阅读说明：本技术 一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用 (Method for detecting glycine content by enzyme method and application thereof ) 是由 朱虹 花强 董辉 金维荣 邓伟伟 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用,利用甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase以及乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的双酶偶联体系,测定甘氨酸的含量；本发明的酶法检测甘氨酸含量的方法克服了传统甘氨酸氧化酶偶联辣根过氧化物酶HRP方法不适用于血液环境的缺陷,创造性地通过甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase以及乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase双酶偶联的方法,将甘氨酸氧化形成乙醛酸,又通过乙醛酸的还原反应,以NADH含量的减少来快速正确表征体系中的甘氨酸含量；本发明灵敏度高,检测迅速稳定,重复性好,操作简便,成本较低,适用范围较广。(The invention relates to a method for detecting Glycine content by an enzyme method and application thereof, which utilizes a double-enzyme coupling system of Glycine Oxidase Glycine Oxidase and Glyoxylate Reductase Glycyxylate Reductase to determine the content of Glycine; the method for detecting the Glycine content by the enzyme method overcomes the defect that the traditional method for coupling Glycine Oxidase with horseradish peroxidase (HRP) is not suitable for blood environment, creatively oxidizes the Glycine to form glyoxylic acid by a double-enzyme coupling method of Glycine Oxidase Glycine Oxidase and glyoxylic acid Reductase Glycoxylate Reductase, and rapidly and correctly represents the Glycine content in a system by reducing the NADH content through the reduction reaction of the glyoxylic acid; the invention has the advantages of high sensitivity, rapid and stable detection, good repeatability, simple operation, low cost and wide application range.)

一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用

技术领域

本发明涉及酶法检测技术领域，具体说是一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用。

背景技术

目前检测甘氨酸的方法主要有液相色谱法、离子色谱法、分光光度法等。液相色谱法和离子色谱法分析灵敏度高，分离效果好，适合复杂样品的分析测定，但是液相色谱测定甘氨酸的方法中需要对样品进行柱前衍生处理，且两者仪器费用昂贵，耗时成本高，不适用于高通量样品的分析测定。

传统分光光度法来测定甘氨酸含量的检测体系主要基于甘氨酸氧化酶GlycineOxidase与辣根过氧化物酶HRP的偶联反应，通过产物过氧化氢-苯酚-4-氨基安替比林或者产物过氧化氢与OxiRed Probe的显色体系来测定甘氨酸的浓度，这两种方法具有操作简单，检测迅速的优点。但是该方法在用于检测血液样品时，HRP的酶活受到血液环境的抑制，反应无法正常进行，不能得到样品中甘氨酸含量的准确结果。这限制了甘氨酸氧化酶-辣根过氧化物酶及其试剂盒在上述样品中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种酶法检测甘氨酸含量的方法及其应用，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种酶法检测甘氨酸含量的方法，利用甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的双酶偶联体系，实现甘氨酸含量的测定；

