阅读说明：本技术 一种芋软腐病菌接种方法 (Alcasia odorata soft rot germ inoculation method ) 是由 颜梅新 黄伟华 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种芋软腐病菌接种方法,属于农业技术领域,利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液,滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面,室温保湿,盖上皿盖。其中芋软腐病菌悬浮液浓度为1×10<Sup>7</Sup>个/mL,芋软腐病菌悬浮液接种量为10uL,5-10个菌株每片芋切片组织；所测试芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织,采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿。本发明接种芋软腐病菌后发病快、显著、可操作性强、致病性测试周期短,从而提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选效率,为芋软腐病菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持,具有重要意义。(The invention discloses a taro soft rot pathogen inoculation method, which belongs to the technical field of agriculture, and is characterized in that a taro soft rot pathogen suspension is sucked by a liquid transfer device, is dripped to the surface of a taro corm section tissue placed in a culture dish with the diameter of 15cm, is moisturized at room temperature, and is covered with a dish cover. Wherein the concentration of the soft rot pathogen suspension is 1 × 10 7 The inoculation amount of the soft rot germ suspension is 10uL per mL, and each slice tissue of each strain is 5-10; the tested taro bulb slice tissue is taro bulb tissue with the length of 5-10cm, the width of 5-10cm and the thickness of 1-2cm, and the water-absorbing cotton cluster is placed in a culture dish with the diameter of 15cm for moisture preservation. After the soft rot pathogen of taro is inoculated, the disease attack is quick and obvious, the operability is strong, and the pathogenicity test period is short, so that the screening efficiency of the pathogenic defect mutant of taro soft rot pathogen is improved, technical support is provided for identification of the pathogenicity-related gene of taro soft rot pathogen and mechanism research, and the method has important significance.)

一种芋软腐病菌接种方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种芋软腐病菌接种方法。

背景技术

芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]属天南星科芋属，为多年生宿根草本植物，原产于中国和印度。芋具有很高的营养价值，其球茎富含淀粉、维生素和氨基酸等营养成分，是世界各地广为栽培的蔬菜和粮食作物，也是可选的生物能源作物，许多品种还具有药用价值。我国以珠江流域种植最多，由于广西地处亚热带，气候条件非常适宜芋头种植，已成为全国芋头的主产区之一，其中以广西荔浦种植的荔浦芋尤为出名，已成为国家地理标志保护农产品。据统计，全广西芋头种植(主要为槟榔芋)20万亩，其中仅荔浦县和贺州市种植槟榔芋超过8万余亩，亩产平均达2000公斤，总产量达12万吨，年总产值超过8亿元，为两地市农村经济保稳定、促发展奠定了坚实的基础。

近几年，由于特色作物的发展和人们对芋头产品的青睐，芋头种植面积大幅度提高，出现供需两旺的势头。但在芋产区可供栽培的品种少，各地主栽品种主要是各地人工自然选择而形成的地方品种，病害发病率高，其中芋软腐病发生较为严重。据报道该病病原为Erwinia carotovota subsp.Carotovora(Jones)Bersey et al.称为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病型，属细菌。另外，由于芋软腐病的危害使得芋作物不能连栽，从而导致土地不能充分利用，种植成本提高，影响产量及市场供需，目前芋软腐病已成为阻碍芋头产业发展的重要制约因素之一。

目前芋软腐病菌致病机理研究需要大量突变体对芋进行致病性测定，需要大量的芋头进行接种。目前关于芋致病性测定的方法未见报道。为了提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选效率，广西壮族自治区农业科学院技术专家开展了芋软腐病菌接种的研究工作，形成了一种芋软腐病菌接种方法，提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选效率，促进芋头产业发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芋软腐病菌接种方法。目的是为高效筛选芋软腐病菌致病性缺陷突变体提供一种芋软腐病菌接种方法，通过采用本发明方法，接种芋软腐病菌后发病快、显著、可操作性强、缩短致病性测试周期，从而提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选效率，为芋软腐病菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。

一种芋软腐病菌接种方法，包括以下步骤：利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，室温保湿，盖上皿盖。

所述注移液器为实验室用移液器，量程为100uL。

所述芋软腐病菌悬浮液的制备，其步骤如下：

将病标样腐烂组织经无菌水悬浮后涂板于LB培养基中，于28℃培养2d；分离得到菌体，经无菌水悬浮后，稀释后涂板于LB培养基中，于28℃培养2d得到单菌落；将芋软腐病菌在LB液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养1d，获得芋软腐病菌野生型菌株悬浮液；将经Tn5转化获得的芋软腐病菌突变体菌株分别在LB液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养1d，得到芋软腐病菌突变体菌株悬浮液。

