Syk抑制剂r406和bay-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用
阅读说明：本技术 Syk抑制剂r406和bay-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用 (Application of SYK inhibitor R406 and BAY-61-3606 in preparation of medicine for treating retinoblastoma ) 是由 金子兵 刘慧� 华梓淇 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：一种SYK抑制剂R406和BAY-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用,以人胚胎干细胞来源的体外3D人Rb模型为基础,结合转录组学、表观遗传学及蛋白组学等研究,发现了SYK在Rb肿瘤发生发展过程中的重要作用,SYK可作为Rb治疗的新靶点,其效果主要包括：抑制肿瘤细胞增殖,具体体现在SYK抑制剂作用后的肿瘤模型,根据流式细胞术结果和免疫荧光染色结果,其内Ki67阳性的细胞数要明显少于未用SYK抑制剂处理的模型,提示有增殖能力的细胞、即肿瘤细胞数量变少；促进肿瘤细胞凋亡。(An application of SYK inhibitors R406 and BAY-61-3606 in preparation of retinoblastoma therapeutic drugs is based on an in vitro 3D human Rb model derived from human embryonic stem cells, and combined with researches such as transcriptomics, epigenetics, proteomics and the like, an important role of SYK in the process of Rb tumorigenesis and development is discovered, the SYK can be used as a new target for Rb therapy, and the effects mainly comprise: inhibiting tumor cell proliferation, specifically reflecting in tumor model after SYK inhibitor action, according to flow cytometry result and immunofluorescence staining result, the number of Ki67 positive cells in the tumor model is obviously less than that of the model without SYK inhibitor treatment, which indicates that the number of cells with proliferation capacity, i.e. tumor cells, is less; promoting the apoptosis of tumor cells.)
技术领域
本发明具体涉及医学、生命科学技术领域，具体涉及一种SYK抑制剂 R406和BAY-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用。
背景技术
视网膜母细胞瘤(Rb)是婴幼儿最常见的原发于视网膜的眼内恶性肿瘤，占儿童恶性肿瘤的2％～4％，其中约95％的病例发生在5岁以前。Rb病人就诊时多处于中晚期，治疗较困难，易复发转移，严重危害患儿的视力及生命。RB1等位基因的突变或缺失是Rb发生的直接原因。RB1基因位于人类染色体 13q14.2，所编码的蛋白由928个氨基酸组成，是重要的细胞周期调控蛋白， RB1等位基因发生突变后，细胞将失去正常RB蛋白功能，细胞分化失去控制，从而形成肿瘤。