其中甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的核苷酸序列为：

ATGAAAAGGCATTATGAAGCAGTGGTGATTGGAGGCGGAATTATCGGTTCCGCAATTGCTTATTATTTGGCAAAGGAAAACAAAAACACCGCATTGTTTGAAAGCGGAACAATGGGCGGCAGAACGACAAGTGCCGCTGCCGGAATGCTGGGCGCCCATGCCGAATGCGAGGAACGTGACGCGTTTTTTGATTTCGCCATGCACAGCCAGCGTCTGTACAAAGGTCTTGGAGAAGAGCTTTATGCATTATCCGGTGTGGATATCAGGCAGCATAACGGCGGTATGTTTAAACTTGCATTTTCTGAAGAAGATGTGCTGCAGCTGAGACAGATGGACGATTTGGACTCTGTCAGCTGGTATTCAAAAGAAGAGGTGTTAGAAAAAGAGCCGTATGCGTCTGGTGACATCTTTGGTGCATCTTTTATTCAGGATGATGTGCATGTGGAGCCTTATTTTGTTTGCAAGGCATATGTGAAAGCAGCAAAAATGCTTGGGGCGGAGATTTTTGAGCATACGCCCGTCCTGCATGTCGAACGTGACGGTGAAGCCCTGTCCATCAAGACCCCTAGCGGAGACGTATGGGCTAATCATGTTGTCGTTGCCAGCGGGGTGTGGAGCGGAATGTTTTTTAAACAGCTTGGACTGAACAATGCTTTTCTCCCTGTAAAAGGGGAGTGCCTGTCCGTTTGGAATGATGATATCCCGCTGACAAAAACGCTTTACCATGATCACTGCTATATCGTACCGAGAAAAAGCGGCAAACTGGTTGTCGGCGCGACAATGAAGCCGGGGGACTGGAGTGAAACACCGGATCTTGGCGGATTGGAATCGGTTATGAAAAAAGCAAAAACGATGCTGCCGGCTATACAGAATATGAAGGTGGATCGTTTTTGGGCGGGACTCCGGCCGGGAACAAAGGATGGAAAACCGTACATCGGCAGACATCCTGAGGACAGCCGTATTTTATTTGCGGCGGGCCATTTCAGAAATGGGATCCTGCTTGCTCCCGCAACGGGCGCTTTGATCAGTGATCTCATCATGAATAAAGAGGTCAACCAAGACTGGCTGCACGCATTCCGAATTGATCGCAAGGAGGCGGTTCAGATATGA；

甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的氨基酸序列为：

MKRHYEAVVIGGGIIGSAIAYYLAKENKNTALFESGTMGGRTTSAAAGMLGAHAECEERDAFFDFAMHSQRLYKGLGEELYALSGVDIRQHNGGMFKLAFSEEDVLQLRQMDDLDSVSWYSKEEVLEKEPYASGDIFGASFIQDDVHVEPYFVCKAYVKAAKMLGAEIFEHTPVLHVERDGEALSIKTPSGDVWANHVVVASGVWSGMFFKQLGLNNAFLPVKGECLSVWNDDIPLTKTLYHDHCYIVPRKSGKLVVGATMKPGDWSETPDLGGLESVMKKAKTMLPAIQNMKVDRFWAGLRPGTKDGKPYIGRHPEDSRILFAAGHFRNGILLAPATGALISDLIMNKEVNQDWLHAFRIDRKEAVQI；

乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的核苷酸序列为：

TCACGGCGGGGAGGATGTCAGAACATCTTTGTTGACAAGGTTCGGTGGGATTTCACCTTTGGCAAATGCTATTAGGTTCTTTGCAACCAGCTCCGCCATGCCTTCTCGTGCTTCATGAGTTGCGCTGCCTATGTGGGGAGCTAAAACAACGTTCTTCAACTTGAAAAGCTCCTCGTTATAGTAGGGTTCTTCTTCAAATACATCCAAGCCTGCTCCAGCAATCCACCCTTCTTTTAATGCTTTGATTAGGGCATTAGTATCGACAACTGCCCCTCTAGATGTGTTTATTAGGATTGCGTTGGGTTTCATAAGCTTGAGCTCCTTCTCTCCTATCATGTGGTAGGTCTCTTTGGTTAGGGGAACGTGAAGGCTTATAAAGTCGCTCTCTTTCAAAAGGGTTTCAAAATCCACATACTCTGCGCCAATCTCTTCTTCTGCTTCAGGTTTACGTGTTCTTGAGTAATAGATGATTTTCATCCCGAACCCTTTGGCTCTCTTTGCGAGGGCCTGGCCGATTCTTCCAAAGCCCACTATCCCTAAAGTCTTTCCTTTCAATCCATATCCTAGAAACATTAGAGGATGCCAGCCGACTTCGCTTTTCTTCCATTCGCCACTCCTCACAAAGGCATCAGCCTCTACAATTCTCCTCGCAACTGCTAGAAGAAGGGCAAATGCAAGGTCAGCCGTTGCATCCGTAAGGACTCCGGGAGTGTTTGTAACGTATATTCCCCTTTTTGTAGCCTCTTCTATGTCTATGTTATCATAGCCGACTGCATATTGGGCTATTATTTTTAACTTTGGAGCGTTTTCCAGTAGTTCTTTATCTACTTTGTCCGTTACAAGGGTCACTAAGGCATCAACCTCTCTGACTTTCTCTAGAAGCACTCCCCGTGGAGGTGCCTTCGGATCTTTCCAGAGTTCTATTTCATAGAATTTCTCAATCATCTTAATTCCATTTTCCGGAATTTGTCGTGTTATAAACACCTTGGGCTTCAT；

乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的氨基酸序列为：MKPKVFITRQIPENGIKMIEKFYEIELWKDPKAPPRGVLLEKVREVDALVTLVTDKVDKELLENAPKLKIIAQYAVGYDNIDIEEATKRGIYVTNTPGVLTDATADLAFALLLAVARRIVEADAFVRSGEWKKSEVGWHPLMFLGYGLKGKTLGIVGFGRIGQALAKRAKGFGMKIIYYSRTRKPEAEEEIGAEYVDFETLLKESDFISLHVPLTKETYHMIGEKELKLMKPNAILINTSRGAVVDTNALIKALKEGWIAGAGLDVFEEEPYYNEELFKLKNVVLAPHIGSATHEAREGMAELVAKNLIAFAKGEIPPNLVNKDVLTSSPP。

优选的，一种酶法检测甘氨酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的基因编码序列和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的基因和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的基因；

（2）将步骤（1）所得的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的基因和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-GO与pET28a-GR质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，16℃，诱导表达12小时，分别得到甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的蛋白和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的蛋白；

（3）分离纯化目的蛋白：将含有目的蛋白的菌液低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的蛋白和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的蛋白；

（二）双酶偶联法检测甘氨酸：

（1）配制反应混合液：

配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 μM 黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，5 mMNADH溶液，备用；配置含有甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase与乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase的双酶混合液500 μl，包含有416 μl 8.58mg/ml纯化后的GO目的蛋白和84 μl8.49mg/ml纯化后的GR目的蛋白，备用。

根据上述溶液配置反应混合液，其中每175 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至175 μl。

（2）终点法制作甘氨酸浓度标准曲线：

配置浓度在0~1.2mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应20~40分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作甘氨酸浓度标准曲线

配置浓度在0~1.2 mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟。空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2~10分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线。

（三）尿液、血液、或一般生物试样中的甘氨酸检测：

（1）尿液的处理及检测

终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应20~40分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；尿液25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。

根据尿液样本吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到尿液的甘氨酸含量。

初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应2~10分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据2~10分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到尿液的甘氨酸含量。

（2）血液的处理及检测

本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。

血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000rpm，10 min。离心后取上清进行甘氨酸含量的测定。

终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应20~40分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30μl；NADH溶液，8~10 μl；血浆或血清25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。

根据血浆或血清样本吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血液的甘氨酸含量。

初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据2~10分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的甘氨酸含量。

（3）一般生物试样的检测

终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应20~40分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；一般生物试样25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。根据一般生物试样吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到其甘氨酸含量。

初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有175μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据2~10分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的甘氨酸含量。

优选的，分离纯化目的蛋白的步骤为：

A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中。离心条件是4 ~16℃，转速是10000~12000rpm；缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase；

B.使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4~16 ℃，11000~12000rpm离心30~50min，收集上清液；

C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

D. 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4~16 ℃，5000~6000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

优选的，所述的双酶偶联法检测甘氨酸方法中的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase采用以下编码基因序列：第一，与甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有甘氨酸氧化酶活性的基因序列；第二，与甘氨酸氧化酶GlycineOxidase蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有甘氨酸氧化酶活性。

