脱毛处有结痂并且皮下有颗粒状凸起，上述症状至试验终止期(给药后第15天)仍未发生显著改善。说明120mg/kg的给药剂量已经达到ADC-II (MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE)的最大耐受剂量(Maximal tolerance dose，MTD)。
以ADC-II为例，在HER2表达的人乳腺癌细胞系BT-474的小鼠异种移植模型试验中，给药剂量为2.5mg/kg时，受试动物体内肿瘤可以发生全部消失且停药后1月内不复发(实施例16)，在本耐受性安全评价研究中，给药剂量为80mg/kg尚未出现由于受试物剂量相关性毒性，给药剂量为120mg/kg时受试动物出现部分死亡，说明ADC受试化合物 MAB-W’-C6-Val-Ala-PAB-MMAE耐受性比较理想，具有较高的治疗指数。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
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