氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用 (Application of nitidine chloride in preparation of urease inhibitor ) 是由 鲁强 李彩兰 刘玫瑰 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于天然化合物应用技术领域,公开了氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用。本发明指出氯化两面针碱抑制脲酶的效果显著,且具有结构简单,安全性好等特点,具备良好的应用价值与开发前景,可作为脲酶抑制剂在植物肥料、饲料添加剂和医药领域等领域进行应用。(The invention belongs to the technical field of natural compound application, and discloses application of nitidine chloride in preparation of a urease inhibitor. The invention indicates that the nitidine chloride has obvious effect of inhibiting urease, has the characteristics of simple structure, good safety and the like, has good application value and development prospect, and can be used as a urease inhibitor to be applied in the fields of plant fertilizers, feed additives, medicines and the like.)
技术领域
本发明属于天然化合物应用技术领域，具体涉及氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用。
背景技术
脲酶，又称尿素酶或尿素酰胺水解酶，是一种广泛存在于各种生物体内和生态环境中的含Ni2+的金属酶。脲酶可催化尿素水解为氨，因此对氮的新陈代谢过程起着重要作用。然而，脲酶活性过高会使尿素的催化水解速度过快，大量地释放出氨气，从而给农业、畜牧业、环境甚至人体健康带来各种危害。在农业方面，脲酶的活性过高会使尿素的催化水解速度过快，大量地释放出氨气，严重降低各种生物的氮素利用率，并破坏土壤的pH环境，导致农业生产成本增加和农产品污染。在畜牧业方面，非蛋白氮在反刍动物瘤胃脲酶的作用下过快分解，产生过量的挥发性氨在血液中蓄积过量，容易引起动物血氨中毒，甚至导致动物死亡。此外，禽舍内氨含量过高会诱导反刍动物多种疾病的发生，还会污染空气质量。在医药领域，人体内的脲酶可将体内的代谢产物尿素再次分解后进行重吸收，从而改变人体的酸碱值平衡，升高体液与尿液的pH值，诱发泌尿系统及胃肠道感染，导致胃炎、胃溃疡、肾及尿路结石等多种疾病。
目前，针对脲酶对人类生产和生活中带来的严重危害，国内外学者研究并使用脲酶抑制剂进行预防与治疗。迄今，脲酶抑制剂被广泛应用于医药、农业和畜牧业领域，其种类主要包括重金属离子类、羟肟酸类、磷酰胺型抑制剂、磷酸盐脲酶抑制剂、金属配合物等。然而，现有的脲酶抑制剂的有效性大多受温度、时间、pH环境等因素的影响，因而现在国内较为成熟的脲酶抑制剂是乙酰氧肟酸，其具有合成简单，成本不高，毒性低的特点。但存在的主要问题为长期使用乙酰氧肟酸，会使微生物产生适应性和耐药性，从而导致乙酰氧肟酸失去效果。
因此，希望提出一种效果良好的新型脲酶抑制剂产品，以减少对乙酰氧肟酸的依赖，从而减少耐药性的发生。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用，本发明指出氯化两面针碱抑制脲酶的效果显著，且具有结构简单，安全性好等特点，具备良好的应用价值与开发前景，可作为脲酶抑制剂在植物肥料、饲料添加剂和医药领域等领域进行应用。
本发明提供了氯化两面针碱在制备脲酶抑制剂中的应用，所述氯化两面针碱的结构式如式(Ⅰ)所示：
氯化两面针碱是从芸香科花椒属植物两面针中提取分离得到的，是一种天然苯骈菲啶类生物碱，其分子式为C21H18NO4Cl，分子量为383.82，化学结构式如式(Ⅰ)所示。近年来的研究发现氯化两面针碱具有高效低毒的特点，具备抗炎、抗菌、镇痛、抗疟疾、抗肿瘤等多种药理作用。本发明率先发现，氯化两面针碱具有抑制脲酶活性的作用，因而可应用于制备脲酶抑制剂。
优选的，所述脲酶为洋刀豆脲酶。试验表明，氯化两面针碱对于洋刀豆脲酶活性具有良好的抑制效果，可与一线脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当。
本发明还提供了一种脲酶抑制剂，包括氯化两面针碱或其在药学上可接受的盐。
优选的，所述脲酶抑制剂中还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了所述脲酶抑制剂在制备动物饲料添加剂中的应用。
优选的，所述动物为反刍动物或单胃动物。