优选的，所述的双酶偶联法检测甘氨酸方法中的乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase采用以下编码基因序列：第一，与乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有乙醛酸还原酶活性的基因序列；第二，与乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有乙醛酸还原酶活性。

本发明还包括一种酶法检测甘氨酸含量的方法的应用，用于开发甘氨酸检测试剂盒。例如，根据本发明中双酶偶联法测定甘氨酸含量的原理，将按照本发明步骤制备的GO、GR，连同黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液、NADH、缓冲液（100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 μM 黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，5 mM NADH溶液）等组分置于试剂盒内，按照本发明步骤制作使用说明书即可容易地开发试剂盒。

如图1酶法检测甘氨酸含量的方法的原理示意图，甘氨酸在甘氨酸氧化酶（Glycine Oxidase，GO）的作用下转变为乙醛酸和过氧化氢；乙醛酸还原酶（GlyoxylateReductase，GR）催化乙醛酸还原成乙醇酸，同时NADH被氧化成NAD⁺，使得体系在340 nm处的吸光度减少；本发明的检测方法，除了黄素腺嘌呤二核苷酸二钠和NADH通过商品化购买外，需要制备GO和GR，根据文献报道，结合序列比对分析手段，确定GO和GR的编码基因，通过全基因合成获得目的基因，连接表达载体，转入专用于蛋白表达的大肠杆菌或其他表达宿主，实现目的蛋白的大量外源化表达和分离提纯；

其次构建含GO、GR、黄素腺嘌呤二核苷酸二钠、甘氨酸、及NADH的反应体系；优化缓冲液、pH、温度、各酶及各反应物的浓度及配比等因素对体系吸光度变化的影响，估算检测限及定量限，确定合适的甘氨酸检测范围，制作标准曲线；

最后，收集临床样本（包括血液、尿液等体液或者组织等）或一般生物样本制备样品，利用该检测体系检测甘氨酸含量；需要注意的是甘氨酸和糖尿病、脑部疾病等疾病均有相关度，检测该数值很有必要，但是该数值只是一个中间值，不能确诊某种疾病，要确诊还需要到相应的专业科室进行检查。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明的酶法检测甘氨酸含量的方法克服了传统甘氨酸氧化酶-辣根过氧化物酶方法不适用于血液环境的缺陷，创造性地通过甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase双酶偶联的方法，将甘氨酸氧化形成乙醛酸，又通过乙醛酸的还原反应，以NADH含量的减少来快速正确表征体系中的甘氨酸含量。本发明灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低，适用范围较广。

本发明的酶法检测甘氨酸含量的方法，可基于微孔板实现高通量，结合液体处理工作站可实现自动化操作，进一步降低检测成本，后期可以作为自动化生化分析配套试剂，市场前景好。

附图说明

图1为酶法检测甘氨酸含量的方法的原理示意图；

图2为终点法制作的实施例3所得的0~100 μM甘氨酸浓度下的标准曲线。

图3为初速度法制作的实施例3所得的0~100 μM甘氨酸浓度下的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。

一种酶法检测甘氨酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的基因编码序列和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的基因和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的基因；

（2）将步骤（1）所得的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的基因和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-GO与pET28a-GR质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，16℃，诱导表达12小时，分别得到甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的蛋白和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的蛋白；

（3）分离纯化目的蛋白：

A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中。离心条件是4 ~16 ℃，转速是10000~12000rpm；缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的蛋白和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的蛋白；

B.使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4~16 ℃，11000~12000rpm离心30~50min，收集上清液；

C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

D. 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4~16 ℃，5000~6000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

（二）双酶偶联法检测甘氨酸：

（1）配制反应混合液：

配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 μM 黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，5 mMNADH溶液，备用；配置含有甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase与乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase的双酶混合液500 μl，包含有416 μl 8.58mg/ml纯化后的GO目的蛋白和84 μl8.49mg/ml纯化后的GR目的蛋白，备用；

