白鲜碱的新应用
阅读说明：本技术 白鲜碱的新应用 (New application of dictamnine ) 是由 安输 虞姣姣 徐天瑞 郝佩琪 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开白鲜碱的新应用,白鲜碱能够与c-Met相互结合,可以在制备c-Met的抑制剂中进行应用；本发明通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用,并通过CETSA技术证实白鲜碱能够与c-Met相互结合,且白鲜碱的浓度越高,其结合能力越强,最佳的结合时间为2-3小时,进一步通过Western Blot技术证实白鲜碱具有抑制c-Met表达的作用,即发挥了促进其降解的功能；为c-Met抑制剂的开发提供了一种新的高效、价廉的化合物。(The invention discloses a new application of dictamnine, wherein the dictamnine can be mutually combined with c-Met and can be applied to the preparation of an inhibitor of the c-Met; the method calculates that an oxygen atom on a furan ring of dictamnine and MET1160 can form an H-hydrogen bond interaction through a molecular docking method, and proves that the dictamnine can be combined with c-Met through a CETSA (CeTSA-type ionic liquid transfer reaction) technology, the combination capacity of the dictamnine is stronger when the concentration of the dictamnine is higher, the optimal combination time is 2-3 hours, and further proves that the dictamnine has the effect of inhibiting the expression of the c-Met through a Western Blot technology, namely, the function of promoting the degradation of the dictamnine is exerted; provides a new compound with high efficiency and low cost for the development of c-Met inhibitors.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及白鲜碱在制备c-Met抑制剂中的应用。
背景技术
c-Met 是异二聚体受体酪氨酸激酶( RTKs) 亚族的原型成员，并且是肝细胞生长因子( HGF) 的受体，RTK 失调，异常激活，遗传改变和突变与包括癌症在内的许多疾病的发生以及对抗癌治疗的抗性有关。c-Met 与多种癌基因产物和调节蛋白相关，具有很强的促细胞增殖的作用。它参与多种体内过程，在细胞的增殖、代谢以及肿瘤的产生、转移、血管生成中扮演着重要的角色，这使c-Met成为抗肿瘤治疗的重要靶点，并对癌症药物的开发注入新的希望。
白鲜碱( dictamnine) 是白鲜皮的主要成分之一，又称白鲜胺或白藓碱，属呋喃喹啉类生物碱，在白鲜皮中含量约0.1%。白鲜碱能抑制血小板聚集、松弛血管并降低血压等，具有抗菌、抗病毒和治疗皮肤湿疹和皮肤瘙痒的作用。目前白鲜碱提取工艺较为成熟，市售的白鲜碱一般都较为价廉且质高。
发明内容
本发明旨在提供一种白鲜碱的新应用，揭示白鲜碱能够与c-Met相互结合，白鲜碱在制备c-Met抑制剂中的应用。
本发明所述白鲜碱还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善抑制剂吸收效果或便于服用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等。
本发明所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明所述白鲜碱为常规市售白鲜碱或者常规工艺提取的白鲜碱。
本发明通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用，并通过CETSA技术证实白鲜碱能够与受体酪氨酸激酶c-Met相互结合，且白鲜碱的浓度越高，其结合能力越强，而最佳的结合时间为2-3小时，而Western Blot技术则证实白鲜碱具有抑制c-Met表达的作用，即发挥了促进其降解的功能，白鲜碱抑制c-Met的表达，可以阻断肺癌发生发展中与c-Met受体相关的通路，并抑制下游网络信号，从而实现对癌症的控制。
本发明为c-Met抑制剂的开发提供了一种新的高效、价廉的化合物白鲜碱。
附图说明
图1为实施例1为白鲜碱与c-Met的分子对接图；
