包含甘露糖寡糖的组合物及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 包含甘露糖寡糖的组合物及其制备方法和用途 (Compositions comprising mannose oligosaccharides, methods of making and uses thereof ) 是由 布鲁诺·弗雷德里克·斯坦格尔 克里斯托夫·弗朗兹·库斯特尔斯 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种包含甘露糖寡糖的组合物及其制备方法。本发明进一步涉及一种包含甘露糖寡糖的组合物,其用于处理人或动物。(The invention relates to a composition containing mannose oligosaccharide and a preparation method thereof. The invention further relates to a composition comprising mannose oligosaccharides for use in the treatment of a human or animal.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月14日提交的欧洲专利申请号17175981.4的权益，其通过引用方式整体在此并入。
发明领域
本发明涉及一种包含甘露糖寡糖的组合物及制备这种组合物的方法。本发明进一步涉及包含本发明的组合物的动物饲料。本发明进一步涉及根据本发明的组合物，其用于处理人或动物，特别是用于促进人和动物的生长和/或饲料利用和/或减少细菌感染。
发明背景
目前存在对营养补充剂的需求，以改善人、农场动物、养殖的鱼类和宠物的整体健康，特别是肠道健康。
随着世界人口的增加，对用于人类消耗的动物蛋白的需求也不断增长。动物生产行业正面临着饲养更多动物的挑战，并且这通过增加动物群体并且还通过提高动物生长性能且总体上改善动物健康状况来实现。动物健康和动物生长性能是成功养殖动物的关键因素。具体而言，对于动物生长性能，胃肠道健康和胃肠道完整性是必不可少的因素，且饲料添加剂可用于实现这一目标。另一个主要问题是细菌污染，尤其是在家禽和猪中。在动物养殖中抵抗细菌污染的一种广泛使用的方法是，例如，在动物中使用某些物质(如抗生素)来减少不希望有的细菌群体，而不是杀死细菌，这通过防止有害细菌附着在肠道表面上的结合机制来实现。
并且，食品中的细菌污染代表了一个重要的食品安全问题，且必须加以管理和减少。特别是沙门氏菌和大肠杆菌的污染是食品供应链中的重要问题。
已知甘露糖寡糖组合物可改善整体健康，特别是肠道健康。当前市场上现有的甘露糖寡糖(或甘露寡糖或MOS)组合物都是提取物，如酵母提取物，主要是酵母细胞壁提取物、生咖啡豆提取物、魔芋提取物等。它们都呈现以下缺点：不是高纯度的组合物，且没有一致的组成，尤其是对于酵母细胞壁提取物而言，因此它们在动物中的作用不太可预测，且其效果非常不稳定。而且，它们大多数不溶于水。结果，它们在液体饲料和饮用水中的应用是不实际的，且因此受到限制。此外，由于产生许多废物流，这种甘露糖寡糖组合物的生产过程对环境的影响不可忽略。
WO2015160818 A1涉及富集的酵母细胞壁组合物的生产，所述组合物包含可溶性酵母细胞壁MOS。
因此，显然仍需要提供更有效的饲料添加剂。还需要提供以更环保的方式产生的饲料添加剂。本发明解决那些需求。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种包含甘露糖寡糖的组合物(“本发明的甘露糖寡糖组合物”)，其特征在于所述组合物可溶于水。
在另一方面，本发明涉及一种食品、动物饲料、鱼饲料或宠物食品产品，其包含本发明的甘露糖寡糖组合物和其他食品、动物饲料或宠物食品成分。
在另一方面，本发明涉及一种个人护理或药物组合物，其包含本发明的甘露糖寡糖组合物和其他个人护理或药物成分。
在另一方面，本发明涉及一种化妆品、个人护理或药物产品，其包含本发明的甘露糖寡糖组合物。
在另一方面，本发明涉及一种制备包含甘露糖寡糖的组合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)通过使甘露糖在酸化催化剂的存在下在180℃至240℃，优选195℃至240℃的温度下通过微反应器来缩聚甘露糖，以产生含甘露寡糖的组合物，
b)任选地使所述甘露寡糖组合物中和和/或脱色，
c)任选地精制所述甘露寡糖组合物，
d)收集所述甘露寡糖组合物。
在另一方面，本发明涉及本发明的甘露糖寡糖组合物用于处理人或动物的用途或用于处理人或动物的甘露糖寡糖组合物。
具体实施方式
使用“一个”或“一种”来描述本文中的各种元素或组分仅是出于方便原因并且给出本发明的一般含义。该描述应被理解为包括一个或至少一个，且单数也包括复数，除非很明显地意味着另外的意思。