根据上述溶液配置反应混合液，其中每175 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至175 μl。

（2）终点法制作甘氨酸浓度标准曲线：

配置浓度在0~1.2mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应20~40分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10~30 μl；NADH溶液，8~10 μl；双酶混合液，10~15μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作甘氨酸浓度标准曲线

配置浓度在0~1.2 mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟。空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2~10分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线。

本发明的操作步骤全基因合成目的基因委托交给生物公司合成，本实施例的该步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司来合成；

黄素腺嘌呤二核苷酸二钠英文名为Flavin adenine dinucleotide disodium salthydrate，CAS号84366-81-4 (anhydrous)；

NADH英文名为Nicotinamide adenine dinucleotide，CAS号74927-11-0；

本发明采用的去蛋白试剂盒为Biovision。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种酶法检测甘氨酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase的基因编码序列和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase目的基因和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase目的基因；

根据文献“Mayumi K , Sumitaka H , Kazushi F , et al. Whole-GenomeSequencing and Comparative Genome Analysis of Bacillus subtilis StrainsIsolated from Non-Salted Fermented Soybean Foods[J]. PLOS ONE, 2015, 10(10):e0141369-.”报道Bacillus subtilis strain HJ0-6菌株中存在甘氨酸氧化酶GlycineOxidase（thiO），在NCBI的Gene数据库中搜索thiO即可获取基因序列；

根据文献“Ohshima T , Nunoura-Kominato N , Kudome T , et al. A novelhyperthermophilic archaeal glyoxylate reductase from Thermococcus litoralis :Characterization, gene cloning, nucleotide sequence and expression inEscherichia coli [J]. FEBS Journal, 2001, 268(17):4740-4747.”报道Thermococcus litoralis DSM 5473菌株中存在乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase，在NCBI的Gene数据库中搜索EHR79758.1即可获取基因序列；

甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase和乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase都通过全基因合成目的基因委托生物公司完成；

其中，GO蛋白的外源表达和分离纯化包括以下具体步骤：

（1）Mayumi K , Sumitaka H , Kazushi F , et al. Whole-Genome Sequencing andComparative Genome Analysis of Bacillus subtilis Strains Isolated from Non-Salted Fermented Soybean Foods[J]. PLOS ONE, 2015, 10(10):e0141369-.

上面这个文献报道Bacillus subtilis strain HJ0-6菌株中存在甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase（thiO），在NCBI的Gene数据库中搜索thiO即可获取基因序列；

（2）将thiO序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；

（3）利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的thiO，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；

（4）利用EcoRI和HindIII酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；

（5）利用SolutionI（连接酶）将步骤3和4的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2h；

（6）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；

（7）挑取5个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；

（8）将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；

（9）测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。

（10）将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600 = 0.6时，加入终浓度1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，16℃，200rpm，诱导12h；

（11）将菌液4℃、12000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中（缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；

(12)利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000rpm离心37min，收集上清液；

(13) 上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

(14) 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

其中，GR蛋白的外源表达和分离纯化包括以下具体步骤：

（1）Ohshima T , Nunoura-Kominato N , Kudome T , et al. A novelhyperthermophilic archaeal glyoxylate reductase from Thermococcus litoralis :Characterization, gene cloning, nucleotide sequence and expression inEscherichia coli [J]. FEBS Journal, 2001, 268(17):4740-4747.

上面这个文献报道Thermococcus litoralisDSM 5473菌株中存在乙醛酸还原酶Glyoxylate Reductase（Glyoxylate Reductase, EHR79758.1），在NCBI的Gene数据库中搜索EHR79758.1即可获取基因序列。

（2）将EHR79758.1序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点BamHI和EcoRI；

（3）利用BamHI和EcoRI酶切上述合成得到的GR，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；

（4）利用BamHI和EcoRI酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；

（5）利用SolutionI（连接酶）将步骤4和5的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2h；

