一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法
阅读说明：本技术 一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法 (Method for rapidly evaluating influence degree of organic acid level on alcohol metabolism of Maotai-flavor liquor ) 是由 卢君 皇甫洁 李长文 王德良 韩兴林 陈杉彬 于 2020-12-11 设计创作，主要内容包括：本申请公开了酿造技术领域的一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法,包括以下步骤：步骤一、制备混合液；步骤二、混合液加入5μL的0.0075mg/μL乙醇脱氢酶液,孵育后使用光谱仪在波长340nm条件下测定其吸光值得到△A测定管；步骤三、乙醇脱氢酶活性定义：在25℃下,每1mL酸溶液每1min氧化1μmol辅酶Ⅰ生成1μmol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需的酶量为1个酶活单位,得到以下计算公式：ADH(μmol/min/mL)＝[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反应总体积×10～6]÷V样品加样量÷T；步骤四、根据上述公式分析不同有机酸在不同浓度下乙醇脱氢酶活性。本申请通过上述公式计算不同种类有机酸在不同浓度下乙醇脱氢酶活性,能够评价有机酸对饮后酒精代谢影响程度。(The application discloses a method for rapidly evaluating influence degree of organic acid level on alcohol metabolism of Maotai-flavor liquor in the technical field of brewing, which comprises the following steps: step one, preparing a mixed solution; step two, adding 5 mu L of 0.0075 mg/mu L of ethanol dehydrogenase into the mixed solution, and measuring the light absorption value of the mixed solution by using a spectrometer under the condition of the wavelength of 340nm after incubation to obtain a delta A measuring tube; step three, defining the activity of alcohol dehydrogenase: at 25 ℃, the enzyme amount required for oxidizing 1 mu mol of coenzyme I to generate 1 mu mol of reduced nicotinamide adenine dinucleotide per 1mL of acid solution per 1min is 1 enzyme activity unit, and the following calculation formula is obtained: ADH (μmol/min/mL) [ (. DELTA.A assay tube-. DELTA.A blank tube) ÷ ε ÷ dxV reaction total volume × 10 6 ]V sample adding amount and T; and step four, analyzing the activity of the ethanol dehydrogenase of different organic acids under different concentrations according to the formula. The method calculates different organic acids at different concentrations through the formulaThe alcohol dehydrogenase activity can evaluate the influence degree of organic acid on alcohol metabolism after drinking.)
技术领域
本发明涉及酿造技术领域，具体涉及一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法。
背景技术
酒精吸收后会进入血液中，通过血液大部分进入肝脏，肝脏能够分解约有90％左右的酒精，约有10％左右的酒精由肠道、膀胱和呼吸排出体外。酒精在肝脏的分解代谢主要依靠两种酶，分别是乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。其中乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是参与酒精在体内代谢的第一个关键酶，ADH可以减少机体对酒精的生物利用度，缓解酒精对肝脏、脑等器官的毒害作用，防止酒精性肝病的发生。如何有效预防醉酒、宿醉后减轻醉酒症状、早醒酒、早解毒是重要的健康问题，因此，提高ADH的活性，加速酒精代谢，可以降低饮酒对机体特别是对肝脏的毒害作用。研究表明白酒中的微量成分同酒精的协同增效可以对人体这两种酒精代谢相关酶的活性产生不同程度的激活或是抑制，进而影响到酒精的代谢水平。