在本说明书中，术语甘露糖寡糖、甘露寡糖和MOS可互换使用以描述它们。甘露糖寡糖被定义为DP为3或3以上的甘露糖寡糖。DP是指聚合度，即寡糖中存在的单体数量。在甘露糖寡糖中，单体是甘露糖。本发明的甘露糖寡糖组合物包含DP为3或3以上的甘露糖寡糖，且其特征在于它是甘露糖二糖的来源，还可包含甘露糖单糖。可以进行HPLC分析(ISO10504：1998-10)以确定存在于甘露糖寡糖组合物中的各种糖如DP1、DP2、DP3及更高糖的量和类型。
在所附权利要求书中限定本发明。本发明的至少一个方面是基于以下发现：包含根据本发明的甘露糖寡糖的组合物(“本发明的组合物”或“本发明的甘露糖寡糖组合物”)与现有的MOS组合物相比在人和动物中具有改善的效果。本发明的MOS组合物的改善效果尤其是对人的身体性能的改善效果，对动物的生长性能的改善效果，并且进一步是对消化健康、细菌/病原体负荷控制、尤其是细菌结合的改善效果；与目前已知的MOS组合物相比，对免疫系统的改善的影响、改善的益生元作用、改善的抗微生物作用、改善的抗细菌作用。
本发明涉及一种包含甘露糖寡糖的组合物，其特征在于该组合物可溶于水。本发明的组合物具有20％或更高、更优选30％或更高、甚至更优选40％或更高、还更优选50％或更高，仍更优选60％或更高的溶解度。因此，本发明的组合物的溶解度可在以下范围内：20至90％、更优选30至85％、还更优选40至80％、仍更优选50至75％、最优选60至75％。溶解度可根据如下所述的测试A来测量。
测试A
-提供待测组合物的10wt％水溶液，将其加热至40℃并在40℃下保持1小时。
-然后将组合物通过0.45μm孔径的过滤器过滤以除去任何不溶的物质，并回收滤液。
-然后对滤液进行HPLC分析(ISO 10504：1198-10)，并记录结果
-溶解度以％表示，并且对应于与初始10wt％水溶液的干物质相比，滤液中的总糖含量。
根据本发明的MOS组合物可以容易地溶解在水中。它在水中形成澄清溶液。
优选地，本发明的MOS组合物的进一步特征在于，其包含小于0.1wt％db、优选小于0.01wt％db、更优选小于0.001wt％db的β-葡聚糖，最优选地，本发明的MOS组合物不包含β-葡聚糖。现有技术的甘露糖寡糖含有大量的β-葡聚糖，通常以1∶1的甘露糖-寡糖∶β-葡聚糖比率。据信这些组合物由于高含量的β-葡聚糖而对免疫系统有影响。令人惊讶地发现，本发明的组合物对免疫系统具有作用，这可能类似于现有技术组合物所获得的效果，尽管本发明的组合物含有极少量至不含上述β-葡聚糖。
此外，MOS组合物的特征在于它不来源于酵母或植物纤维，如来自魔芋或来自咖啡豆。
优选地，本发明的MOS组合物的特征还在于，甘露糖寡糖含量以组合物的干基(db)计为30重量％(wt％)或更高、优选40wt％或更高、更优选50wt％或更高、甚至更优选60wt％或更高、还更优选65wt％或更高、仍更优选70wt％或更高、再更优选80wt％或更高。
本发明的MOS组合物优选是甘露糖二糖(DP2)的来源。因此，优选地，本发明的MOS组合物的DP2含量为10至35wt％db、优选15至30wt％db、优选20至25wt％db。DP2的含量可为约30wt％db。DP2的含量可为约31wt％db。DP2的含量可为约32wt％db。DP2的含量可为约33wt％db。DP2的含量可为约34wt％db。DP2的含量可为约35wt％db。
此外，MOS组合物可包含果糖，其量为至多10wt％db，如0.5至10wt％db、优选至多5wt％db、更优选至多3wt％db、更优选至多1wt％db。
此外，MOS组合物可包含5至50wt％db、优选5至25wt％db的量的甘露糖。
此外，MOS组合物可包含1至15wt％db、优选5至10wt％db的量的葡萄糖。
可使MOS组合物的干物质适应其应用的需要。干物质可为至少70wt％、优选至少75wt％、更优选至少80wt％、甚至更优选至少90wt％、还更优选至少95wt％，如95至99wt％。MOS组合物可根据预期用途以粉末形式或液体形式保存。呈粉末形式时，本发明的MOS组合物是稳定的、微黄色至白色的、自由流动的粉末。
此外，MOS组合物的特征可在于甘露糖寡糖主要包含α-和β-1,6和α-1,3型键。优选至少50％、更优选至少75％、甚至更优选至少80％的键是α-和β-1,6和α-1,3型键。测量糖中可能存在的各种类型的键的方法是本领域中众所周知的，如使用脉冲安培检测的高性能阴离子交换(HPAE-PAD)。
已发现，当给动物喂食所述组合物时，根据本发明的MOS组合物对动物的生长性能具有改善的作用。动物的生长性能应理解为动物的体重增加和饲料摄取量。具体来说，本发明的MOS组合物的特征在于DP2高于25wt％db，例如25至30wt％db对动物生长性能具有进一步改善的作用。更具体来说，本发明的MOS组合物的特征还在于，DP3+含量为40wt％db或更低，例如35至40wt％db对动物的生长性能具有进一步改善的作用。
