一种盐酸小檗碱与左氧氟沙星高效复合抑菌剂
阅读说明：本技术 一种盐酸小檗碱与左氧氟沙星高效复合抑菌剂 (High-efficiency composite bacteriostatic agent containing berberine hydrochloride and levofloxacin ) 是由 郭钦 彭凯 张春艳 蔡佳惠 于 2020-03-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种盐酸小檗碱与左氧氟沙星高效复合抑菌剂,属于医药领域。一种盐酸小檗碱与左氧氟沙星高效复合抑菌剂,其特征在于在抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时,以重量百分比计含有以下成分：盐酸小檗碱7.2～23.8％；左氧氟沙星0.2～3.1％；余量为无菌水。高效复合抑菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及普通金黄色葡萄球菌(SA)具有抑制作用,可在24h内杀灭96.8％的MRSA,主要作用于细胞膜与细胞壁,增强了细胞膜与细胞壁的通透性,使抗生素更易进入细胞内。本发明的高效复合抑菌剂与现有技术相比,解决了MRSA对常规抗生素的广谱耐药性,并且同时使用两种抑菌物质降低了MRSA对本产品产生耐药性的几率,减少抗生素使用量,提升杀菌效果。(The invention discloses a berberine hydrochloride and levofloxacin high-efficiency composite bacteriostatic agent, belonging to the field of medicines. The efficient composite bacteriostatic agent for the berberine hydrochloride and the levofloxacin is characterized by comprising the following components in percentage by weight when inhibiting methicillin-resistant staphylococcus aureus: 7.2-23.8% of berberine hydrochloride; 0.2-3.1% of levofloxacin; the balance being sterile water. The high-efficiency composite bacteriostatic agent has an inhibiting effect on methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) and common Staphylococcus Aureus (SA), can kill 96.8 percent of MRSA within 24 hours, mainly acts on cell membranes and cell walls, enhances the permeability of the cell membranes and the cell walls, and enables antibiotics to enter the cells more easily. Compared with the prior art, the efficient composite bacteriostatic agent solves the problem of broad-spectrum drug resistance of MRSA to conventional antibiotics, and simultaneously uses two bacteriostatic substances to reduce the probability of drug resistance of MRSA to the product, reduce the usage amount of antibiotics and improve the bactericidal effect.)
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及一种复合抑菌混合物。
背景技术
1961年首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，至使当时几乎所有抗生素无效，包括最有效的β-内酰胺类药物。自1970年以来，MRSA已经成为全世界医院内感染的主要原因，唯一对其有效的抗生素为万古霉素，但万古霉素具有耳毒性及肾毒性，不宜作为长期治疗的抗生素。然而1997年从一名日本男性婴儿脓液中分离出耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)，目前没有任何抗生素可以单独治疗VRSA的感染。
自20世纪50年代抗生素问世以来，很少使用植物衍生物作为抑菌剂，但人们对于使用植物化学物质(次生植物代谢产物)治疗微生物感染的兴趣随着1990年后细菌耐药性的增加而增加。人们普遍认为植物化学物质很大程度上与植物对微生物的防御/应激机制有关，植物化学物质的多样性可归因于进化过程中植物面临微生物、昆虫、线虫以及其他植物等众多威胁需要更多的防御机制。目前天然抗菌剂按来源分类可分为植物来源(茶多酚等)、动物来源(蜂胶、壳聚糖等)、微生物来源(溶菌酶、聚赖氨酸等)，目前国内外学者对天然物质粗提物的抑菌性进行了大量的研究。