酱香型白酒是以高粱、小麦、水等为原料，经传统固态法发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香呈味成色物质，具有酱香风格的酒。酱香型白酒的总酸含量以及有机酸的种类较其他类型的白酒更为突出和丰富。酸在酒中有呈香和呈味的双重功效，同时又能起到调味解暴的作用，还是生成酯类的前驱物质，是酱香型白酒不可缺少的微量物质。近几年来，有研究认为，酱香型白酒具有饮用后对人体刺激小，具有调节肠道菌群平衡，降低酒精代谢的负面影响，降低酒精诱导的肝损伤的作用，其原因之一是酱香白酒中微量成分种类含量丰富，其中的酸类物质具有对脾胃、肝脏、软化血管的调节功效。
随着社会的发展，当前的酒类行业市场竞争已成为综合性能力竞争，依靠其技术能力、产品特性、品质水平及顾客满意度等综合因素决定。产品是否能为顾客带来愉悦感、舒适度等都是以技术能力作保障。白酒是典型“以质定价”的产品，酒体设计是保证和提高白酒质量非常关键的环节。目前行业上对于酒体设计程序是市场调研、技术调查、质量分析、新产品构思。其中质量分析是最为关键的一环，需要通过对本厂的产品和其他产品进行感官、生理和理化分析比较，找出质量上的差距和原因。目前，尽管有一些公开发表的研究方法可以检测评价不同白酒的酒精代谢程度，但是这些方法主要依靠于人体实验和动物实验，受生物样本个体差异的影响，实验成本较高，不利于企业进行快速酒体评价。因此，本申请提供一种更为简单有效且快速的评价白酒中微量物质水平对饮后酒精代谢和醉酒影响程度的方法，用于酒体设计需要，是非常迎合酿造技术领域需求的。
发明内容
本发明意在提供一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法，通过分析乙醇脱氢酶的活性变化水平，能够快速且简单有效评价白酒中有机酸水平对饮后酒精代谢和醉酒的影响程度。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、依次向96孔酶标板加入150μL的100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)、20μL的24mmol/L辅酶Ⅰ、20μL的酒样和5μL的有机酸，然后使用双蒸水补充至195μL得到混合液；
步骤二、混合液加入5μL的0.0075mg/μL乙醇脱氢酶液，然后放入25℃的保温箱中孵育5min，随后使用光谱仪在波长340nm条件下测定其吸光值得到△A测定管，并且在此条件下测定96孔酶标板空白孔的吸光值得到△A空白管；
步骤三、乙醇脱氢酶活性定义：在25℃下，每1mL酸溶液每1min氧化1μmol辅酶Ⅰ生成1μmol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需的酶量为1个酶活单位，根据上述定义，得到以下计算公式：
ADH(μmol/min/mL)＝[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反应总体积×106]÷V样品加样量÷T，其中：ε为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm、d为酶标板光径0.5cm、V反总为反应体系总体积200uL、V样为加入反应体系中酸液体积5uL、T为反应时间5min；
步骤四、根据上述公式分析不同有机酸在不同浓度下乙醇脱氢酶活性。
本发明工作原理及有益效果：本申请通过上述公式计算不同种类有机酸在不同浓度下乙醇脱氢酶活性，通过对乙醇脱氢酶活性的判断，能够快速且简单有效评价白酒中有机酸水平对饮后酒精代谢和醉酒的影响程度。
进一步，所述有机酸的浓度范围为0ppm～4000ppm。
进一步，所述有机酸包括但不限于乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、异丁酸、正丁酸、丙酮酸异戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、氯离子、己酸、硝酸根、苹果酸、酒石酸、硫酸根、草酸、富马酸、磷酸、柠檬酸。
进一步，所述酒样包括食用酒精标准溶液。
进一步，所述食用酒精标准溶液的制备方法，用精馏和活性炭去除俄罗斯伏特加原酒中所有微量成分，只保留乙醇和水，再与超纯水配制成各种酒精度的溶液。
进一步，所述步骤二乙醇脱氢酶酶液在加入前需室温放置30min。
一种速评价有机酸水平对酱香型白酒酒精代谢影响程度的方法在评价酱香酒酒精代谢或醉酒的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1的结果示意图；
图2为本发明实施例2的结果示意图；
图3为本发明实施例2的结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1，步骤一：在96孔酶标孔板中进行乙醇脱氢酶(ADH)酶活性测定底物混合液的制备，将96孔酶标板分为4组，每组为11个孔，分别向不同孔均添加下列试剂150μL的100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)，20μL的24mmol/L NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称辅酶Ⅰ)，20μL白酒酒样。