进一步发现，根据本发明的MOS组合物能够调节免疫系统，即能够调节免疫细胞或巨噬细胞的应答。因此，本发明进一步涉及用于调节免疫细胞或巨噬细胞的应答的根据本发明的MOS组合物。本发明进一步涉及根据本发明的MOS组合物调节免疫细胞或巨噬细胞的应答的用途。
此外，已发现，根据本发明的MOS组合物增加上皮细胞的增殖。MOS组合物适用于通过刺激肠上皮细胞的增殖来修复动物粘膜如肠粘膜的损伤。因此，本发明进一步涉及用于增加上皮细胞增殖的根据本发明的MOS组合物。本发明进一步涉及根据本发明的MOS组合物用于增加上皮细胞的增殖的用途。
进一步发现，根据本发明的MOS组合物适用于减少人或动物中或上的病原体负荷，特别是细菌或微生物负荷，和/或感染。因此，本发明进一步涉及根据本发明的MOS组合物，其用于减少人或动物中或上，特别是动物或人的胃肠道中的病原体负荷，特别是细菌或微生物负荷，和/或感染。本发明进一步涉及根据本发明的MOS组合物用于减少人或动物中或上的病原体负荷，特别是细菌或微生物负荷，和/或感染的用途。
本发明进一步涉及根据本发明的MOS组合物，其用于在人或动物中或对人或动物的抗微生物处理。本发明还涉及根据本发明的MOS组合物在人或动物中或对人或动物的抗微生物处理(治疗性或非治疗性)的用途。这样的处理可例如以化妆品或个人护理产品的形式，如皮肤护理产品或药物产品。
具体来说，一种MOS组合物，其特征在于DP2为15至25wt％db，如约22wt％db，而DP3+为45至60wt％db，如约50wt％db，且还具体来说，一种MOS组合物，其特征在于DP2含量为10至20wt％db，而DP3+含量为55至75wt％db，如高于60wt％db，如60至70wt％db，优选65至70wt％db，所述MOS组合物适用于减少动物的大肠杆菌感染和/或沙门氏菌感染。
本发明进一步涉及如本文所述的MOS组合物用于处理人或动物的用途。本发明进一步涉及用于处理人或动物的本文所述的MOS组合物。因此，如本文所述的MOS组合物也可用于/用作处理人或动物的药剂。
本发明进一步涉及如本文所述的MOS组合物用于改善动物的生长性能的用途，包括其用于改善动物的生长性能的非治疗性用途。如本文所述的MOS组合物还可用于/用作用于改善动物的生长性能的药剂。MOS组合物可用作饲料添加剂。
本发明进一步涉及本发明的MOS组合物在人和动物中或上减少微生物或细菌污染或减少感染、优选用于减少沙门氏菌和/或大肠杆菌污染的用途。因此，本发明还涵盖本文所述的MOS组合物，其用于在人或动物中或上减少微生物或细菌污染或用于减少感染、优选用于减少沙门氏菌和/或大肠杆菌污染。特别地，具有约22％的DP 2和50％的DP3+(±1％)的MOS组合物是有用的；而DP3+高于60％的MOS组合物也是有用的。
本发明进一步涉及如本文所述的MOS组合物，其用于在人或动物中改善体重增加和/或改善饲料摄取量和/或改善体重和/或改善粪便质量。这包括其在人或动物中改善体重增加和/或改善饲料摄取量和/或改善体重和/或改善粪便质量方面的治疗性和非治疗性用途。
本发明进一步涉及如本文所述的MOS组合物，其用于减少或防止细菌附着于肠粘膜。这包括如本文所述的用于减少或防止细菌附着于肠粘膜的MOS组合物。
优选地，动物是家禽(如鸡、火鸡和鹌鹑)、猪、反刍动物、马、水生动物(如鱼，例如鲑鱼或鳟鱼，和虾)或宠物。更优选地，动物是家禽或猪。如以下实例部分中所举例说明，在体内试验中已显示，摄入根据本发明的MOS组合物有益于动物的肠胃健康并提高动物的生长性能。
本发明进一步涉及一种食品、动物饲料或宠物食品产品，其包含本发明的MOS组合物及其他食品、动物饲料或宠物食品成分。
使用本发明的MOS组合物的一个优点在于，其易于溶解，可以被更好地处置和/或配给，因此非常适合用于使用至少一种液体成分的许多应用中，所述液体成分例如像液体食品，如饮料；或液体饲料，如动物饮用水。同样在干燥混合物中，可以容易地掺入MOS组合物。
食品产品可以是焙烤产品，如饼干、曲奇、谷物棒、早餐谷物、薄脆饼、蛋糕、面包、松饼、酥皮糕点、油炸烘焙食品等。
食品产品可以是方便产品，如调味汁、布丁、汤。
食品产品可以是糖果产品，如巧克力、巧克力样产品、软糖果、硬糖果、硬煮糖果、压制糖果、口香糖、咀嚼口香糖、果冻、棉花糖、锭剂、片剂、焦糖、牛轧糖、果仁糖、太妃糖、软糖、翻糖、杏仁蛋白软糖等。
食品产品可以是饮料。饮料包括任何糖浆或任何含酒精和非酒精的、碳酸的和非碳酸的或可饮用的溶液，包括水、啤酒、柠檬水、甜果汁饮料、冰茶、果汁、蔬菜基饮料，如谷物基饮料、杏仁基饮料或其他坚果基饮料、大豆基饮料、大米基饮料等。其还包括饮料浓缩物和饮料粉。饮料浓缩物是指呈液体形式或基本上干燥的混合物形式的浓缩物。饮料浓缩物通常被配制为当用水(碳酸的或非碳酸的)构成或稀释时提供可饮用的饮料组合物或最终饮料。饮料粉适合与碳酸或非碳酸水或乳构成最终饮料。
