6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用
阅读说明：本技术 6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用 (Application of 6-methoxy dihydrosanguinarine in preparation of medicine for resisting breast cancer ) 是由 郭增军 张蕾 张卉 张新新 张富鑫 张笑颜 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用,属于生物医药技术领域。拐枣七中的苯并菲啶类生物碱即6-甲氧基二氢血根碱6-ME对乳腺癌细胞具有增殖抑制作用,能够诱导乳腺癌细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。使用一定浓度的6-ME作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,可产生增殖抑制作用以及诱导凋亡作用,因此说明6-ME有发展成为治疗乳腺癌药物的潜力。(The invention discloses application of 6-methoxy dihydrosanguinarine in preparation of a medicine for resisting breast cancer, and belongs to the technical field of biological medicines. Benzophenanthridine alkaloid (6-methoxy dihydrosanguinarine 6-ME) in Hovenia dulcis has proliferation inhibiting effect on breast cancer cells, and can induce apoptosis of breast cancer cells, thereby playing an anti-tumor role. 6-ME with a certain concentration acts on a human breast cancer cell line MDA-MB-231, and can generate proliferation inhibition effect and apoptosis induction effect, so that the potential of developing a drug for treating breast cancer by 6-ME is shown.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的苯并菲啶类生物碱的制药新用途，具体设计6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病，发病率呈逐年上升趋势，已严重威胁女性健康。虽然乳腺癌的发病率伴随着年龄的增长而增加，但通过近年来数据统计发现年轻女性的发病率逐年升高，年轻化趋势严重。目前，对乳腺癌的治疗是根据乳腺癌的生物学行为及临床分期和患者的身体情况，采用以手术为主，联合放疗、化疗和内分泌治疗的综合治疗模式。但是，手术治疗和放射治疗主要适用于局部治疗，而用于乳腺癌化疗的药物如阿霉素、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶等虽广泛应用于临床治疗，但由于毒副作用过大及多药耐药的产生限制了它们的治疗效果。随着紫杉醇、长春碱等天然来源抗肿瘤药物的的广泛应用，从天然产物中寻找具有明确作用靶点的抗肿瘤先导化合物成为了肿瘤药物开发中最具前景的方案之一。在多种抗肿瘤活性天然产物中，异喹啉生物碱-苯并菲啶类生物碱(benzo[c]phenanthridine alkaloids)备受关注，这类生物碱的母核结构有ABCD四个环，如下结构所示：
异喹啉生物碱-苯并菲啶类生物碱广泛存在于罂粟科和芸香科植物中，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎及抗菌等作用，其中抗肿瘤活性受到了广泛关注。苯并菲啶类生物碱血根碱、白屈菜红碱等对多种肿瘤(结肠癌、脑癌、卵巢癌、黑色素瘤和淋巴瘤等)显示出细胞毒活性，且能逆转多药耐药性，该类生物碱具有开发成理想的肿瘤化疗药物的可能性，因此苯并菲啶类生物碱是寻找具有抗肿瘤活性先导化合物的一个潜在成分集，可能从中发现更具优势的、高效低毒的乳腺癌治疗药物或先导化合物。
拐枣七为罂粟科(Papaveraceae)荷青花属(Hylomecon japonica)植物荷青花(Hylomecon japonica(Thunb.)Prantl)的根，又名“荷青花”、“大叶老鼠七”，是一种常用民间药，为陕西“七药”之一，具有舒筋活络，散瘀消肿，祛风除湿，止痛止血的功效，用来治疗风湿性关节炎、跌打损伤、四肢乏力、痢疾、胃脘痛等症状。
从拐枣七中分离得到的一种苯并菲啶类生物碱化合物6-甲氧基二氢血根碱(6-methoxydihydrosanguinarine，6-ME)，结构式如下：
暂时还未有关于其在乳腺癌治疗方面的相关报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的药物中的应用。
优选地，所述的药物为抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的药物。
进一步优选地，抑制抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的药物呈剂量及时间依赖性。
优选地，所述的药物为诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的药物。
进一步优选地，诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的药物呈浓度依赖性。
本发明还公开了6-甲氧基二氢血根碱在制备抗乳腺癌的化疗药物中的应用。
优选地，所述的化疗药物为能够抑制肿瘤体积增长的药物。
优选地，所述的化疗药物为能够抑制肿瘤重量增长的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