抗生素的大规模商用已有70余年的历史，耐药菌株不断出现并且这一趋势难以避免，这给临床治疗带来新的挑战，微生物的耐药性越来越受到人们的重视。近年来，随着新型抗菌药物开发速度减缓，中草药提取物与抗生素联合抑菌得到了广泛关注。
但寻找有效的抗生素与天然产物组合、最佳配比以及探寻作用机制成为问题的关键。
发明内容
针对有效的抗生素与天然产物组合及其配比问题，本发明人经过大量实验，使用微量肉汤稀释法，从众多可抑制金黄色葡萄球菌(SA)的抗生素及天然产物中筛选出盐酸小檗碱与左氧氟沙星的组合及其最佳有效配比。
本发明提供如下技术方案：
一种盐酸小檗碱与左氧氟沙星高效复合抑菌剂，在抑制MRSA时以重量百分比计含有以下成分：盐酸小檗碱7.2～23.8％；左氧氟沙星0.2～3.1％；余量为无菌水。
本发明还涉及所述高效复合抑菌剂在抑制SA中的应用，其特征在于抑制SA时以重量百分比计含有以下成分：盐酸小檗碱7.2～23.8％；左氧氟沙星0.002～0.025％；余量为无菌水。
本发明将抗生素的高效性和天然产物的无害、不易产生耐药性的特点相结合，防止抗生素滥用，使用少量抗生素与盐酸小檗碱复配即可对MRSA及SA产生理想的抑制作用，正是符合当下减少抗生素使用、预防耐药菌株产生的趋势，在食品安全、耐药菌的防治方面具有极好的应用前景。
附图说明
图1为盐酸小檗碱及其亚抑制浓度组杀菌曲线图。
图2为盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂组杀菌曲线图。
图3为盐酸小檗碱、左氧氟沙星与复合抑菌剂组AKP含量曲线图。
图4为盐酸小檗碱、左氧氟沙星与复合抑菌剂组菌液电导率曲线图。
图5为盐酸小檗碱、左氧氟沙星与复合抑菌剂组细胞膜电位曲线图。
具体实施方式
所使用菌株、试剂均为常规市售菌株、试剂。
实施例1
盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂抑制MRSA的作用：
a细菌的培养
挑取单菌落于NB培养基中培养12h后，于平板稀释涂布，菌落计数。
b盐酸小檗碱与左氧氟沙星单独作用时最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)测定
使用二倍稀释法在96孔板上进行实验，每孔细菌终浓度为5×105CFU/mL，第一孔盐酸小檗碱终浓度：10000μg/mL；抗生素溶液第一孔浓度：128μg/mL。第十一孔中为100μL的菌液作为阴性对照，第十二孔中为100μL的NB培养基作为阳性对照。每次试验做三个平行，重复三次。将孔板放置在37℃培养箱中培养12/24h，观察结果，以无菌生长的最低浓度为MIC/MBC值。实验结果如表1所示：
表1盐酸小檗碱与左氧氟沙星对SA/MRSA单独MIC/MBC值
c复合抑菌剂抑菌作用FIC值测定
采用棋盘微量肉汤稀释法：在96孔板中每纵列终浓度从上至下依次为盐酸小檗碱MIC1/2倍至1/32倍，每横排从左至右依次为左氧氟沙星MIC的2倍至1/64倍，每孔中对应浓度的两种药物各5μL，加入90μL菌液，使菌液终浓度为5×105CFU/mL。添加阴性对照和空白对照，每次试验做三个平行，重复三次。放置于37℃培养16h后取出观察结果，以“-”表示无菌生长，以“+”表示有菌生长，以无菌生长的最低浓度计算FIC值。
抑菌浓度指数(FIC)＝MIC联合/MIC天然产物单用+MIC联合/MIC抗生素单用
判断标准：FIC≤0.5为协同作用；0.5<FIC≤1为相加作用；1<FIC≤2为无关作用；FIC>2为拮抗作用。
实验结果如表2所示：
表2盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂对MRSA的FIC
结果表明：对于MRSA的体外抑菌试验，以重量百分比计7.2％盐酸小檗碱和3.1％左氧氟沙星联用时，FIC值为0.313，具有良好的协同作用。本发明提供的盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂具有减少左氧氟沙星用量的作用，且对抑制MRSA起到协同的作用。
实施例2
盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂抑制MRSA的作用：
a细菌的培养
同实施例1。
b复合抑菌剂抑菌作用FIC值测定
同实施例1。
实验结果如表3所示：
表3盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂对MRSA的FIC
结果表明：对于MRSA的体外抑菌试验，以重量百分比计23.8％盐酸小檗碱和0.2％左氧氟沙星联用时，FIC值为0.266，具有良好的协同作用。本发明提供的盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂具有减少左氧氟沙星用量的作用，且对抑制MRSA起到协同的作用。
实施例3
盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂抑制SA的作用：
a细菌的培养
同实施例1。
b复合抑菌剂抑菌作用FIC值测定
同实施例1。
实验结果如表4所示：
表4盐酸小檗碱与左氧氟沙星联用对SA的FIC
结果表明：对于SA的体外抑菌试验，以重量百分比计7.2％盐酸小檗碱和0.002％左氧氟沙星联用时，FIC值为0.266，具有良好的协同作用。本发明提供的盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂具有减少左氧氟沙星用量的作用，且对抑制SA起到协同的作用。