将氯化两面针碱或其在药物上可接受的盐作为动物饲料添加剂添加至饲料中，可以减慢尿素在奶牛、肉牛、肉羊以及肉鸡等反刍动物或单胃动物体内的分解速度，提高尿素的利用率，并降低禽舍和畜舍内空气中氨气含量。
本发明还提供了所述脲酶抑制剂在制备植物肥料中的应用。将所述脲酶抑制剂添加于氮肥中，可提高尿素利用率，增加农作物产量，提高生产性能。
本发明还提供所述脲酶抑制剂在医药领域的应用。所述脲酶抑制剂可避免人体体液与尿液的pH值的过度升高，减少泌尿系统和消化系统疾病的发生率，可作为抗胃炎、胃溃疡或抗尿路结石的药物得到应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明开拓了氯化两面针碱作为脲酶抑制剂在植物肥料、饲料添加剂和医药领域的新用途，丰富了现有脲酶抑制剂的可选种类，有助于减少药物的耐药性。同时，由于氯化两面针碱本身为天然药物成分，并具有高效低毒的特点，因此相较于现有脲酶抑制剂具有安全性更好和作用时间更长的优势。
附图说明
图1为氯化两面针碱与乙酰氧肟酸对脲酶的抑制活性；其中，A表示氯化两面针碱的抑制活性，B表示乙酰氧肟酸的抑制活性；
图2为氯化两面针碱对脲酶的抑制类型研究；其中，A表示氯化两面针碱抑制脲酶的Lineweaver-Burk双倒数图，B表示氯化两面针碱抑制脲酶Lineweaver-Burk双倒数图中曲线的斜率与抑制剂浓度关系图，C表示氯化两面针碱抑制脲酶Lineweaver-Burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图；
图3为氯化两面针碱与脲酶作用的反应进度曲线；其中A，B分别为在不孵育以及孵育的情况下氯化两面针碱与脲酶的反应进度曲线；
图4为含巯基化合物对氯化两面针碱抑制脲酶活性的影响，其中**为与脲酶组比较P<0.01，##为与氯化两面针碱+脲酶组比较P<0.01；
图5为无机化合物对氯化两面针碱抑制脲酶活性的影响；图中**为与脲酶组比较P<0.01，#为与氯化两面针碱+脲酶组比较P<0.05，##为与氯化两面针碱+脲酶组比较P<0.01。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
实验材料
受试药物
氯化两面针碱，购自成都瑞芬生物科技有限公司，纯度均大于98％。洋刀豆脲酶(Urease from Canavalia ensiformis，Type III，40.3U/mg)，乙酰氧肟酸，购自阿拉丁(aladdin)公司；尿素，二硫苏糖醇、半胱氨酸均购自索莱宝；谷胱甘肽购自美仑生物；氟化钠、硼酸均购自麦克林。HEPES、水杨酸钠、硝普钠、氢氧化钠、次氯酸钠、丙三醇，均购自广州化学试剂厂，均为分析纯。
受试药物的配制
分别称取适量氯化两面针碱和乙酰氧肟酸，用20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)配制成相应浓度，置于4℃避光保存，备用。
洋刀豆脲酶的配制
称取适量洋刀豆脲酶，溶于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成10U/mL的洋刀豆脲酶溶液，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用。
尿素的配制
称取尿素适量，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成150mM的尿素溶液，放于4℃冰箱中冷冻保存，备用。
Berthelot显色液的配制
A液：分别称取适量的硝普钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，配制成含9.73mM亚硝基铁氰化钠、700mM水杨酸钠的显色A液，置于4℃避光保存，备用。
B液：称取氢氧化钠9g，溶解于20mM的HEPES缓冲液(pH为7.5)中，放冷，加入12mL次氯酸钠，混匀，定容至50mL，置4℃避光保存，备用。
实施例1：氯化两面针碱对脲酶的抑制作用研究
将洋刀豆脲酶溶液和一系列浓度的受试药物溶液混匀，置37℃孵育20分钟；加入尿素溶液，室温条件下避光反应20分钟；加入Berthelot显色液避光显色10分钟，吸取200μL孵育液至96孔板上，在酶标仪上测定595nm下的OD绝对值。每个浓度平行做3次。空白样以各稀释液的溶剂代替，其余操作同上，测得OD空白。根据公式1求得相应的OD相对值。根据公式2求得残余酶活性(Residual activity，RA)，并通过GraphPad求得相应半数抑制浓度IC50。
OD相对＝OD绝对–OD空白 (公式1)
剩余酶活性(％)＝OD相对值 供试品/OD相对 空白×100％ (公式2)
如图1所示，氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶活性的半数抑制浓度(IC50)为33.2±4.8μM，与公认的一线脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当(IC50＝31.7±5.8μM)，表明氯化两面针碱抑制脲酶活性显著。
实施例2：氯化两面针碱对脲酶的抑制类型研究
