阅读说明：本技术 一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用 (Method for detecting branched chain amino acid content by enzyme method and application thereof ) 是由 金维荣 邓伟伟 董辉 花强 朱虹 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用,利用一种亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase,以NADH含量的增加来快速正确表征体系中支链氨基酸的含量,能够通过一次反应快速测定样品中三种支链氨基酸,即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的总含量。本发明灵敏度高,检测迅速稳定,重复性好,操作简便,成本较低,适用范围较广。(The invention relates to a method for detecting the content of branched chain amino acid by an enzyme method and application thereof. The invention has the advantages of high sensitivity, rapid and stable detection, good repeatability, simple operation, low cost and wide application range.)

一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用

技术领域

本发明涉及酶法检测技术领域，具体说是一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用。

背景技术

在18种人体所需的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的分子中都含有分支侧链，因此被统称为支链氨基酸。目前检测支链氨基酸的方法主要有液相色谱法、离子色谱法、分光光度法等。液相色谱法和离子色谱法分析灵敏度高，分离效果好，适合复杂样品的分析测定，但是液相色谱测定支链氨基酸的方法中需要对样品进行复杂的前处理或者柱前衍生处理，且两者仪器费用昂贵，耗时成本高，不适用于高通量样品的分析测定。

本发明通过酶活的比较筛选，使用一种来源于Lysinibacillus sphaericus菌株的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase，其可以同时以三种支链氨基酸为底物进行反应，通过反应体系中NADH的增加来表征支链氨基酸的总含量。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种酶法检测支链氨基酸含量的方法及其应用，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种酶法检测支链氨基酸含量的方法，利用一种亮氨酸脱氢酶LeucineDehydrogenase，实现支链氨基酸含量的测定；

其中亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的核苷酸序列为：

ATGGAAATCTTCAAGTATATGGAAAAGTATGATTATGAACAATTGGTATTTTGCCAAGACGAAGCATCTGGGTTAAAAGCGATTATCGCTATCCATGACACAACACTTGGACCAGCATTAGGTGGTGCTCGTATGTGGACCTACGCGACAGAAGAAAATGCGATTGAGGATGCATTAAGATTAGCACGCGGGATGACATATAAAAATGCAGCTGCTGGTTTAAACCTTGGCGGTGGAAAAACGGTCATTATTGGGGACCCATTTAAAGATAAAAACGAAGAAATGTTCCGTGCTTTAGGTCGTTTCATTCAAGGATTAAACGGTCGCTATATTACCGCTGAAGATGTTGGTACAACCGTAACAGATATGGATTTAATCCATGAGGAAACAAATTACGTTACAGGTATATCGCCAGCGTTTGGTTCATCGGGTAATCCTTCACCAGTAACTGCTTATGGCGTTTATCGTGGCATGAAAGCAGCGGCGAAAGAAGCATTTGGTACGGATATGCTAGAAGGTCGTACTATATCGGTACAAGGGCTAGGAAACGTAGCTTACAAGCTTTGCGAGTATTTACATAATGAAGGTGCAAAACTTGTAGTAACAGATATTAACCAAGCGGCTATTGATCGTGTTGTCAATGATTTTGGCGCTACAGCAGTTGCACCTGATGAAATCTATTCACAAGAAGTCGATATTTTCTCACCGTGTGCACTTGGCGCAATTTTAAATGACGAAACGATTCCGCAATTAAAAGCAAAAGTTATTGCTGGTTCTGCTAATAACCAACTACAAGATTCACGACATGGAGATTATTTACACGAGCTAGGCATTGTTTATGCACCTGACTATGTCATTAATGCAGGTGGTGTAATAAATGTCGCGGACGAATTATATGGCTATAATCGTGAACGAGCGTTGAAACGTGTAGATGGTATTTACGATAGTATTGAAAAAATCTTTGAAATTTCCAAACGTGATAGTATTCCAACATATGTTGCGGCAAATCGTTTGGCAGAAGAACGTATTGCTCGTGTAGCGAAATCGCGTAGTCAGTTCTTAAAAAATGAAAAAAATATTTTGAACGGCCGTTAA；

亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的氨基酸序列为：

MEIFKYMEKYDYEQLVFCQDEASGLKAIIAIHDTTLGPALGGARMWTYATEENAIEDALRLARGMTYKNAAAGLNLGGGKTVIIGDPFKDKNEEMFRALGRFIQGLNGRYITAEDVGTTVTDMDLIHEETNYVTGISPAFGSSGNPSPVTAYGVYRGMKAAAKEAFGTDMLEGRTISVQGLGNVAYKLCEYLHNEGAKLVVTDINQAAIDRVVNDFGATAVAPDEIYSQEVDIFSPCALGAILNDETIPQLKAKVIAGSANNQLQDSRHGDYLHELGIVYAPDYVINAGGVINVADELYGYNRERALKRVDGIYDSIEKIFEISKRDSIPTYVAANRLAEERIARVAKSRSQFLKNEKNILNGR；

优选的，一种酶法检测支链氨基酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因；

（2）将步骤（1）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-LeuDH质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，16℃，诱导表达12小时，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

（3）分离纯化目的蛋白：将含有目的蛋白的菌液低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白为步骤（2）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

（二）酶法检测支链氨基酸：

（1）配制反应混合液：

配制200 mM Glycine-KCl-KOH缓冲溶液（pH 10.5），40 mM NAD⁺水溶液，备用；配制含有亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase工作酶液500 μl，包含有150 μl 0.5mg/ml纯化浓缩后的Leucine Dehydrogenase目的蛋白，再加入350 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。

根据上述溶液配制反应混合液，其中每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），10~30 μl；酶液，5~10 μl；补足超纯水至190 μl。

（2）终点法制作支链氨基酸浓度标准曲线：

配制浓度在0~4mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作支链氨基酸浓度标准曲线

配制浓度在0~4 mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340nm处吸光值的变化。以2~10分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线。

（三）尿液、血液、或一般生物试样中的支链氨基酸检测：

（1）尿液的处理及检测

终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据尿液样本反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。

根据2~10分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

（2）血液的处理及检测

本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。

血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000rpm，10 min。离心后取上清进行支链氨基酸含量的测定。

终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据血浆或血清样本反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血液的支链氨基酸含量。

初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30μl；补足超纯水至200 μl。

根据2~10分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

（3）一般生物试样的检测

终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据一般生物试样反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到其支链氨基酸含量。

初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据2~10分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

优选的，分离纯化目的蛋白的步骤为：

A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中。离心条件是4~16 ℃，转速是10000~12000rpm；缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白为步骤（2）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

B.使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4~16 ℃，11000~12000rpm离心30~50min，收集上清液；

C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

D. 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4~16 ℃，5000~6000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

所述的酶法检测支链氨基酸方法中的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase采用以下编码基因序列：第一，与亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有亮氨酸脱氢酶活性的基因序列；第二，与亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有亮氨酸脱氢酶活性。

本发明还包括一种酶法检测支链氨基酸含量的方法的应用，用于开发支链氨基酸检测试剂盒。例如，根据本发明中酶法测定支链氨基酸含量的原理，将按照本发明步骤制备的Leucine Dehydrogenase，连同NAD⁺、缓冲液（200 mM Glycine-KCl-KOH缓冲溶液（pH10.5），40 mM NAD⁺水溶液）等组分置于试剂盒内，按照本发明步骤制作使用说明书即可容易地开发试剂盒。

如图1酶法检测支链氨基酸含量的方法的原理示意图，支链氨基酸在亮氨酸脱氢酶（Leucine Dehydrogenase，LeuDH）的作用下转变为相应的酮酸，同时NAD⁺被还原成NADH，使得体系在340 nm处的吸光度增加；本发明的检测方法，除了NAD⁺通过商品化购买外，需要制备亮氨酸脱氢酶，根据文献报道，结合序列比对分析手段以及多种不同来源的亮氨酸脱氢酶的酶活比较，确定最适用的亮氨酸脱氢酶的编码基因，通过全基因合成获得目的基因，连接表达载体，转入专用于蛋白表达的大肠杆菌或其他表达宿主，实现目的蛋白的大量外源化表达和分离提纯；

其次构建含亮氨酸脱氢酶、支链氨基酸及NAD⁺的反应体系；优化缓冲液、pH、温度、酶及各反应物的浓度及配比等因素对体系吸光度变化的影响，估算检测限及定量限，确定合适的支链氨基酸检测范围，制作标准曲线；