目前，国际上对Rb的治疗方法主要是全身系统化疗辅以眼动脉局部介入治疗。但这些化疗药物多为传统的广谱肿瘤细胞毒药物，存在明显弊端，如不同个体患者针对相同化疗方案的反应明显不同，部分患者会对药物过于敏感而引发显著不良反应等，还有部分患者会产生耐药性进而影响疗效等。另外，当肿瘤确诊晚，肿瘤体积过大有转移风险时，需要采取眼球摘除治疗。在我国，患者多为高风险晚期，眼球摘除术仍是一种主流的治疗方法。目前对于Rb的治疗，仍缺乏针对其病因(Rb的发生发展)的特异性治疗手段，急需寻找新的有效基因治疗靶点。
最近研究发现，利用人胚胎干细胞(hES细胞)在体外可培育出了与人眼视网膜的结构和成分都相似，结构完整、功能成熟、可感光的视网膜类器官 (Organoid)模型，并且可以在病人诱导多能干细胞分化来源的视网膜模型上开展疾病致病机理及药物筛选等研究。前期我们利用了与病人遗传背景相同的 RB1基因突变或敲除的hES细胞，在体外视网膜组织发育过程中自发形成人Rb肿瘤类器官模型，可更加真实地模拟病人肿瘤生长环境和肿瘤发生发展过程，为研究肿瘤发病机制、药物开发及治疗提供了更加可靠的模型。
脾酪氨酸激酶(SYK,spleen tyrosine kinase)是由SYK基因编码、表达于B 细胞等多种细胞的激酶。其参与介导多种膜受体的信号通路，包括CD74，Fc Receptor和integrins等。并且，SYK通路的异常与B细胞相关肿瘤、上皮细胞癌等多种肿瘤有关。在临床上，SYK抑制剂也被用于治疗B细胞相关肿瘤和多种自身免疫性疾病，如cerdulatinib、entospletinib和fostamatinib等。此外，还有R406、Piceatannol、MNS、TAK-659、BAY61-3606等常用SYK抑制剂。目前尚无SYK抑制剂可用于治疗视网膜母细胞瘤的报道。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，为治疗视网膜母细胞瘤提供新的基因靶点和药物，提高Rb治疗的有效性，为临床用药提供参考，本发明提供了一种SYK抑制剂R406和BAY-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用。
本发明采用的技术解决方案是：一种SYK抑制剂R406和BAY-61-3606在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用。
所述的视网膜母细胞瘤治疗药物中SYK抑制剂R406终浓度大于或等于 5μM。
所述的视网膜母细胞瘤治疗药物中SYK抑制剂BAY-61-3606终浓度大于或等于5μM。
所述的SYK抑制剂R406和BAY-61-3606通过降低Ki67的表达抑制肿瘤细胞的增殖。
所述的SYK抑制剂R406和BAY-61-3606通过增加Cleaved Caspase3的表达促进肿瘤细胞凋亡。
所述的SYK抑制剂R406的化学结构式为：
所述的SYK抑制剂BAY-61-3606的化学结构式为：
本发明的有益效果是：本发明提供一种SYK抑制剂R406和BAY-61-3606 在制备视网膜母细胞瘤治疗药物上的应用，利用hES细胞体外3D视网膜诱导分化得到的Rb肿瘤类器官模型，发现了SYK在Rb肿瘤发生发展中的关键作用，为治疗Rb提供了新的治疗靶点；首次发现了针对SYK靶点的抑制剂 R406和BAY61-3606能够显著抑制视网膜母细胞瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，有效治疗视网膜母细胞瘤。本发明旨在为治疗视网膜母细胞瘤提供新的基因靶点和药物，提高Rb治疗的有效性，为临床用药提供参考。
附图说明
附图1为不同天数Rb肿瘤类器官与正常视网膜类器官相比的基因差异表达情况。
附图2为基于转录组数据分析得到的肿瘤组和正常对照组有显著性差异的信号通路。
附图3为Rb肿瘤类器官组与正常视网膜类器官组全基因组甲基化差异情况。
附图4为Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中SYK基因在转录及甲基化水平的比较。
附图5为Rb肿瘤类器官组和正常视网膜类器官对照组有显著性差异变化的蛋白。
附图6为Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中Ki67和SYK染色结果。
附图7为利用Rb类器官进行药物测试的整体实验流程图。
附图8为药物处理后针对Rb肿瘤类器官中Ki67的流式细胞术检测结果。