取一定浓度的洋刀豆脲酶和一系列浓度的氯化两面针碱溶液(0、25、50、100μM)混匀，置37℃孵育20分钟。然后在室温下加入一系列浓度的尿素溶液(0.9375-30mM)避光反应20分钟，再根据实施例1的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。实验通过反应速度的倒数(1/V，即1/OD相对)对底物浓度的倒数(1/[urea])作Lineweaver-Burk图，最后通过L-B曲线结合公式3求得动力学参数KM、vmax，并通过L-B曲线进行二次作图求得抑制常数Ki、Kis。
结果如图2所示，由Lineweaver-Burk双倒数图可知随着氯化两面针碱浓度的变化，氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶的动力学参数KM变化不大，而vmax值随着氯化两面针碱浓度的增加而逐渐减小，由此可初步推断氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶的作用类型为非竞争性抑制类型。此外，结合氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶类型，对Lineweaver-Burk双倒数图进行二次作图可求得氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶的抑制常数Ki为18±5.1μM，Kis为10.3±2.2μM。
实施例3：氯化两面针碱抑制脲酶的动力学研究
取相同体积一系列浓度的氯化两面针碱溶液(0、25、50、100μM)以及一定浓度的洋刀豆脲酶混匀，接着在37℃培养箱孵育20min后在室温下加入等体积的尿素溶液避光反应20min(孵育系统)或者不经过培养箱孵育直接加入等体积的尿素溶液避光反应20min(不孵育系统)。然后在不同的时间间隔(0-30min)移取反应液至1.5mL离心管中，再根据实施例1的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
将上述两个反应系统求得的OD相对值代入至氨含量标准曲线，计算出相对应的氨浓度。再根据公式4对氯化两面针碱各个浓度的各试验点进行曲线拟合，判断氯化两面针碱与洋刀豆脲酶的结合的速率。
Pt＝Vs*t+(V0-Vs)*(l-e-kapp*t)*kapp -1 (公式4)
其中，P是反应开始t分钟后反应产物所累积的数量，V0和Vs分别为反应起始速率和反应平衡速率，kapp是V0和Vs之间互相转换时遵循的表观一级速率常数。
根据图3中氯化两面针碱与洋刀豆脲酶的反应进度曲线可知，氯化两面针碱与洋刀豆脲酶先快速形成脲酶-氯化两面针碱复合物EI，随后缓慢异构化为脲酶-氯化两面针碱复合物EI*。由此判断氯化两面针碱与洋刀豆脲酶的结合方式属于缓慢结合型。
实施例4：巯基化合物对脲酶活性的影响
分别取等量的洋刀豆脲酶溶液与含巯基化合物溶液(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液，浓度均为1.25mM)混匀，置37℃培养箱预孵育20分钟。再加入0.1mM氯化两面针碱溶液混匀，置37℃孵育20分钟后，加入尿素室温下反应20分钟，最后根据实施例1的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
如图4所示，当系统中含有巯基化合物(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液)时，即使是在氯化两面针碱存在的情况下，洋刀豆脲酶仍能保持较高的酶活性。结果表明氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶活性的其中一个作用位点为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
实施例5：无机化合物对脲酶活性的影响
分别取等量的洋刀豆脲酶溶液与无机化合物溶液(1.25mM硼酸或氟化钠溶液)混匀，置37℃培养箱预孵育20分钟。再加入0.1mM氯化两面针碱溶液，混匀，置37℃培养箱孵育20分钟，在室温下加入尿素反应20分钟，再根据实施例1的方法显色并测得OD绝对值并求得相应的OD相对值，并求出相应的残余酶活性RA。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
如图5所示，当系统中洋刀豆脲酶同时与氯化两面针碱及硼酸或氟化钠存在时，残余酶活性均降低，甚至低于氯化两面针碱单独与洋刀豆脲酶作用时的残余酶活性，表明硼酸或氟化钠对洋刀豆脲酶的活性无保护作用，且氯化两面针碱可能与硼酸或氟化钠协同抑制洋刀豆脲酶活性。结果进一步表明氯化两面针碱抑制洋刀豆脲酶活性的作用位点可能为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
以上实验表明，氯化两面针碱能显著抑制洋刀豆脲酶的活性，且其抑制效果与乙酰氧肟酸相当。此外，抑制类型研究表明氯化两面针碱是一种非竞争性脲酶抑制剂。进一步机理研究表明，氯化两面针碱主要与洋刀豆脲酶结构中巯基活性部位相互作用，从而抑制洋刀豆脲酶的活性。综上可知，氯化两面针碱具抗洋刀豆脲酶的作用，且作用效果明显。再结合氯化两面针碱结构简单，安全等优点，氯化两面针碱在抑制脲酶活性方面具有良好的应用价值与开发前景，是潜在的脲酶抑制剂。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：有机化合物