食品产品可以是乳制品，如乳、乳清、酸奶及以它们为基础的饮品；乳基可可饮品、发酵甜点(如新鲜的奶酪制剂、可饮用产品)、冰淇淋、奶昔、冷冻酸奶、中性乳制品甜点(如布丁、果馅饼、奶油甜点、搅打的甜点)和调味酸奶制剂(例如不含水果的水果酸奶)、冷冻乳制品甜点等。
食品产品也可以是婴儿食品、婴幼儿食品和食品补充剂。
食品产品也可以是专门为老年人的需求而设计的食品。
动物饲料产品可以是被设计用于喂养猪(优选仔猪)或鸡的饲料产品，如用于肉鸡的饲料或用于蛋鸡的饲料，或鱼饲料，如鲑鱼或鳟鱼。动物饲料也可以是马饲料。所述猪饲料、鸡饲料、鱼饲料或马饲料除了本发明的MOS组合物外还包含通常或专门用于这种动物饲料的饲料成分。制备动物饲料的本领域技术人员知道动物饲料的典型和特定组成。MOS组合物也非常适合用作饲料补充剂。由于它是可溶的，因此可以容易地将其添加到例如饮用水中。饲料产品的其他饲料成分可以是其他碳水化合物和纤维，如葡聚糖、***木聚糖寡糖、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等。取决于动物种类，饲料的组成会有所不同；本领域技术人员了解如何配制合适的饲料组合物。
优选地，MOS组合物以一份或多份每天每千克人、动物或宠物体重提供0.01至20g、优选0.01至10g MOS组合物的量存在于食品、动物饲料或宠物食品产品中。优选地，特别是对于动物或宠物，MOS组合物以一份或多份每天每千克动物或宠物体重提供0.01至0.02gMOS组合物的量存在于动物饲料或宠物食品产品中。特别地，基于食品、动物饲料或宠物食品产品的重量，食品、动物饲料或宠物食品可包含0.02至0.6wt％本发明的MOS组合物。
一方面，基于食品、动物饲料或宠物食品产品的重量，食品、动物饲料或宠物食品(优选猪饲料)包含0.1至0.5wt％、优选0.1至0.4wt％、甚至更优选0.1至0.3wt％、再甚至更优选0.1至0.2wt％本发明的MOS组合物。
另一方面，基于食品、动物饲料或宠物食品产品的重量，食品、动物饲料或宠物食品(优选家禽饲料)包含0.01至0.05wt％、优选0.01至0.04wt％、甚至更优选0.01至0.03wt％、再甚至更优选0.01至0.02wt％本发明的MOS组合物。
此外，本发明涉及一种化妆品，其包含本发明的MOS组合物和其他化妆品成分，特别是在具有抗微生物性质的产品中。化妆品可以是化妆霜、化妆水、唇膏等。优选地，基于化妆品的重量，化妆品可包含0.01至30wt％、优选0.01至20wt％、更优选1至15wt％、甚至更优选5至10wt％本发明的MOS组合物。本发明还涉及MOS组合物在化妆品中的用途。特别地，本发明还涉及MOS组合物在具有抗微生物性质的化妆品中的用途。
本发明还涉及一种个人护理产品，其包含本发明的MOS组合物和其他个人护理产品成分，尤其是在具有抗微生物性质的产品中。个人护理产品可以是身体乳液、口腔护理产品(漱口水、牙膏等)、护发产品、卫生产品如手凝胶、湿毛巾或湿巾(婴儿湿巾、私处湿巾、清洁卸妆湿巾)等等。个人护理产品中还包括皮肤护理产品，如清洁乳液和溶液、面霜和护手霜、身体乳液、保湿剂、痤疮处理产品、体香剂等。优选地，基于个人护理产品的重量，个人护理产品可包含0.01至30wt％、优选0.01至20wt％、更优选1至15wt％、甚至更优选5至10wt％本发明的MOS组合物。本发明还涉及根据本发明的MOS组合物在个人护理产品中的用途。具体来说，根据本发明的MOS组合物适用于具有抗微生物性质的个人护理产品。
本发明还涉及一种药物产品，其包含本发明的MOS组合物和其他药物成分。个人护理产品可以是护手霜。药物产品包括消毒剂、防腐香膏等。
优选地，基于药物产品的重量，药物产品可包含0.01wt％至20wt％本发明的MOS组合物。
本发明进一步涉及一种用于制备甘露寡糖组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在酸化催化剂的存在下，通过使甘露糖在180℃至240℃、优选195℃至240℃的温度下通过微反应器来缩聚甘露糖，以产生含甘露寡糖的组合物，
b)任选地使所述甘露寡糖组合物中和和/或脱色，
c)任选地精制所述甘露寡糖组合物，
d)收集所述甘露寡糖组合物。
甘露糖可以是含甘露糖的组合物、分离的甘露糖、甘露糖溶液或这些的混合物。优选地，甘露糖是甘露糖水溶液。甘露糖水溶液中甘露糖的浓度并不重要，但是，使甘露糖水溶液尽可能地浓缩以符合粘度要求是有利的。因此，有利的是甘露糖水溶液包含10至90wt％干物质、优选15至80wt％干物质、更优选40至70wt％干物质、甚至更优选50至60wt％干物质。最优选地，甘露糖水溶液包含75至90wt％的干物质。
酸化催化剂的用量与甘露糖的重量比优选如下：甘露糖:酸化催化剂为100∶0.005至100∶20、更优选100∶0.5至100∶10、甚至更优选100∶1至100∶5。