所述芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm。

所述芋软腐病菌野生型菌株悬浮液和芋软腐病菌突变体菌株悬浮液的浓度均为1×10⁷个/mL，接种量为10uL，每片芋切片组织可接种5-10个菌株。

所述采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿。

芋软腐病菌致病机理研究需要大量突变体对芋进行致病性测定，需要大量的芋头进行接种。而目前关于芋致病性测定的方法未见报道。本方法利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，室温保湿，盖上皿盖。该方法所测试芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织，采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿；芋软腐病菌悬浮液浓度为1×10⁷个/mL，芋软腐病菌悬浮液接种量为10uL，每片芋切片组织可接种5-10个菌株，提高了测试突变体数量，12h开始发病，24h发病症状明显，缩短了芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选的周期，从而提高筛选效率，致病性测定(接种)结果稳定，有效节约试验用地和资金投入。本发明接种芋软腐病菌后发病快、显著、可操作性强、致病性测试周期短，从而提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选效率，为芋软腐病菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。

该方法接种芋软腐病菌后发病快、显著、可操作性强、致病性测试周期短，提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选效率。

本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：

(1)本发明通过利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，增加芋头感染芋软腐病菌的机会；室温保湿，盖上皿盖，试验中有些突变体发病比芋软腐病菌野生型晚，接种结果比较稳定，达到芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选的效果；

(2)采用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，操作方便、成本低；芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织(一个芋头可制作5-8片该规格的切片组织)，每片芋切片组织可接种5-10个菌株，可对大量芋组织进行接种，大大提高测试突变体数量，从而提高芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选的效率。

(3)利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，室温保湿，盖上皿盖。芋软腐病菌悬浮液浓度为1×10⁷个/mL，芋软腐病菌悬浮液接种量为10uL，5-10个菌株每片芋切片组织；所测试芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织，采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿，12h开始发病，24h发病症状明显，缩短了芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选周期，即致病性测定周期，提高筛选效率，有效节约筛选时间。

(4)利用移液器吸取芋软腐病菌悬浮液，滴至放置于直径15cm培养皿的芋球茎切片组织表面，室温保湿，盖上皿盖。芋软腐病菌悬浮液浓度为1×107个/mL，芋软腐病菌悬浮液接种量为10uL，5-10个菌株每片芋切片组织；所测试芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织，采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿，提高了芋软腐病菌致病性缺陷突变体筛选效率，节约了试验用地和资金及劳动力的投入。

(5)芋软腐病菌后发病显著，且重演性好、试验周期短、可操作性强。该方法可服务于芋软腐病菌致病性缺陷突变体的筛选，为芋软腐病菌致病性相关基因鉴定及机理研究提供技术支持。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

根据本发明的一种芋软腐病菌接种方法，包括如下步骤：

芋切片组织的准备：

芋头可由市场购买，芋球茎切片组织为长5-10cm、宽5-10cm、厚度1-2cm的芋球茎组织；采用吸水的棉花团置于直径15cm培养皿中芋组织周围保湿。

芋软腐病菌悬浮液按以下操作配制：

芋软腐病菌病标样采集于广西壮族自治区农业科学院芋头栽培区的芋软腐病标本中分离获得。

将病标样腐烂组织经无菌水悬浮后涂板于LB培养基中，于28℃培养2d；分离得到菌体，经无菌水悬浮后，稀释后涂板于LB培养基中，于28℃培养2d得到单菌落；将芋软腐病菌在LB液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养1d，获得菌体悬浮液；将经Tn5转化获得的芋软腐病菌突变体菌株分别在LB液体培养基中，于28℃摇床，200rpm，培养1d，得到芋软腐病菌突变体菌株悬浮液。

移液及标记：

用移液器吸取芋软腐病菌野生型和突变体悬浮液10uL，分别注射至芋切片组织表面，用笔做好标记。

芋软腐病发病调查：

接种24h后检查发病，最早发病(出现症状)时间为24h，之后，每个24h调查1次，48h内芋软腐病发病率为90％以上。

芋软腐病野生型菌株及致病性正常的突变体菌株接种后10株有9株在24h-48h内发病，即48h内芋软腐病发病率为90％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。