最后，收集临床样本（包括血液、尿液等体液或者组织等）或一般生物样本制备样品，利用该检测体系检测支链氨基酸含量；需要注意的是支链氨基酸和糖尿病等代谢疾病均有相关度，检测该数值很有必要，但是该数值只是一个中间值，不能确诊某种疾病，要确诊还需要到相应的专业科室进行检查。

本发明还包括一种酶法检测支链氨基酸含量的方法的应用，用于开发支链氨基酸检测试剂盒。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明的酶法检测支链氨基酸含量的方法克服了传统色谱检测法样品处理复杂、不适用于高通量检测的缺陷，创造性地通过使用一种亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase来同时与三种支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）反应，使用终点法或者更为快捷的初速度法来测定三种支链氨基酸的总含量。本发明灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低，适用范围较广。

本发明的酶法检测支链氨基酸含量的方法，可基于微孔板实现高通量，结合液体处理工作站可实现自动化操作，进一步降低检测成本，后期可以作为自动化生化分析配套试剂，市场前景好。

附图说明

图1为酶法检测三种支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）含量的方法的原理示意图。

图2为终点法制作的实施例3所得的0~200 μM支链氨基酸浓度下的标准曲线。

图3为初速度法制作的实施例3所得的0~200 μM支链氨基酸浓度下的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。

一种酶法检测支链氨基酸含量的方法，利用亮氨酸脱氢酶LeucineDehydrogenase，实现支链氨基酸含量的测定；

一种酶法检测支链氨基酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因；在NCBI的Protein数据库中搜索来源于Lysinibacillus sphaericus菌株的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase即可获取基因序列；

亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase通过全基因合成目的基因委托生物公司完成；

（2）将步骤（1）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-LeuDH质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，16℃，诱导表达12小时，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

（3）分离纯化目的蛋白：低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白为步骤（2）所得的亮氨酸脱氢酶LeucineDehydrogenase目的蛋白；

（二）酶法检测支链氨基酸：

（1）配制反应混合液：

配制200 mM Glycine-KCl-KOH缓冲溶液（pH 10.5），40 mM NAD⁺水溶液，备用；配制含有亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase工作酶液500 μl，包含有150 μl 0.5mg/ml纯化浓缩后的Leucine Dehydrogenase目的蛋白，再加入350 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。

根据上述溶液配制反应混合液，其中每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），10~30 μl；酶液，5~10 μl；补足超纯水至190 μl。

（2）终点法制作支链氨基酸浓度标准曲线：

配制浓度在0~4mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作支链氨基酸浓度标准曲线

配制浓度在0~4 mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340nm处吸光值的变化。以5分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线。

（三）尿液、血液、或一般生物试样中的支链氨基酸检测：

（1）尿液的处理及检测

终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据尿液样本反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40 ℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。

根据2~10分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

（3）血液的处理及检测

本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。

血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000rpm，10 min。离心后取上清进行支链氨基酸含量的测定。

终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据血浆或血清样本反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血液的支链氨基酸含量。

初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30μl；补足超纯水至200 μl。

根据2~10分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

（3）一般生物试样的检测

终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应15~30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据一般生物试样反应后的吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到其支链氨基酸含量。

初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30~40℃下反应2~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液，100 μl；NAD⁺水溶液，10~30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据2~10分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

本发明的操作步骤全基因合成目的基因委托交给生物公司合成，本实施例的该步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司来合成；

NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，英文名为β-Nicotinamide adenine dinucleotidehydrate，CAS号53-84-9；

本发明采用的去蛋白试剂盒为Biovision。

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种酶法检测支链氨基酸含量的方法，包括以下步骤：

（一）蛋白的外源表达及分离纯化：

（1）结合序列比对分析手段，选择亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase的基因编码序列，然后通过全基因合成目的基因的方法，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因；在NCBI的Protein数据库中搜索来源于Lysinibacillus sphaericus菌株的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase即可获取基因序列；

亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase通过全基因合成目的基因委托生物公司完成；

（2）将步骤（1）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的基因采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-LeuDH质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，16℃，诱导表达12小时，得到亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