优选地，酸化催化剂是柠檬酸、硫酸和/或磷酸。
优选地，酸化催化剂在其通过微反应器之前与甘露糖混合。
优选地，步骤a)的温度为180℃至230℃、更优选195℃至230℃、更优选195℃至220℃、甚至更优选195℃至210℃、且仍甚至更优选195℃至200℃。
在步骤a)期间，含甘露糖的组合物在微反应器中的停留时间优选为5至20秒、更优选10至15秒。
优选地，在步骤a)之前，使甘露糖在酸化催化剂存在下在比上述步骤a)的温度更低的温度下通过第一微反应器。所述较低温度优选为100℃至180℃、更优选120℃至175℃、甚至更优选140℃至170℃、甚至更优选150℃至165℃。在此步骤期间可能已经发生了一些缩聚反应。优选地，含甘露糖的组合物在第一微反应器中的停留时间相当短，如5秒或更短、优选4秒或更短、更优选3秒或更短、甚至更优选2秒或更短，如0.5至2秒或0.5至1秒。
当例如分批进行该方法时，第一微反应器和步骤a)的微反应器可具有相同配置，它们可以相似，且甚至可以是相同的微反应器。本发明的方法可以分批、半连续、脉冲或连续的方式进行，优选以连续方式进行。
因此，优选地，本发明涉及一种方法，其包括
a0)在酸化催化剂的存在下，使甘露糖在100℃至180℃的温度下通过微反应器，以获得加热的甘露糖，
a)在酸化催化剂的存在下，在180℃至240℃、优选195℃至240℃的温度下通过微反应器将加热的甘露糖缩聚，
b)任选地使所述甘露寡糖组合物中和和/或脱色，
c)任选地精制所述甘露寡糖组合物，
d)收集所述甘露寡糖组合物，
其中所述酸化催化剂优选为柠檬酸/硫酸和/或磷酸。
如果需要，则在收集甘露寡糖组合物之前或在步骤c)和/或d)之后，可以进行冷却步骤以降低甘露寡糖组合物的温度。
优选地，甘露寡糖组合物被中和。可以进行甘露寡糖组合物的中和直至组合物的pH达到4至7。这对于增加产物的稳定性是有利的，例如，随着时间的推移，水解变少，且因此产物的组成较少变化至无变化。另一个优点是该产物随后适合与对酸或酸性条件敏感的其他成分一起使用。中和可用任何合适的碱进行。优选地，特别是当甘露寡糖组合物用于食品以及可能还用于饲料和宠物食品时，该碱是苛性碱和/或氢氧化钾。
应当注意，可能中和甘露寡糖组合物或使甘露寡糖组合物脱色或同时进行这两种处理。
优选地，甘露寡糖组合物被精制。精制所产生的甘露寡糖组合物可通过使其经过一系列阴离子和阳离子树脂和/或抛光剂如活性炭和/或通过色谱法来完成。特别地，可进行精制以从组合物中除去部分或全部甘露糖。当甘露寡糖组合物有待用于食品应用中时是特别有利的。
本发明进一步涉及一种通过本发明的方法可获得的MOS组合物。实际上，这种MOS组合物尤其具有如本文所述的改善效果。
将通过以下非限制性实例说明本发明。
实施例
实施例1：MOS组合物的产生
以干基为100:3的重量比，将以干基含有90wt％+/-2％甘露糖的甘露糖溶液(Cargill的C*TruSweet 016Ko)与固体柠檬酸掺合。将所得溶液经由薄膜蒸发器蒸发至干物质为85％+/-1％。然后将溶液通过以15kg/hr的恒定流速泵送通过微型热交换器(Kreuzxtrom-reaktormodul 1694-X-19.0，KIT，IMVT)来加热至165℃，总停留时间短于2秒。随后将材料泵送通过第二微型热交换器(Kreuzxtrom-reaktormodul 2155-A-4.0，KIT，IWVT)，在195℃的温度下进行11秒，在此发生主要的缩聚反应。
将所得缩聚产物(甘露糖寡糖组合物)用碱水稀释，得到固体含量为50wt％且pH为5+/-0.2的溶液。然后将溶液冷却至50℃。HPLC分析(ISO 10504：1998-10)显示甘露寡糖，即DP3+，含量为40wt％。
实施例2：MOS组合物的产生
以干基为100:3的重量比，将以干基含有90wt％+/-2％甘露糖的甘露糖溶液(Cargill的C*TruSweet 016Ko)与固体柠檬酸掺合。将所得溶液经由薄膜蒸发器蒸发至干物质为85％+/-1％。然后将溶液通过以15kg/hr的恒定流速泵送通过微型热交换器(Kreuzxtrom-reaktormodul 1694-X-19.0，KIT，IMVT)来加热至170℃，总停留时间短于2秒。随后将材料泵送通过第二微型热交换器(Kreuzxtrom-reaktormodul 2155-A-4.0，KIT，IWVT)，在200℃的温度下进行11秒，在此发生主要的缩聚反应。
将所得缩聚产物(甘露糖寡糖组合物)用碱水稀释，得到固体含量为50wt％且pH为5+/-0.2的溶液。然后将溶液冷却至50℃。HPLC分析(ISO 10504：1998-10)显示甘露寡糖，即DP3+，含量为50wt％。
实施例3：比较例
将根据本发明的MOS(分别根据实施例1和2制备的组合物A和组合物B)与可商购获得的来源于酵母的MOS组合物(样品C至I)进行比较。