按照每个组别的不同，每组的白酒酒样分别为：20uL某酱香型白酒酒样1#(初始酒精度为53％alc/vol，终浓度为100mM)，20μL的某酱香型白酒酒样2#(初始酒精度为53％alc/vol，终浓度为100mM)，20μL的某酱香型白酒酒样3#(初始酒精度为53％alc/vol，终浓度为100mM)，53％alc/vol的食用酒精标准溶液。每组的11个孔分别添加5μL浓度分别为0ppm、200ppm、400ppm、800ppm、1200ppm、1600ppm、2000ppm、2500ppm、3000ppm、3500ppm、4000ppm的乳酸，用ddH2O(双蒸水)补充每个孔的总反应体系至195μL。
步骤二：将酶标仪提前预热30min，提前取出乙醇脱氢酶(ADH)酶液室温放置30min，保证酶活力的最适状态。将96孔酶标板放置于25℃保温箱中孵育5min，以确保反应开始时混合液即达到所需温度。
步骤三：将5μL 0.0075mg/μL乙醇脱氢酶(ADH)分别加入到每个孔的混合液中，再将96孔酶标板放置于25℃保温箱中孵育5min后终止反应，立即用分光光度计(光谱仪)在波长340nm的条件下测定其吸光值得到△A测定管，并且在此条件下测定96孔酶标板空白孔的吸光值得到△A空白管；
步骤四：由于乙醇脱氢酶(ADH)可以催化酒精脱氢反应生成乙醛，在酒精转化为乙醛的同时，辅酶Ⅰ(辅酶NAD+)转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在波长340nm有最大紫外吸收峰。所以，将乙醇脱氢酶的活性定义为：在25℃下，每1mL酸溶液每1min氧化1μmol辅酶Ⅰ生成1μmol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需的酶量为1个酶活单位。
依据ADH酶活定义与计算公式分别进行计算，ADH(μmol/min/mL)＝[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反应总体积×106]÷V样品加样量÷T，其中ε为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm、d为酶标板光径0.5cm、V反总为反应体系总体积200uL、T为反应时间5min。
步骤五：结果分析：通过比较ADH酶活性变化，分析评价乳酸不同浓度水平对酱香型白酒酒样1#、2#、3#的酒精代谢程度的影响，并分析评价酒样1#、2#、3#在同一浓度乳酸作用下的醉酒程度，结果见附图1。
结果表明：酒样1#、酒样2#、酒样3#相对而言，对ADH酶活性影响具有显著差异，且均不同程度高于食用酒精中的ADH酶活性；相对于食用酒精，酒样1#，2#和3#可以显著提高ADH酶的活性，提高酒精代谢能力，降低醉酒程度；当提升酒体中乳酸的含量达到(200ppm-800ppm)时，酒样1#、酒样2#对ADH酶活性的变化影响不显著；提升酒体中乳酸的含量达到(1000ppm-2000ppm)时，酒样1#相对于酒样2#可以显著提高ADH酶活性；提升酒体中乳酸的含量达到(200ppm-3500ppm)时，酒样3#可以显著提高ADH酶活性。
实施例2
步骤一：在96孔酶标孔板中进行乙醇脱氢酶(ADH)酶活性测定底物混合液的制备，向12个孔中均分别加入：150μL的100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)，20μL的24mmol/LNAD+，20μL的某酱香型白酒酒样(酒样初始酒精度为53％alc/vol，终浓度为100mM，12个孔均分别加入5uL的有机酸，按照加入有机酸种类的不同分为三组，有机酸种类为乳酸、乙酸、己酸，其中一个组的4个孔分别加入浓度0ppm、500ppm、1000ppm、1500ppm的乳酸，另外一个组4个孔分别加入浓度0ppm、500ppm、1000ppm、1500ppm的乙酸，最后一个组的4个孔分别加入浓度0ppm、500ppm、1000ppm、1500ppm的己酸；然后使用ddH2O(双蒸水)将每个孔的总反应体系补充至195μL。
步骤二：将酶标仪提前预热30min，提前取出乙醇脱氢酶(ADH)酶液室温放置30min，保证酶活力的最适状态。将96孔酶标板放置于25℃保温箱中孵育5min，以确保反应开始时混合液即达到所需温度；
步骤三：将5μL 0.0075mg/μL ADH酶液分别加入到每个孔的混合液中，再将含96孔酶标板放置于25℃保温箱中孵育5min后终止反应，立即用分光光度计(光谱仪)在波长340nm的条件下测定其吸光值得到△A测定管，并且在此条件下测定96孔酶标板空白孔的吸光值得到△A空白管；
步骤四：根据吸光值，依据所述ADH酶活定义与计算公式，计算ADH酶活。
步骤五：结果分析：通过比较ADH酶活性变化，分析评价不同类型的有机酸水平对某酱香型白酒酒样酒精代谢程度的影响，分析评价该酒样在同一浓度不同类型有机酸作用下的醉酒程度(附图2，附图3)。
结果表明：提升酒体乳酸、乙酸、己酸的含量，均可以显著提高ADH酶活性，提高酒精代谢能力，降低醉酒程度；但是这3种类型的有机酸在提升ADH酶活性的能力上差异不显著。
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