（6）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；

（7）挑取3个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；

（8）将提取的质粒BamHI和EcoRI酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；

（9）测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。

（10）将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600＝0.6时，加入终浓度1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，16℃，200rpm，诱导12h；

（11）将菌液4℃、12000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中（缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；

(12)利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000rpm离心40min，收集上清液；

(13) 上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

(14) 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

（二）双酶偶联法检测甘氨酸：

（1）配制反应混合液：

配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 μM 黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，5 mMNADH溶液，备用；配置含有甘氨酸氧化酶Glycine Oxidase与乙醛酸还原酶GlyoxylateReductase的双酶混合液500 μl，包含有416 μl 8.58mg/ml纯化后的GO目的蛋白和84 μl8.49mg/ml纯化后的GR目的蛋白，备用；

根据上述溶液配置反应混合液，其中每175 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，10 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至175 μl。

（2）终点法制作甘氨酸浓度标准曲线：

配置浓度在0~1.2mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，10 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作甘氨酸浓度标准曲线

配置浓度在0~1.2 mM之间的一系列甘氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别滴入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟。空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以5分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线。

（三）尿液、血液、或一般生物试样中的甘氨酸检测：

（1）尿液的处理及检测

终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，10 μl；尿液25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。

根据尿液样本吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到尿液的甘氨酸含量。

初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应5分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据5分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到尿液的甘氨酸含量。

（2）血液的处理及检测

本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。

血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000rpm，10 min。离心后取上清进行甘氨酸含量的测定。

终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，10μl；血浆或血清25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。

根据血浆或血清样本吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血液的甘氨酸含量。

初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据5分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的甘氨酸含量。

（3）一般生物试样的检测

终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有175 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，10 μl；一般生物试样25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。根据一般生物试样吸光度的变化值及终点法制作的甘氨酸标准曲线计算得到其甘氨酸含量。

初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有175μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据5分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的甘氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的甘氨酸含量。

实施例2

除了每175 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；

每175 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，20 μl；NADH溶液，8 μl；双酶混合液，12 μl；超纯水补足至175 μl。

实施例3

除了每175 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；

每175 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10 μl；NADH溶液，10 μl；双酶混合液，12 μl；超纯水补足至175μl。

使用酶标仪对340nm处的吸光值进行终点法或者初速度法的检测后，以吸光度变化值为纵坐标，以甘氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制甘氨酸浓度标准曲线，通过Excel等软件绘制标准曲线，结果发现0～150 μΜ甘氨酸浓度下具有良好的线性关系，因此选择甘氨酸浓度0~150 μΜ作为主要的测量范围，如图2所示为终点法制作的0～150 μΜ甘氨酸浓度下的标准曲线，如图3所示为初速度法制作的0～150 μΜ甘氨酸浓度下的标准曲线；因此，当样品中甘氨酸浓度大于此范围时，样品要进行适当稀释。

使用实施例3所得的0～150 μM甘氨酸浓度下的标准曲线进行血浆甘氨酸浓度的测定，具体操作如下：

（1）按照医院伦理规范要求，收集42例常规体检人员的外周血；

（2）常规方法利用血浆分离胶管，分离获得血浆，置于-80℃保存；

（3）测定时，取步骤2的25 μl上清加入到96孔板（CLS3590-100EA，Corning），然后加入175 μl反应混合液（实施例3），轻轻混匀；

（4）终点法：37 ℃下反应30分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10 μl；双酶混合液，12μl；补足超纯水至200 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，100 μl；黄素腺嘌呤二核苷酸二钠水溶液，10 μl；NADH溶液，10 μl；双酶混合液，12μl；血浆，25 μl，补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。；

初速度法：37 ℃下反应5分钟，空白对照为超纯水。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化，得到5分钟内340nm处吸光度变化值.

（5）根据血液样本吸光度的变化值及终点法或初速度法制作的甘氨酸标准曲线可计算得到血液的甘氨酸含量，该部分人群甘氨酸浓度平均值为415.3±104.2 μM。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。