根据如上所述的测试A确定溶解度。
结果表明，所有商业酵母来源的样品的溶解度均低于4wt％，这远低于本发明产品的溶解度。
表1.通过HPLC所确定的甘露寡糖(MOS)样品的糖谱和溶解度。
对酸和饲料酶的稳定性
将从酵母提取的可商购获得的MOS样品
施例1制备的根据本发明的MOS组合物样品在41℃(鸡的内部生理温度)下在刺激胃酸(最初30分钟为pH 2，然后为pH 7)的条件下或在有和没有商业上用于饲料的两种木聚糖酶的情况下的中性pH 7下温育2小时。将缓冲液中酶的剂量根据供应商对饲料的建议进行调整，并且先前已证明可在相同条件下在体外在木聚糖样品中发挥作用。图1的结果表明，与胃酸条件无关，饲料酶不会降解根据本发明的MOS组合物。由于
实施例4：体外和离体试验
将根据本发明的甘露寡糖(MOS)的作用与可商购获得的来源于酵母的MOS的作用在体外进行比较。
最小抑菌浓度(MIC)
在第一测定中，评价了不同浓度的MOS对病原菌，即大肠杆菌和沙门氏菌生长的影响，以确定每种材料的最小抑菌浓度(MIC)。将材料以不同稀释度添加到96孔板上的孔中，并在该板上掺入10xCFU的相关致病菌(大肠杆菌或沙门氏菌)。将板温育48小时，并通过对每个孔进行板计数来确定菌落形成单位(CFU)，并计算为纯培养基的％。将MIC测定的结果报告于表2和表3中。
表2.对于不同的MOS组合物，体外测定的大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度 (MIC)。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
CELMANAXTM和
表3.对于根据本发明的两种MOS组合物的两个批次，体外测定的大肠杆菌和沙门 氏菌的最小抑菌浓度(MIC)。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物，生产了两个批次，批次1和2
组合物B：根据实施例2的MOS组合物，生产了两个批次，批次1和2
这些结果显示，当以高于1％的浓度添加到溶液中时，MOS组合物A和B的MIC开始将细菌生长抑制了20％。仅在浓度高于10％时才能达到50％以上的抑菌效果(表2和3)。基于这些发现，可以得出结论，本发明的MOS组合物直接杀死大肠杆菌和沙门氏菌的能力有限，因此它们没有杀菌作用。来源于酵母的MOS样品CELMANAXTM和
生物膜形成的抑制
在体外测试根据本发明的MOS组合物和一些可商购获得的来源于酵母的MOS对在非生物表面上形成细菌生物膜的影响。将化合物以不同的稀释度(10％、1％、0.1％和0.01％)添加到96孔板上的孔中，向该板中掺入10x CFU的相关致病菌(大肠杆菌或沙门氏菌)。将板在37℃下温育48小时。除去每个孔上的液体，并用PBS缓冲液洗涤该孔，然后将附着在塑料表面上的生物膜细胞用结晶紫染色，并使用乙醇洗脱。染料的色强度在分光光度计上以490波长以吸光度(OD)进行测量。值被计算为空白对照(缓冲溶液、富集培养基和接种细菌)的％。这些测量的结果可见于表4中。
表4.MOS组合物对在体外于非生物表面上形成生物膜的相对抑制百分比(与对照 相比)的剂量效应
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
CELMANAX TM和
结果显示，本发明的MOS组合物可以剂量依赖性方式抑制生物膜的形成，从在浓度低至0.01％下抑制超过40％开始，且在溶液中浓度为10％时，对大肠杆菌的抑制达到79％，并且对沙门氏菌的抑制达到92％。来源于酵母的MOS在10％的浓度下仅表现出约70％的抑制作用，且在沙门氏菌的情况下，它们在较低的浓度下甚至表现出很高的生物膜形成刺激作用(表4)。
病原体粘附于肠道表面上的离体抑制
将两种不同的测定用于评估根据本发明的MOS组合物和可商购获得的来源于酵母的MOS(CELMANAXTM和
表5.不同MOS来源对沙门氏菌与鸡盲肠组织的相对粘附的离体影响。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
CELMANAX TM和
表6.MOS对沙门氏菌与离体肉鸡或蛋鸡盲肠组织的相对粘附的影响
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
CELMANAX TM：可商购获得的来源于酵母的MOS
表7.本发明的MOS组合物对沙门氏菌与盲肠离体肉鸡或蛋鸡组织的相对粘附的影 响的证实
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
表8.本发明的MOS组合物的剂量对沙门氏菌与离体盲肠鸡组织的相对粘附的影响
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