附图9为Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中Ki67和caspase3染色情况的比较。
具体实施方式
技术方案
1、构建Rb1基因突变的hES细胞系，利用体外3D视网膜诱导分化技术获得Rb类器官模型；
2、利用转录组测序技术(RNA-Seq)检测Rb肿瘤发生及发展过程中关键基因及信号通路改变情况，具体步骤如下：
(1)体外制备不同发育时期的Rb及正常的视网膜类器官模型，分别收集不同时间点(第0天，第30天，第45天，第60天，第75天，第90天，第105天和第120天)的Rb及正常视网膜类器官样品，提取细胞总 RNA进行RNA-Seq检测；
(2)对RNA-Seq检测结果进行分析，结合前期确定的肿瘤发生关键时间段 (第60到120)，分析该时间段肿瘤组和正常组的显著性差异基因，综合分析肿瘤发生发展相关的关键信号通路。
3、检测关键差异基因在蛋白水平及甲基化水平的改变情况，具体步骤如下：
(1)细胞免疫荧光染色检测关键差异基因在蛋白水平的显著性改变；
(2)蛋白组学检测关键差异基因在蛋白水平的显著性改变；
(3)全基因组甲基化检测关键差异基因甲基化改变情况。
4、将多种SYK抑制剂和其他抗肿瘤药物分别作用于Rb肿瘤，步骤如下：
(1)将Rb类器官分为八组，每组培养至60天给药；
(2)每组分别给予临床传统治疗药物：vincristine(5nM),etoposide(0.5μM),carboplatin(10μM),topotecan(10nM),针对PI3K/AKT信号通路的抑制剂： rapamycin(10μM)，及靶向SYK的抑制剂：R406(5μM)和BAY-61-3606 (5μM)，另设DMSO作为溶剂对照；
(3)给药时间为7天，给药完成后各组团块分别继续培养。
5、收样Rb类器官，并检测药物治疗结果，步骤如下：
(3)每组Rb类器官持续培养至120天
(4)每组各挑选部分Rb类器官，固定、包埋后冰冻切片
(5)利用免疫荧光染色观察Marker的表达情况
(6)每组各挑部分Rb类器官，并将其分别消化为单细胞
(7)孵育上荧光信号后滤出单细胞，用流式细胞术分析荧光信号情况
实验材料
细胞材料
人胚胎干细胞系(H9)来自WiCell Research Institute(Madison，WI)
本试验所用药物
(1)Vincristine、Carboplatin、Rapamycin、R406购自Selleck；
(2)Etoposide、Topotecan购自J&K；
(3)BAY-61-3606购自MedChemExpress；
(4)DMSO(二甲基亚砜)购自Sigma。
酶、试剂耗材和试剂盒
(1)RB1基因突变载体及其突变hES细胞系的建立、以及Rb肿瘤模的获得等具体实验方式；
(2)细胞培养：TeSR-E8 medium(Stem cell Technologies)；Stemspan(Stem cellTechnologies)；ReproTeSR(Stem cell Technologies)；胎牛血清 (GIBCO)；Matrigel(Becton Dickinson)；0.5μM EDTA solution (GIBCO)；10μM Y-27632(Selleck)；六孔细胞培养板(Nunc)；
(3)视网膜类器官分化所用试剂材料：GMEM(Gibco)，KSR血清替代物 (Gibco)，NEAA非必需氨基酸(Gibco)，丙酮酸盐(Gibco)，β-巯基乙醇(Gibco)，青霉素(Gibco)，链霉素(Gibco)，IWR1e(Sigma)， hBMP4(Sigma)，胎牛血清(Gibco)，SAG(Sigma)，DMEM/F12(Gibco)，N2添加物(Gibco)，视黄酸，IMDM(Gibco)，Hams F12 (Gibco)，GlutaMax(Gibco)，硫代甘油(Sigma)，V-Lance Knife (ALCON SURGICAL)。
(4)Rb类器官维持培养基：DMEM/F12，含10％胎牛血清，1％N2添加物， 0.5μM视黄酸，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素；
(5)RNA提取和测序：RNeasy Mini Kit(Qiagen)；NEB Next Ultra RNA LibraryPrep Kit for Illumina(NEB)；HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumina)；