图2为实施例2为白鲜碱处理细胞裂解液的CETSA结果图；
图3为实施例3 为白鲜碱处理活细胞的CETSA结果图；
图4为实施例4 为不同浓度的白鲜碱处理活细胞的CETSA结果图；
图5为实施列5为白鲜碱处理活细胞不同时间的CETSA结果图；
图6为实施列6 为白鲜碱处理细胞后c-Met磷酸化水平及表达量改变的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，实施例中涉及到%，均为体积百分数；实施例中用到的磷酸缓冲盐溶液是按照常规方法配制的1×磷酸缓冲盐溶液；蛋白酶抑制剂 (通用型，100X，即Protease inhibitor cocktail for general use，100X) 是一种通用型用于细胞或组织蛋白提取等的蛋白酶抑制剂混合物 (200mM AEBSF，30μM Aprotinin，13mM Bestatin，1.4mM E64 and 1mM Leupeptin in DMSO)，含蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲盐溶液是将蛋白酶抑制剂按照体积比1:100加入到磷酸缓冲盐溶液中得到；实施例中所使用的其他试剂均为市场上购得的常规试剂，使用代码均为本领域技术人员公知，如Western Blot、SDS-PAGE、TBST等。
实施例1
配体与受体相互作用是分子识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等，分子对接（molecular docking）是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”（lock&key principle），模拟配体小分子与受体生物大分子相互作用的一种技术方法，通过计算，可以预测配体与受体之间的结合模式。
通过分子对接的方法计算出白鲜碱呋喃环上的氧原子与MET1160能够形成一个H氢键相互作用，具体步骤如下：
（1）蛋白数据来源：
A. 设置关键词“c-Met”在PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）检索构象；
B. 根据以下条件进行筛选：
①通过X晶体衍射法获取的蛋白结构；
②蛋白的晶体解析度小于3Å；
③分型明确的蛋白；
④优先选择已有分子对接的文献报道的蛋白结构；
C. 最终选定PDB编号为：4IWD；
（2）分子对接：
A. 先使用AutoTools对蛋白进行加氢去除水分子处理；
B. 使用AutoGrid进行能量格点计算，设置Grid Box坐标（-8.833，12.926，-16.482），盒子大小为20×20×20个网格点，每个小网格点的距离为0.1nm；
C. 使用Autodock Vina进行小分子与蛋白对接，取打分最高的构型进行分析作图。
如图1所示，为打分最高的构型图，从图中可知，小分子（白鲜碱）进入了蛋白（c-Met）的活性口袋，其中呋喃环上的氧原子与MET1160形成一个H氢键相互作用，此外小分子芳香环上的H分别与PRO1158、MET1160、ILE1084三个氨基酸形成三个弱的Aromatic-H（相比前面那个氢键稍微弱一点的芳香氢键）相互作用，这几个相互作用是促进小分子结合到活性位点的主要作用。
实施例2
本实施例利用细胞热转变分析（CETSA）技术检测白鲜碱与细胞裂解液中c-Met的结合能力，细胞热转变分析（CETSA）技术可以直接在细胞或组织内检测药物和标靶蛋白的结合亲和力，具体步骤如下：
（1）A549肺腺癌细胞的培养及传代：
A、A549细胞的培养：A549培养于1640培养基，培养基中含10%胎牛血清，1%青链霉素，培养于37℃、5% CO2 环境中；
B、A549细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80%时，需进行传代，弃去全部培养基，用预热至37℃的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后，加入新鲜1640细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5% CO2环境中继续培养；
（2）白鲜碱与细胞裂解液中c-Met结合的验证：
A、细胞铺板：步骤（1）A549细胞培养至对数生长期，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后离心，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，铺于1个T25细胞培养瓶用于CETSA实验，37℃、5%CO2培养24小时，24小时后，用胰蛋白酶将细胞消化下来并离心，用600µL 含蛋白酶抑制剂的磷酸缓冲盐溶液重悬细胞沉淀，将细胞重悬液分至两个1.5EP管中，每管300µL；
B、反复冻融法裂解细胞：将两管细胞悬液置于-152℃超低温冰箱，30分钟后，取出放于37℃水浴锅中，待悬液全部融化后涡旋振荡数秒，再次放入超低温冰箱（-152℃），如此循环3次，使细胞彻底裂解，裂解完成后进行高速离心以除去细胞碎片：20000×g，20分钟，4℃；
C、药物处理：离心后将上清液转移至新的1.5EP管中，药物组加入浓度为10mM的白鲜碱-DMSO-培养基溶液，使1.5EP管中白鲜碱终浓度为100µM，对照组加入同含量的DMSO，在室温条件下，孵育细胞裂解液20分钟；