表5中所示的结果显示，所有含MOS的材料都能够减少沙门氏菌与肠上皮表面的粘附。一些MOS来源比其他来源更有效率。尽管在雏鸡(肉鸡)和成年鸡(蛋鸡)中都证实了MOS减少病原体与肠道上皮细胞的粘附的能力，但这种效果在雏肉鸡中更为明显(表6)。对于本发明提出的MOS组合物，根据以下测试中进一步证实了这些结果(表7)。如表8所示，这种粘附作用的降低是剂量依赖性的。基于此，建议体内试验的最小剂量为0.02％。
实施例5：体内试验免疫调节
使用体外巨噬细胞培养进行体外测定。巨噬细胞暴露于根据本发明的两种MOS组合物(组合物A和B)。在添加1ug/ml LPS(或培养基假对照)之前，将细胞与原型一起温育1小时，温育18小时后使用ELISA测试试剂盒测量细胞因子。重复ELISA两次。表9和表10分别示出了添加LSP之前和之后的实验结果。
表9.暴露于不同MOS的巨噬细胞的体外免疫应答
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
表10.LPS激发的暴露于不同MOS的巨噬细胞的体外免疫应答
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
当暴露于MOS组合物A或B时，巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-8和IL-10增加，而与对照培养基相比，这两种MOS组合物均减少了IL-6的产生(表9)。当巨噬细胞受到LPS激发时，所有细胞因子都会因MOS的存在而增加(表10)。这些结果表明，根据本发明的MOS组合物确实对体外免疫系统具有直接作用。
在跟进测试中，在饮食中以剂量增加(0至0.4％)的MOS组合物B喂养仔猪。每次处理从8头猪中收集肝素化的血液，在断奶后第22天共有80头猪。使用Ficoll梯度分离外周血单核细胞。将细胞铺板并用LPS刺激，并通过ELISA针对TNFα(pg/ml)对免疫应答进行测量。这些结果示于表11中。
表11.有和无LPS刺激时，增加的剂量的MOS组合物B对离体猪巨噬细胞TNFα(pg/ ml)应答的影响。
(n＝8)，组合物B：根据实施例2的MOS组合物
在没有LPS激发下，饲喂MOS组合物B对仔猪小噬细胞应答的影响很小，但是在LPS激发下显示出线性增加。这意味着MOS组合物B通过调节TNF-α应答，增强了在疾病激发下的仔猪的免疫应答。
实施例6：体内GI健康的改善
使用模拟腔肠上皮细胞表面的体外C2Be1细胞系培养模型研究了根据本发明的MOS组合物(组合物A和B)对肠粘膜细胞的直接影响。使在板上生长的细胞形成粘膜样表面，然后与以0.2％浓度溶解在培养基中的化合物一起温育。将细胞在血清有限的条件下用产品处理4-5天。
将BrdU ELISA用于测量增殖量，此方法可测量并入到增殖细胞中的BrdU量(增殖越多，在细胞DNA中检测到的BrdU越多)。将增殖水平表示为通过将测试孔的BrdU并入量除以仅具有培养基的对照的BrdU并入量所计算的比率。等于1的值将仅等于中值的平均值，表示无响应。在两个单独的情形下，一式三份地重复测定。已知会影响细胞增殖的化合物被称为上皮生长因子(EGF)，其以两种不同浓度(10和100)的阳性对照使用。结果可见于表12中。
表12.MOS A和B及两种浓度的上皮生长因子(EGF)对肠细胞增殖的体外影响。
(n＝12)
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
通过比较来源于酵母的MOS与MOS组合物A和B对肠道微生物谱的影响来评估肠道健康。使用定制的微阵列分析来自从第1天开始饲喂MOS的17天龄的肉鸡盲肠的样品，该微阵列上印有16S DNA探针，用于100种选定的肠道微生物。以饮食的0.2％(
根据图2中的结果，可见所有MOS产品都能在群集1中造成所需细菌减少，群集1包含病原菌，如大肠杆菌、弯曲杆菌和沙门氏菌。虽然每种MOS产品都可以通过同时增加来自不同群集(
实施例7：体内生长性能的提高
鸡
设计第一项研究(试验1)，以将根据本发明的实施例1和实施例2的MOS组合物与可商购获得的来源于酵母的MOS进行比较。还添加了通过与实施例1中描述的方法类似的方法产生的聚葡萄糖(其中葡萄糖和山梨糖醇用作反应物)，以显示这些组合物作为聚甘露糖的重要性。将实施例1和2的MOS组合物以两种极端剂量(0.02和2％)添加到用肠炎沙门氏菌激发的肉鸡的饮食中，而将来源于酵母的MOS(CELMANAXTM和
1n：每次处理的重复次数。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
CELMANAX TM和BioMOS：可商购获得的来源于酵母的MOS
死亡率：相对于第0天的禽类数量的总死亡百分比和淘汰百分比。
EPI：欧洲家禽指数((最终体重(g)x(100％死亡率))/(((10x天数)x总F:G))；