(6)DNA提取和甲基化分析：EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research)；DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)；
(7)蛋白质组学分析：2D Quant kit(GE公司)；
(8)Rb类器官固定、包埋、切片染色：Paraformaldehyde(BeyotimeBiotechnology)；NEG-50frozen section medium(Thermo Fisher Scientific)；抗Ki67抗体(Abcam)；抗Cleaved Caspase3抗体(Cell Signaling Technology)；DAPI(ThermoFisher Scientific)；抗SYK抗体 (Cell Signaling Technology)；
(9)Rb类器官消化、流式细胞术：0.25％Trypsin-EDTA,Phenol red(ThermoFisher Scientific)；Alexa Fluor 647Mouse anti-Ki-67 Clone B56(BD Biosciences)；Alexa Fluor 488Mouse anti-Oct3/4Clone 40/Oct-3(BD Biosciences)。
实验方法
RB1基因突变hES细胞的制备、验证，其体外3D视网膜诱导分化及3D 视网膜母细胞瘤的鉴定等方法，具体步骤为：(a)通过对人胚胎干细胞中人视网膜母细胞瘤RB1等位基因进行基因编辑，或将携带RB1等位基因突变Rb病人的体细胞重编程为人诱导多能干细胞，建立RB1等位基因突变或敲除的人多能干细胞系，进一步筛选及鉴定；(b)利用体外三维视网膜分化体系诱导RB1 等位基因突变或敲除的人多能干细胞分化为人视网膜母细胞瘤模型。
对比Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官，比较SYK的表达差异
RNA-seq检测与分析
(1)利用体外3D视网膜分化体系，培养不同时间点(第 0/30/45/60/75/90/105/120天)的Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官；
(2)随机挑选不同天数的类器官，用PBS清洗3遍，加入TRIzol并振荡溶解类器官，提取细胞总RNA；
(3)用Qiagen的RNeasy Mini Kit纯化RNA，并用软件NanoDrop2000检验 RNA的纯度；
(4)用Annoroad Gene Technology构建RNA文库并进行RNA测序，包括使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB)创建序列文库，和使用HiSeq PECluster Kit v4-cBot-HS(Illumina)进行文库集群化；
(5)在Illumina平台上按150bp的片段对文库进行测序；
(6)用BMLCloud进行初步的数据分析。
甲基化检测与分析
(1)挑选第120天的Rb和正常视网膜类器官类器官，并用DNeasy Blood& TissueKit(QIAGEN)提取DNA，再用软件NanoDrop2000测定DNA 含量；
(2)用1μg DNA构建WGBS(Whole-genome bisulfite sequencing)文库，包括使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research)进行DNA的重亚硫酸盐转化；
(3)利用Bismark甲基化提取法，提取出甲基化了的CpGs，并用SMART2 软件对其所在的基因进行分析。
蛋白质组学检测与分析
(1)挑选第90天的Rb和正常视网膜类器官，PBS洗涤数次；使用0.25％胰蛋白酶-EDTA将团块小心地解离成单细胞悬浮液，离心收集细胞(＞ 1x10^6)；然后进行液氮研磨、10％TCA丙酮洗涤、丙酮洗涤和风干；
(2)加入适量8M urea buffer(含5mM DTT,2mM EDTA,3μM TSA,10％ proteaseinhibitor cocktailⅢ,30mM nicotinamide)抽提蛋白，超声2次，每次3min；