D、样品加热：将步骤B孵育完成的2管样品以60µL的量均匀分至4个PCR小管中，设置好PCR仪的加热温度，分别为46℃，50℃，56℃，62℃，将PCR小管放入对应的温度，加热3分钟，加热后，放在室温冷却，并进行高速离心：20000×g，20分钟，4℃；
E、样品配制：从离心机中取出PCR小管，分别吸取56µL的上清液于新的1.5EP管中，尽量小心以避免吸取沉淀部分，并加入14µL的 5XSDS Loading Buffer，混匀，备用；
F、Western Blot：将SDS-PAGE凝胶按照常规方法制备完成后，放入电泳槽中，倒入适量的1×电泳缓冲液，拔去梳子，将步骤E准备好的样品及蛋白Marker加入到SDS-PAGE凝胶的各泳道中，用80V恒压跑胶30分钟，再用120V恒压跑胶100分钟；电泳完毕后，在200mA恒流的条件将胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，转膜2小时后，用5%的脱脂牛奶（1×TBST配制）进行室温封闭1小时，根据蛋白大小将封闭完成的膜剪成条状，在4℃条件下，一抗（ GAPDH，c-Met）孵育过夜，次日，将孵完一抗的膜置于1×TBST中，放在摇床上，洗膜3次，每次5分钟，然后室温孵育二抗（GAPDH为鼠二抗，c-Met为兔二抗）1小时，二抗孵育完成后，用1×TBST洗膜3次，每次5分钟，最后将膜浸泡于配制好的发光底物中，利用化学发光仪，调好曝光时间进行显影。
实验结果：如图2所示，为白鲜碱处理细胞裂解液的CETSA结果图，从图中可知，将细胞用反复冻融法裂解成裂解液后，用白鲜碱孵育并加热，最后通过Western Blot技术发现，白鲜碱的孵育能增加c-Met热稳定性，在50℃及56℃条件下可以明显看出加药物组c-Met的目的条带强于对照组，即白鲜碱与c-Mer发生了结合，使其在加热条件下蛋白更加稳定。
实施例3
本实施例利用细胞热转变分析（CETSA）技术检测白鲜碱与活细胞中c-Met的结合能力，具体步骤如下：
（1）A549细胞的培养及传代：同实施列2；
（2）白鲜碱与活细胞中c-Met结合的验证：
A、细胞铺板：步骤（1）A549细胞培养至对数生长期，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后离心，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液将细胞重悬液以每孔2mL的量铺于2个35mm的小皿；
B、药物处理：次日，药物组加入浓度为10mM的白鲜碱-DMSO-培养基溶液，使白鲜碱终浓度为100µM，对照组加入同含量的DMSO，37℃、5% CO2条件下孵育3小时；
C、样品加热：步骤B孵育完成后，从培养箱取出，吸除全部培养基，用磷酸缓冲盐溶液漂洗细胞一次，并用胰蛋白酶将细胞消化下来，离心后去上清液，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞沉淀以洗去多余白鲜碱，再次离心后留取细胞沉淀，加入200µL磷酸缓冲盐溶液，重悬细胞后，以36µL的量将细胞悬液分至5个PCR小管，设置PCR仪的加热温度为44℃、48℃、52℃、56℃、60℃，将PCR小管放入PCR仪，进行加热，共计3分钟；
D、反复冻融法裂解细胞：将步骤C加热完成后的PCR小管细胞悬液置于-152℃超低温冰箱，30分钟后，取出放于37℃水浴锅中，待悬液全部融化后涡旋振荡数秒，再次放入超低温冰箱（-152℃），如此循环3次，使细胞彻底裂解，裂解完成后进行高速离心以除去细胞碎片：20000×g，20分钟，4℃；
E、样品配制：从离心机中取出PCR小管，分别吸取32µL的上清液于新的1.5EP管中，尽量小心以避免吸取沉淀部分，并加入8µL 的5XSDS Loading Buffer，混匀，备用；
F、Western Blot：同实施列2中的Western Blot部分。
实验结果：如图3所示，为白鲜碱处理活细胞的CETSA结果图，从图中可知，用白鲜碱对活细胞进行3小时的孵育，能够增加c-Met热稳定性，在44℃及48℃条件下可以明显看出加药物组c-Met的目的条带强于对照组，即白鲜碱与活细胞中的c-Met发生了结合，使其在加热条件下蛋白更加稳定。
实施例4
本实施例利用细胞热转变分析（CETSA）技术检测白鲜碱的浓度对其与活细胞中c-Met结合能力的影响，具体步骤如下：
（1）A549细胞的培养及传代：同实施列2；
（2）白鲜碱浓度对其与c-Met结合能力影响的验证：
A、细胞铺板：步骤（1）A549细胞培养至对数生长期，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后离心，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，将细胞重悬液以每孔2mL的量均匀铺于一个6孔板中的4孔；
B、药物处理：次日，药物组加入浓度为10mM的白鲜碱-DMSO-培养基溶液，使其白鲜碱终浓度分别为50µM、100µM、200µM，对照组不加，白鲜碱终浓度为0µM，37℃、5% CO2条件下孵育3小时；