苯并菲啶类生物碱6-甲氧基二氢血根碱(6-ME)为提取自罂粟科荷青花属植物拐枣七，本研究发现拐枣七中的苯并菲啶类生物碱即6-甲氧基二氢血根碱6-ME对乳腺癌细胞具有增殖抑制作用，能够诱导乳腺癌细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。使用一定浓度的6-ME作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，可产生增殖抑制作用以及诱导凋亡作用，因此说明6-ME有发展成为治疗乳腺癌药物的潜力。
附图说明
图1为6-ME对MDA-MB-231细胞相对增殖率的影响结果图；
图2为流式细胞仪检测不同浓度6-ME作用24h后MDA-MB-231细胞凋亡率；
图3为不同浓度6-ME作用24h后MDA-MB-231细胞凋亡率统计图；
图4为实验结束时各组全鼠照片；
图5为实验结束时各组肿瘤；
图6为荷瘤鼠肿瘤体积变化曲线(n＝6)；
图7为荷瘤鼠体重变化曲线(n＝6)；
图8为实验结束时肿瘤的体积(n＝6)与对照组相比结果；其中，P<0.05*,P<0.01**；
图9为实验结束时肿瘤的重量(n＝6)与对照组相比结果；其中，P<0.01**；
图10为裸鼠肝组织HE染色(x100)；
图11为裸鼠肾组织HE染色(x100)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1采用MTT法检测6-ME的增殖抑制作用
采用MTT法对苯并菲啶类生物碱抗肿瘤活性筛选。胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，吹打成细胞悬液，细胞计数并调整其浓度。将制备好的细胞悬液接种于96孔板，每孔加入100μL，边缘孔用无菌PBS填充。将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞贴壁后加入事先配好的梯度浓度的药物。每孔100μL样品溶液，每个梯度3个复孔。5％CO2，37℃孵育48小时后，每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。之后终止培养，用移液枪小心吸弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜溶解结晶，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。每个96孔板设有阴性对照组与阳性对照组。
参见图1，结果显示，6-ME对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有显著的增殖抑制作用，呈现出显著的剂量及时间依赖性。
实施例2 Annexin v/PI双染法检测6-ME对细胞的诱导凋亡作用
将细胞接种于6孔板中，每孔约2×105/ml细胞，放入恒温箱中过夜培养，肿瘤细胞贴壁后，分别用不同浓度的药物处理细胞，分别培养24或48小时；培养结束后，把细胞培养液吸出至离心管内，无菌PBS洗一次，加入适量0.25％的胰蛋白酶消化细胞。加入培养基，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，离心5分钟；弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数，离心5分钟，收集细胞。此操作可重复两次；加入400ul 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。加入10ul PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5分钟。在30分钟内进行流式细胞仪检测。
使用Annexin-V/PI法，经流式细胞仪检测得到凋亡比率。此法可以区分正常细胞、凋亡早期细胞以及凋亡晚期和坏死细胞。结果参见图2，细胞经双染后，采用流式细胞仪检测，结果中呈现四个细胞群：即正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞。
不同浓度6-ME作用24h后MDA-MB-231细胞凋亡率统计图如图3所示，结果显示，6-ME作用MDA-MB-231细胞24h后，与Control组对比，凋亡率有显著性差异(P<0.05*,P<0.01**)，表示6-ME有诱导MDA-MB-231细胞凋亡作用，且呈浓度依赖。
实施例3 6-ME对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用研究
肿瘤细胞用含10％胎牛血清的培养液常规培养,消化并重悬细胞，每只裸鼠接种0.2mL细胞悬液，107个细胞。约2周后裸鼠右侧腋下出现直径为5mm-7mm的硬结，造模成功。进入实验，随机将裸鼠分为：模型组，低、中、高剂量组、阳性药组(阿霉素DOX)，每组六只。隔日一次腹腔注射，加药七次共计十四天。从给药当天开始，每隔2天称量并记录裸鼠体质量,并用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)及与之垂直的短径(b)，计算肿瘤体积(V＝a×b2/2)，绘制移植瘤的生长曲线。治疗结束后次日，颈椎脱臼处死裸鼠，称取瘤质量，并计算抑瘤率，取主要脏器进行HE染色，分析动物有无系统性损害。
实验结束时各组全鼠照片如图4所示，实验结束时各组肿瘤的照片如图5所示，随着6-ME剂量的增加，肿瘤体积逐渐减少。
荷瘤鼠体重变化曲线如图6和图7所示，结果显示，在加药处理后，裸鼠体重与模型组对比无显著性差异，表明6-ME对裸鼠体重无显著性影响。
实验结束时肿瘤的体积(n＝6)与对照组相比结果如图8所示，实验结束时肿瘤的重量(n＝6)与对照组相比结果如图9所示，结果显示，与模型组对比，6-ME不同剂量处理后肿瘤体积与重量均有显著性差异，综上所述，6-ME可以显著抑制乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，且中剂量6-ME组药物对肿瘤的抑制率与阳性药组基本相当，且中剂量与低剂量药物对小鼠未造成肝肾损伤，说明6-ME有发展成为乳腺癌化疗药物的潜力。
对裸鼠肝组织进行HE染色，结果如图10所示，与空白组相比，6-ME组各剂量均未对肝脏造成损伤，而DOX组细胞皱缩，表明DOX造成了一定程度的肝损伤。对裸肾脏组织进行HE染色，结果如图11所示，结果显示，与空白组相比，6-ME组各剂量未造成显著肾损伤，而DOX组肾小管空泡化，表明DOX造成了一定程度的肾损伤。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。