(3)取3μl蛋白提取液根据2D Quant kit(GE公司)测定蛋白浓度，根据定量结果取20μg进行SDS-PAGE观察浓度测定是否准确和蛋白提取是否良好；
(4)加入终浓度2mM DTT于37℃孵育2h进行还原，加入终浓度25mM IAM室温孵育55min进行烷基化，逐滴加入1/5体积的TCA于4℃沉淀蛋白2h以上进行沉淀；
(5)丙酮洗涤：16000g，4℃，离心5min，弃上清，沉淀加入1ml-20℃预冷的丙酮洗涤3次，每次-20℃静止30min。
(6)风干：16000g，4℃，离心5min，弃去丙酮，打开管盖风干10min使残留的丙酮挥发干净。
(7)溶解：沉淀加适量0.1M TEAB重悬蛋白。
(8)酶解：根据质量比按1:20加入trypsine，37℃酶解过夜。
(9)抽干：16000g，4℃，离心5min，取上清台式真空浓缩仪抽干后暂于－ 20℃保存
(10)除盐：strata X C 18(phenomenex公司)柱除盐，台式真空浓缩仪抽干。
(11)HPLC肽段：样品分两份，一份取100μg等量混合后经HPLC预分离成18个组分后做全白蛋白组定量。
(12)MS鉴定和高级生物信息学分析：HPLC预分离后的肽段经Q Extractive(Thermo Scientific)鉴定，MS鉴定得到的数据进一步通过高级生物信息分析。
细胞免疫荧光检测SYK蛋白在Rb类器官中的表达
(1)固定包埋：挑取2-3个类器官团块DPBS洗2遍，加1mL免疫染色固定液4℃冰箱固定60min，吸去免疫染色固定液，用PBS清洗2遍，加丽春红染色液染色5min后，将团块置于包埋剂，待包埋剂完全凝固后，于-80℃冰箱储存或进行冰冻切片；
(2)冰冻切片：从-80℃取出样品，快速置于-22℃的冰冻切片机中以 12～14mm厚度进行切片，置于--80℃备用；
(3)免疫荧光染色：冰冻切片用PBS中清洗3遍，各10min，加适量4％ BSA+0.5％Triton-100混合液进行通透和封闭，室温1h，PBS清洗切片 3遍，各10min；加适量用1％BSA+0.5％Triton-100稀释的一抗(anti- SYK，anti-Ki67)，4℃孵育过夜，用PBS清洗3遍，各10min，加适量用1％BSA+0.5％Triton-100稀释的二抗，注意避光，室温1h，用PBS 清洗3遍，各10min，加适量用PBS稀释至1X1×的DAPI，避光孵育 5-10min，用PBS清洗3遍，各10min，将切片晾干，滴抗淬灭剂，盖盖玻片，激光共聚焦显微镜拍照。
Rb类器官分组与给药
(1)将Rb类器官培养至第60天，随机挑选长势相近、状态良好的等量类器官若干，分至8个10cm无黏附培养皿中；
(2)提前将8种药物按照设计浓度加入类器官维持培养基中，每种药物对应浓度如下：vincristine(5nM)，etoposide(0.5μM)，carboplatin (10μM)，topotecan(10nM)，rapamycin(10μM)，R406(5μM)， BAY-61-3606(5μM)；
(3)将配置好的含药物培养基分别加入对应组的培养皿中，将8组Rb类器官放于37℃恒温培养箱中培养7天；
(4)药物处理满7天后，更换不含药物的普通维持培养基；
(5)每7天换一次液，维持培养至第120天。
Rb类器官收样与免疫荧光染色
(1)随机挑选每组Rb类器官若干，进行固定、包埋、冷冻切片及Ki67、 CleavedCaspase3免疫荧光染色；
(2)Confocal显微镜观察。
利用Ki67抗体免疫流式分析药物作用对Rb肿瘤细胞的影响
(1)PBS洗涤类器官团块数次，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)小心地将其解离成单细胞悬浮液，1000rpm，室温离心5min，弃上清；
(2)将细胞重悬于培养基中，用PEB(含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS) 缓冲液中的抗体染色：使用Alexa Fluor 647小鼠抗Ki-67抗体，在4℃下孵育30分钟；
(3)将细胞通过100μm尼龙网过滤，通过FACSCanto II(Becton Dickinson) 流式分析荧光。
结果与分析
Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中SYK在转录水平的表达差异分析
比较不同天数的基因差异表达情况
利用RNA-seq比较不同天数的人视网膜母细胞瘤类器官(hRBOs)与正常视网膜类器官的基因表达差异，结果如图1所示，第75天后hRBOs中SYK表达量在mRNA水平较正常视网膜对照组显著升高，提示SYK与Rb肿瘤发生发展密切相关。
基于转录组数据分析肿瘤发生发展过程中关键信号通路
根据Rb类器官肿瘤组和正常视网膜类器官对照组的转录组数据分析不同天数时关键信号通路的差异是否有显著性，结果如图2所示，由SYK激活的PI3K-Akt信号通路的表达水平在第60～90天后的肿瘤组和对照组之间出现了显著差异，提示SYK及其所属信号通路在视网膜母细胞瘤的发生发展中有重要作用。
Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中SYK表观调控(甲基化修饰)水平的差异分析
通过分析全基因组甲基化情况，可以从表观调控的层次比较不同样本同一基因表达水平的差异。图3展示了Rb肿瘤类器官(hRBOs)和正常视网膜类器官 (hROs)全基因组甲基化差异，左侧的红点代表了hRBOs部分基因的甲基化水平要显著低于hROs的，而关键基因SYK也在其中。甲基化水平低者，基因表达程度高，从而该结果提示第120天hRBOs的SYK基因表达水平较同天数 hROs的更高。图4则以直观的方式展现了hRBOs和hROs在SYK基因上的甲基化差异，可以看到蓝底启动子区域hRBOs的甲基化水平显著低于hROs，这一结果也与两种类器官RNA-seq结果所反映的SYK基因表达水平向一致。
Rb肿瘤类器官和正常视网膜类器官中SYK在蛋白水平的表达差异分析
蛋白质组学可以从结果上全面地反映基因表达差异带来的影响。如图5所示，将第90天Rb肿瘤类器官和同天数正常视网膜类器官的蛋白质表达组进行对比，可以看到SYK、Ki67等蛋白在Rb肿瘤类器官的表达程度显著高于正常视网膜类器官，提示Rb肿瘤的发生发展与SYK蛋白的表达有关。此外对类器官团块进行免疫荧光染色也得到了相同的结果，如图6所示，代表肿瘤增殖的 Ki67和关键蛋白SYK在Rb类器官的表达量均显著高于正常视网膜类器官。
3.1SYK抑制剂R406和BAY-61-3606对Rb肿瘤类器官的作用效果
实验流程设计
为了证明SYK能作为视网膜母细胞瘤治疗的有效靶点，也为了发现可能用于临床治疗的新药，我们选择了R406和BAY-61-3606两种高效的SYK抑制剂，设计了如图7所示的药物试验：先将Rb肿瘤类器官培养至60天，再随机分组加药处理一周后，换回普通培养基维持培养至第120天，再将类器官团块消化为单细胞后进行荧光染色流式分析，检测Ki67阳性细胞数。
Ki67抗体免疫流式分析药物对Rb肿瘤细胞增殖的影响
在进行流式分析后，得到如图8所示结果：DMSO溶剂对照组的Ki67阳性细胞百分比较高，提示在无药物作用状态下，Rb肿瘤类器官的细胞增殖活跃；而传统药物Vincristine、Carboplatin、Etoposide、Topotecan，除了Etoposide因为个体差异反应不佳，其余三组Ki67阳性细胞水平与DMSO组相比均有显著下降，提示本发明所用的Rb类器官能真实地反映视网膜母细胞瘤对治疗药物的反应；再看本发明引入的药物R406和BAY-61-3606的作用效果，不难得出它们对Rb肿瘤细胞的增殖程度有较好的抑制作用，其效果接近甚至超过传统药物。而PI3k/Akt抑制剂Rapamycin的作用则相对弱一些，提示本发明引入的两种新药更适合视网膜母细胞瘤的治疗。
免疫荧光染色分析药物对Rb肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
此外我们还通过免疫荧光染色来探究不同药物对Rb类器官的影响，从图9 可以看到，经过DMSO处理的溶剂对照组，依然有较多Ki67蛋白的表达，提示其增殖还很活跃，而反映细胞凋亡的Caspase3蛋白却很少；其他几种药物处理的Rb类器官，其Ki67的表达均有一定程度的下降，Caspase3的表达有较大程度的提升，提示本次引入的新药R406和BAY-61-3606能够和临床传统应用的抗癌药物一样，抑制Rb肿瘤细胞的增殖、并促进其凋亡。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。