C、样品加热：步骤B孵育完成后，从培养箱取出，吸除全部培养基，用磷酸缓冲盐溶液漂洗细胞一次，并用胰蛋白酶将细胞消化下来，离心后去上清液，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞沉淀以洗去多余白鲜碱，再次离心后留取细胞沉淀，共收集4管细胞沉淀，分别是0µM（对照组）、50µM、100µM及200µM白鲜碱孵育细胞3小时候的样品，每管加入200µL磷酸缓冲盐溶液，重悬细胞后，以60µL的量将细胞悬液分别分至3个PCR小管，设置PCR仪的加热温度为44℃、48℃、52℃，将PCR小管放入PCR仪，进行加热，共计3分钟；
D、反复冻融法裂解细胞：将步骤C加热完成后的12管PCR小管细胞悬液置于-152℃超低温冰箱，30分钟后，取出放于37℃水浴锅中，待悬液全部融化后涡旋振荡数秒，再次放入超低温冰箱，如此循环3次，使细胞彻底裂解，裂解完成后进行高速离心以除去细胞碎片：20000×g，20分钟，4℃；
E、样品配制：从离心机中取出PCR小管，分别吸取56µL的上清液于新的1.5EP管中，尽量小心以避免吸取沉淀部分，并加入14µL 的5XSDS Loading Buffer，混匀，备用；
F、Western Blot：同实施列2中Western Blot部分。
实验结果：如图4所示，为不同浓度的白鲜碱处理细胞的CETSA结果图，从图中可知，用不同浓度的白鲜碱对活细胞进行3小时的孵育，发现药物浓度越高，其与c-Met的结合能力越强。
实施例5
本实施例利用细胞热转变分析（CETSA）技术检测细胞孵育白鲜碱的时间对其与c-Met结合能力的影响，具体步骤如下：
（1）A549细胞的培养及传代：同实施列2；
（2）白鲜碱处理时间对其与c-Met结合能力影响的验证：
A、细胞铺板：步骤（1）A549细胞培养至对数生长期，加入胰蛋白酶至细胞完全消化后离心，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，将细胞重悬液以每孔2mL的量均匀铺于一个6孔板；
B、药物处理：设置药物处理时间分别为0、0.5、1、2、3、6小时，在各个时间点向药物组加入加入浓度为10mM的白鲜碱-DMSO-培养基溶液，使其白鲜碱终浓度分别为100µM，对照组不加，白鲜碱终浓度为0µM，37℃、5% CO2条件下孵育3小时；
C、样品加热：步骤B孵育完成后，从培养箱取出，吸除全部培养基，用磷酸缓冲盐溶液漂洗细胞一次，并用胰蛋白酶将细胞消化下来，离心后去上清液，用磷酸缓冲盐溶液重悬细胞沉淀以洗去多余白鲜碱，再次离心后留取细胞沉淀，共收集6管细胞沉淀，分别是白鲜碱孵育0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时的样品，每管加入150µL磷酸缓冲盐溶液，重悬细胞后，以60µL的量将每管细胞悬液分别分至2个PCR小管；设置PCR仪的加热温度为52℃；将PCR小管放入PCR仪，进行加热，共计3分钟；
D、反复冻融法裂解细胞：将步骤C加热完成后的12管PCR小管细胞悬液置于-152℃超低温冰箱，30分钟后，取出放于37℃水浴锅中，待悬液全部融化后涡旋振荡数秒，再次放入超低温冰箱，如此循环3次，使细胞彻底裂解，裂解完成后进行高速离心以除去细胞碎片：20000×g，20分钟，4℃；
E、样品配制：从离心机中取出PCR小管，分别吸取56µL的上清液于新的1.5EP管中，尽量小心以避免吸取沉淀部分，并加入14µL的 5XSDS Loading Buffer，混匀，备用；
F、Western Blot：同实施列2中Western Blot部分。
实验结果：如图5所示，为白鲜碱处理细胞不同时间的CETSA结果图，从图中可知，白鲜碱对活细胞进行2-3小时的孵育时，其结合c-Met的能力最强，6小时的孵育使c-Met的条带变浅，这可能是由于白鲜碱的长时间作用致使c-Met发生降解。
实施例6
本实施例利用Western Blot技术检测白鲜碱对c-Met磷酸化水平及表达的影响，具体步骤如下：
（1）A549细胞的培养及传代：同实施列2；
（2）c-Met表达情况的验证：
A、细胞铺板：A549细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜1640培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于1个6孔板中，37℃、5% CO2培养24小时；
B、药物处理：将浓度为10mM的白鲜碱-DMSO-培养基溶液加入到单细胞悬液中，使悬液中白鲜碱终浓度为50µM、100µM、200µM，对照组不做处理，白鲜碱终浓度为0µM，处理细胞36小时，培养期间置于37℃、5% CO2环境下；
C、样品收集：将6孔板放置于冰水上，吸除全部培养基，加入1mL预冷的磷酸缓冲盐溶液漂洗细胞并弃去，每孔中加入200μL Ripa裂解液，冰上裂解30分钟，期间高速振荡3-5次，裂解完成后，将全部裂解物转移至新的1.5EP管中，12500rpm低温离心15分钟并吸除核酸；
D、Western Blot：一抗为GAPDH、c-Met及p-c-Met，二抗：GAPDH为鼠二抗，c-Met及p-c-Met均为兔二抗，其他操作及用品同实施例2 Western Blot部分。
实验结果：如图6所示，为c-Met磷酸化水平及表达量检测图，从图中可知，用白鲜碱对A549细胞处理36小时，能够降低c-Met的表达，即促进了c-Met的降解，同时还能抑制c-Met的磷酸化水平，可推测白鲜碱可以在c-Met的抑制剂中进行使用。