（3）分离纯化目的蛋白：低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白为步骤（2）所得的亮氨酸脱氢酶LeucineDehydrogenase目的蛋白；

分离纯化目的蛋白的步骤为：

A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中。离心条件是4 ℃，转速是11000rpm；缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白为步骤（2）所得的亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase目的蛋白；

B.使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，12000rpm离心37min，收集上清液；

C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20mM~500 mM；

D. 将500mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000rpm进行蛋白浓缩，浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

（二）酶法检测支链氨基酸：

（1）配制反应混合液：

配制200 mM Glycine-KCl-KOH缓冲溶液（pH 10.5），40 mM NAD⁺水溶液，备用；配制含有亮氨酸脱氢酶Leucine Dehydrogenase工作酶液500 μl，包含有150 μl 0.5mg/ml纯化浓缩后的Leucine Dehydrogenase目的蛋白，再加入350 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9；

根据上述溶液配制反应混合液，其中每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；酶液，5 μl；补足超纯水至190 μl。

（2）终点法制作支链氨基酸浓度标准曲线：

配制浓度在0~4mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线；

（3）初速度法制作支链氨基酸浓度标准曲线

配制浓度在0~0.4 mM之间的一系列支链氨基酸标准品溶液(摩尔比亮氨酸：异亮氨酸：缬氨酸=1：1：1)，每个浓度分别取10 μl并分别滴入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以5分钟内340nm处吸光度变化值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线。

（三）尿液、血液、或一般生物试样中的支链氨基酸检测：

（1）尿液的处理及检测

终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据尿液样本吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取10 μl的尿液加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据5分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到尿液的支链氨基酸含量。

（2）血液的处理及检测

本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。

血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000rpm，10 min。离心后取上清进行支链氨基酸含量的测定。

终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值。

根据血浆或血清样本吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血液的支链氨基酸含量。

初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取10 μl的血浆或血清加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340nm处吸光值的变化。

根据5分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

（3）一般生物试样的检测

终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应30分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340nm处吸光值。

根据一般生物试样吸光值及终点法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到其支链氨基酸含量。

初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取10 μl的生物试样加入装有190μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），30 μl；补足超纯水至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。

根据5分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的支链氨基酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的支链氨基酸含量。

实施例2

除了每190 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；

每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），15 μl；酶液，10 μl；超纯水补足至190 μl。

实施例3

除了每190 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；

每190 μl的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），20 μl；酶液，10 μl；超纯水补足至190 μl。

使用酶标仪对340nm处的吸光值进行终点法或者初速度法的检测后，以吸光度变化值为纵坐标，以支链氨基酸标准品溶液浓度为横坐标绘制支链氨基酸浓度标准曲线，通过Excel等软件绘制标准曲线，结果发现0～200 μΜ支链氨基酸浓度下具有良好的线性关系，因此选择支链氨基酸浓度0~200 μΜ作为主要的测量范围，如图2所示为终点法制作的0～200 μΜ支链氨基酸浓度下的标准曲线，如图3所示为初速度法制作的0～200 μΜ支链氨基酸浓度下的标准曲线；因此，当样品中支链氨基酸浓度大于此范围时，样品要进行适当稀释。

使用实施例3所得的0～200 μM 支链氨基酸浓度下的标准曲线进行血浆支链氨基酸浓度的测定，具体操作如下：

（1）按照医院伦理规范要求，收集42例常规体检人员的外周血；

（2）常规方法利用血浆分离胶管，分离获得血浆，置于-80℃保存；

（3）测定时，取步骤2的10 μl上清加入到96孔板（CLS3590-100EA，Corning），然后加入190 μl反应混合液（实施例3），轻轻混匀；

（4）终点法：37 ℃下反应30分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），20 μl；超纯水补足至200 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值；

初速度法：37 ℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：Glycine-KCl-KOH缓冲液（0.2 M，pH10.5），100 μl；NAD⁺即β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(40mM），20 μl；超纯水补足至200 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化，得到5分钟内340nm处吸光度变化值.

（5）根据血液样本吸光度的变化值及终点法或初速度法制作的支链氨基酸标准曲线可计算得到血液的支链氨基酸含量，该部分人群支链氨基酸浓度平均值为492.9±106.1 μM。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。