实施例4
盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂抑制SA的作用：
a细菌的培养
同实施例1。
b复合抑菌剂抑菌作用FIC值测定
同实施例1。
实验结果如表5所示：
表5盐酸小檗碱与左氧氟沙星联用对SA的FIC
结果表明：对于SA的体外抑菌试验，以重量百分比计23.8％盐酸小檗碱和0.025％左氧氟沙星联用时，FIC值为0.266，具有良好的协同作用。本发明提供的盐酸小檗碱与左氧氟沙星复合抑菌剂具有减少左氧氟沙星用量的作用，且对抑制SA起到协同的作用。
实施例5
时间杀灭曲线测定：分别设置空白组、盐酸小檗碱MIC组、盐酸小檗碱1/2MIC组、盐酸小檗碱1/4MIC组、左氧氟沙星MIC组以及复合抑菌剂组，加入终浓度为1×105CFU/mL的菌悬液，在37℃下振荡培养。于0、1、2、4、6、8、24h取样，按10倍倍比稀释，分别取100μL稀释液均匀涂布于NB琼脂平板上。于37℃培养12h后进行菌落计数。以时间为横坐标，以不同时间点生长的菌落数的对数为纵坐标绘制时间杀菌曲线。
实验结果如图1、图2和表4所示：
表4盐酸小檗碱、左氧氟沙星单独与复合抑菌剂24h后抑菌效果对比
结果表明：复合抑菌剂组和盐酸小檗碱MIC组均在24h内表现出抗菌或杀菌作用，复合抑菌剂的抗菌作用在盐酸小檗碱MIC组和左氧氟沙星MIC组之间。即使浓度低于盐酸小檗碱和抗生素的MIC，复合抑菌剂也可以发挥良好的抑菌作用，效果优于单独使用盐酸小檗碱。故复合抑菌剂可以达到理想的抑菌效果并且降低抗生素的使用量，细菌对抗生素产生耐药性的几率也相应降低。
实施例6
高效复合抑菌剂对MRSA细胞壁的影响
a细菌培养
同实施例1
b碱性磷酸酶AKP的测定
在5mL NB培养基中，加入100μL培养12h的菌液，再分别加入盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂，于37℃下振荡培养。分别在0、1、2、4、6、8h取500μL样品，5000r/min离心10min，按照碱性磷酸酶试剂盒测定AKP含量。添加空白对照。
实验结果如图3所示，标准曲线方程：Y＝0.05865+0.05826X
结果表明：碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)是位于于细菌细胞膜和细胞壁之间的一种酶。AKP活性的变化是衡量细菌细胞壁损伤情况的重要指标，正常细胞的AKP无法穿透细胞壁，因此正常细胞中无法检测出AKP活性。图3显示，盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂组AKP活性与时间呈正相关，并在4h后趋于平稳，在8h时盐酸小檗碱、左氧氟沙星组和复合抑菌剂组AKP酶活性分别是对照组的14.2倍、5.7倍和10.3倍，所以盐酸小檗碱对细胞壁具有显著的破坏作用，使抗生素更易进入细胞内，是复合抑菌剂具有高效性的原因之一。
高效复合抑菌剂对MRSA细胞膜的影响
a细胞培养
同实施例1
b菌液电导率的测定
菌液培养12h后，取100μL按1:50的比例稀释，分别加入盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂溶液，于37℃下振荡培养。分别在0、1、2、4、6、8h取5mL样品，5000r/min离心10min，再取100μL上清液于离心管中，另加3.9mL无菌水稀释，使用用电导率仪测定电导率。
实验结果如图4所示，结果表明：电导率可以衡量细菌细胞膜的通透性，电导率越大，细胞膜受到的破坏越严重，因此可通过被测菌液电导率的变化率来判断细菌细胞膜的受损情况。由图4，盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂组菌液电导率变化率与时间呈正相关，并在6h后趋于平稳，在8h时盐酸小檗碱、左氧氟沙星组和复合抑菌剂组电导率变化率分别是对照组的3.4倍、1.4倍和2.7倍，故盐酸小檗碱对细胞膜的具有显著的破坏作用，其对细胞膜的破坏使抗生素更易进入细胞内，共同发挥抑菌作用。
c细胞膜电位的测定
将5g DiBAC4(3)(膜电位荧光探针)溶于963μL二甲基亚砜溶解，配制成10mmol/L的DiBAC4(3)母液为膜电位荧光探针母液，再分别称取4.766g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，7.013g NaCl，0.149g KCl，0.294g CaCl2·2H2O和0.203g MgCl2·6H2O，0.901g葡萄糖，溶于约800mL蒸馏水中，调pH至7.4，定容至1L，配制成检测用缓冲溶液。
在5mL NB培养基中，加入100μL过夜培养的菌液，再分别盐酸小檗碱、左氧氟沙星及复合抑菌剂溶液，各组分别取100μL于96孔板中，用含5μmol/L DiBAC4(3)的检测用缓冲液清洗96孔板，清洗3次。加入180μL含5μmol/L DiBAC4(3)的检测用缓冲液进行染色，于37℃孵育30min。每3min用多功能酶标仪检测其荧光强度的变化。
实验结果如图5所示，结果表明：膜电位就是细菌细胞膜内部与外部之间的电势差，膜电位可通过荧光强度的变化来推测判断细胞是否正常代谢，正常细胞的膜内电压比膜外电压小，膜电位升高表明细胞发生超极化现象，反之则表明细胞发生去极化现象。图5显示复合抑菌剂组，荧光强度与时间呈正相关，MRSA细胞产生超极化现象，增大了细胞膜的通透性，影响细胞正常代谢导致MRSA死亡。