不包括死亡率的EPI：((最终体重(g)x 100％))/((10x天数)x总F:G))；
BW：体重(g)；ADG＝平均每日增重(g)；
ADFI：平均每日饲料摄取量(g)；
F:G：饲料增重比(g饲料摄取量：g体重增加)；
G:F：增重饲料比(g体重增加：g饲料摄取量)。
(a，b，c，d，e，f，g)在没有共同下标的行中的平均值有显著差异(p<0)。
与对照相比，组合物A在0.02％下可使肉鸡在20日龄时达到最佳性能，从而产生更好的EPI(排除死亡率)、体重、体重增加和饲料摄取量。与其他处理相比，组合物A在数量上优于所有，并且在统计学上优于饲喂组合物A2.00％、组合物B(任何剂量)、聚葡萄糖(任何剂量，排除死亡率的EPI除外)的禽类。与来源于酵母的MOS相比，仅CELMANAXTM具有与组合物A相似的体重、体重增加或饲料摄取量。由于饲料利用率的差异与饲料摄取量的差异相关，可以得出结论，这些性能差异实际上是由饲料摄取量驱动的。MOS组合物A和B以及CELMANAXTM与对照禽类相比不会影响盲肠中的沙门氏菌计数，而酵母衍生的会增加沙门氏菌的存在(表13)。这些结果与MOS产品不具有杀菌作用的体外观察结果一致，但是一些来源于酵母的MOS可刺激病原菌的生长(表2)。
根据试验1的结果，设计了剂量-反应研究(试验2)，以鉴别有待添加到肉鸡饮食中的MOS组合物A的最佳剂量。测试的剂量范围为0.01至1.00％。表14上所示的结果显示，对于体重、日增重、饲料摄取量和饲料增重比，MOS组合物A的影响本质上是二次方的，其中最佳剂量为0.02％。这些结果证实了在喂食更纯的MOS来源时剂量的重要性，并且所鉴别的剂量也与体外结果(表8)和试验1的结果(表13)一致。
表14.饮食中剂量增加的甘露寡糖(MOS)组合物A对达到20日龄的肉鸡的性能的影 响。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
EPI＝欧洲家禽指数((最终体重(g)x(100％死亡率)/((10x天数)x总F:G))；BW＝体重(g)；ADG＝每日平均增重(g)；ADFI＝每日平均摄食量(g)；F:G＝饲料增重比(g摄食量：g体重增加)。
(*，**，***)分别以p<0.05、0.01或0.001对比明显。
将另外两次动物饲喂测试用于证实家禽饮食中0.02％组合物A的推荐剂量。第三项研究(试验3)测试了饲喂有或没有抗生素生长促进剂金霉素(CTC)的饮食中组合物A的情况。第四项研究(试验4)测试了在18至30周龄的蛋鸡生蛋期间给蛋鸡饲喂相同产品和剂量的情况。这些研究的结果可分别见于表15和16中。
表15.饲喂含抗生素生长促进剂金霉素(CTC)、MOS组合物A或其组合达达35日龄的 肉鸡的性能。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
CTC＝金霉素；BW＝体重(g)；ADG＝平均每日增重(g)；ADFI＝平均每日饲料摄取量(g)；F:G＝饲料增重比(g饲料摄取量：g体重增加)。
(a，b，c)在没有共同下标的行中的平均值有显著差异(p<0.05)
(n＝每次处理有9次重复，每次重复有50只禽类)
表16.饲喂MOS组合物A或B的蛋鸡的性能。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
ADFI＝平均每日饲料摄取量(g)；wt＝重量(g)。
(a，b)根据指定的p值，在没有共同下标的行中的平均值有显著差异。
(n＝每次处理有7次重复，每次重复有10只禽类)
试验3的结果(表15)显示，与没有添加剂的对照处理相比，抗生素生长促进剂CTC和本发明中提出的MOS组合物A(剂量0.02％)都产生肉鸡总体上更好的性能。甚至，抗生素生长促进剂CTC与MOS组合物A的组合与它们的个别效果相比，还在性能上产生了共生的进一步改善(表15)。基于这些结果，可以得出结论，本发明提出的MOS组合物A对在具有或不具有抗生素生长促进剂的饮食中的肉鸡性能带来有益的影响。
试验4的结果(表16)表明，在蛋鸡饮食中饲喂的MOS组合物A或B对平均每日饲料摄取量或大多数蛋特征(蛋重量、蛋白重量、蛋黄重量、蛋壳厚度或死亡率)没有影响。尽管在此研究期间(18-10周龄)蛋壳厚度对蛋鸡的蛋质量没有风险，但MOS组合物A显著减小了蛋壳厚度。当将本发明中所述的MOS饲喂给蛋鸡时观察到的主要效果是产蛋数量的增加和饲料向蛋的转化的改善(表16)。对于MOS组合物A而言，此效果比组合物B更为明显。
猪
进行了仔猪研究(试验5)，以比较饲喂本发明的甘露寡糖(组合物A和B)与可商购获得的来源于酵母的产品
表17.饲喂来源于酵母的甘露寡糖(MOS)或不同剂量的MOS组合物A和B对断奶后达 42天的仔猪的性能的影响。
组合物A：根据实施例1的MOS组合物
组合物B：根据实施例2的MOS组合物
BioMOS：可商购获得的来源于酵母的MOS
试验5的结果显示，来源于酵母的MOS
